Introduction
Несмотря на замечательные способности к регенерации гепатоцитов 1, которые являются основным типом клеток паренхимы печени, хронической печеночной недостаточности снижает эту способность, что приводит к печеночной клеток - предшественников (HPC) , зависящему регенерации 2.
Хроническое повреждение печени в основном происходит от злоупотребления алкоголем, хронического вируса гепатита С (ВГС) инфекции 3 и безалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) 4. Это приводит к устойчивому фиброза печени, что связано с накоплением внеклеточного матрикса (ECM) белков. Упорно накопление ECM искажает неповрежденную печеночную архитектуру путем формирования фиброзной рубцовой ткани 5, впоследствии приводит к циррозу печени с высокой заболеваемостью и смертностью. Много попыток было сделано , чтобы смягчить фиброзную реакцию , главным образом, сосредоточив внимание на ингибировании профиброгенных цитокины и активированные миофибробласты 6. Последнее в первую очередь получают из звездчатых клеток печени (НSCS), принцип печени не-паренхиматозные клетки , ответственные за формирование рубцовой печени 4. Тем не менее, регенеративной терапии, которые стимулируют эндогенные клеточные источники, включая HPCS для регенерации гепатоцитов в присутствии устойчивых фиброгенных оскорблений ожидают дальнейшего расследования.
Многие экспериментальные модели фиброза печени были описаны у млекопитающих. Повторные инъекции четыреххлористого углерода (CCl 4) широко используется для индукции фиброза печени у мышей и крыс моделей 7. В сочетании с высоким содержанием жиров (HF) диеты, алкоголь привело к существенному усилению активности профиброгенного экспрессии генов и фиброза печени 8. В то время как стеатоз (липидный накопление) является результатом острого воздействия алкоголя, он делает печень восприимчивой к более тяжелой печеночной травмы 9.
Данио, Danio rerio, стала бесценным позвоночного модельной системы для изучения регенерации. Хотьдругие низшие позвоночные , такие как тритонов и аксолотлей обладают замечательной способностью к регенерации, то данио имеет преимущества по сравнению с другими системами модели в отношении стратегии генной инженерии и визуализации , необходимых для манипулирования потенциальной регенерирующим факторов 10. Данио также представляет собой привлекательную модель для изучения позвоночное алкогольные заболевания печени (ALD) путем простого добавления этанола (этанол) в их воде. Острое воздействие этанола личинок и взрослых данио причиной стеатоз печени 11-13. Когда взрослые данио получил расширенную экспозицию этанола, отложение коллагена наблюдалось с повышающей регуляции фиброзом связанных генов 14. Тем не менее, существует необходимость разработки моделей для изучения регенерации печени в ответ на этаноле в качестве фиброгенным стимула.
В последнее время мы разработали этанол-индуцированной фиброзной модель печени у данио 15. Мы объединили гепатоцитов конкретной системы генетической абляции с лечением в смеси этанол личинками и ADULт данио. Мы создали два трансгенных линий, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 и Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, в котором Е. coli нитроредуктаза (NTR) слиты с бирюзового и mCherry флуоресцентного белка, соответственно, под контролем гепатоцитов специфических жирных кислот связывающего белка 10А, печени основной (fabp10a) промотор. В этой системе, НТР преобразует нетоксичное пролекарство метронидазола (MTZ) в ДНК между прядей сшивающего агента 16, вызывая явную гибель гепатоцитов. Используя эту модель, мы показали, что популяция клеток печени, которые реагируют на передачу сигналов Notch, преобразованный в гепатоциты в ближайшем отсутствии гепатоцитов и в избытке ECM. Мы обозначены эти клетки в качестве HPCS. Кроме того, с помощью химических экранов, мы идентифицировали молекулы активаторы малые передачи сигналов Wnt и ингибиторы передачи сигналов Notch, которые усиливают регенерацию гепатоцитов в печени фиброзной. Therefoповторно, наша фиброзных модель печени в данио представляет собой превосходную химическую систему скрининга по сравнению с клеточной или системы с учетом культурных скрининга млекопитающих на основе. Она представляет собой систему в естественных условиях со значительным с точки зрения затрат и экономии времени преимущества. Здесь мы опишем подробные процедуры для создания фиброзной модель печени EtOH-индуцированных и для осуществления химических экранов с использованием этой модели в данио. Кроме того, анализ времени курса были проведены, чтобы исследовать, как гепатоцитов регенерации происходит в печени фиброзной. Этот протокол обеспечит бесценным инструментом для изучения механизмов и стратегий усиления регенерации гепатоцитов в печени фиброзной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Рерио были подняты и размножались с использованием стандартного протокола, который отвечает критериям, изложенным в Национальных институтов здравоохранения и одобренных Технологический институт Джорджии Институциональные уходу и использованию животных комитета.
1. Приготовление растворов
- Приготовьте 20 л воды яйцо (взаимозаменяемы с 'эмбрионального среды') для поддержания эмбриональных / личиночной данио. Растворить 1,5 г CaSO 4 и 6 г морской соли мгновенного океана в 250 мл дистиллированной воды. Налить в бутыль, заполненную 20 л дистиллированной воды и перемешивать.
- Готовят 1 л 1-фенил-2-тиомочевины (PTU) раствор (20x). Растворить 0,6 г PTU порошка в 1 л дистиллированной воды. Добавить 1 мл маточного раствора на 20 мл раствора эмбриональной среде до конечной концентрации 0,003% в качестве рабочего раствора.
ВНИМАНИЕ: PTU может привести к системной токсичности после вдыхания или воздействии через кожу. Подготовка и использование в соответствии с надлежащими руководящими принципами обработки. - Готовят 1 л этилового эфира 3-aminobenzoate метансульфонат (Tricaine) раствор (20x). Разведите 4 г порошка Tricaine в дистиллированной воде. Регулировка рН до 7 путем добавления 1 М Трис-буфера (рН 9), и довести конечный объем до 1 л дистиллированной водой. Алиготе в 50 мл и хранят при -20 ° С. Разморозить перед употреблением.
ВНИМАНИЕ: Tricaine может вызвать потерю чувствительности. Подготовка и использование в соответствии с надлежащими руководящими принципами обработки. - Приготовьте 100 мл личиночной метронидазол (MTZ) рабочего раствора. Сделать свежий 15 мМ раствора MTZ путем растворения 0,25 г MTZ порошка в 0,1% диметилсульфоксида (ДМСО) в 100 мл среды эмбриона. Растворите порошок MTZ полностью энергичном встряхивании. Сделать свежий раствор MTZ и использовать алюминиевую фольгу для предотвращения фотокаталитической деградации MTZ.
ВНИМАНИЕ: MTZ может вызвать раздражение. Подготовка и использование в соответствии с надлежащими руководящими принципами обработки. - Приготовьте 100 мл личиночной этанол / метронидазол (этанол / MTZ) рабочего раствора. Сделать свежий раствор MTZ и использовать алюминиевую фольгу для предотвращения фотокаталитический деградация MTZ. Добавить 1,5 мл 100% этанола в 100 мл раствора MTZ до конечной концентрации 1,5% непосредственно перед использованием.
- Приготовьте 500 мл рабочего раствора для взрослых MTZ. Сделать свежий 10 мМ раствора MTZ путем растворения 0,83 г порошка MTZ в 0,1% ДМСО в 500 мл воды в системе. Растворите порошок MTZ полностью энергичном встряхивании. Сделать свежий раствор MTZ и использовать алюминиевую фольгу для предотвращения фотокаталитической деградации MTZ.
- Готовят 1 л PEM буфера. Растворить 30,2 г ТРУБ 0,74 г EGTA и 0,12 г MgSO 4 в дистиллированной воде. Отрегулируйте рН до 7 с помощью NaOH. Довести конечный объем до 1 л дистиллированной водой.
2. Приготовление личиночной данио рерио
- Настройка спаривание [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 взрослых данио с Tg (Hand2: EGFP) PD24 13 взрослых данио в спаривании цистернах. Используйте разделители для проведения приурочен спаривание.
- Удалите дivider следующее утро и позволяют рыбе спариваться без прерывания работы. Урожай эмбрионов 2 часа позже, напрягая воды в системе и перенос эмбрионов в 100 мм чашки Петри с эмбрионом среды.
- Хранить не более 100 эмбрионов на чашку Петри. Под стереомикроскопа, удалить неоплодотворенные яйца с помощью стеклянной пипетки. Grow эмбрионов при 28 ° С и добавляют фенилтиомочевину (PTU) до конечной концентрации 0,003% после 10 часов-после оплодотворения (ФВЧ) ингибировать развитие пигмента.
3. Этанол, метронидазол Лечение и печени Регенерация на личиночной данио рерио
- Готовят свежий раствор этанола путем добавления этанола в эмбрион среде до конечной концентрации 1,5%. Не добавляйте PTU.
- Лечить эмбрионов с 20 мл раствора этанола на чашку Петри с 56 до 80 часов после оплодотворения. Накройте чашки Петри с полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения этанола.
- Разобраться [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 SUP>; Тд (Hand2: EGFP) , PD24] личинки с аналогичным размером печени, как определено выражением CFP, при 80 часов после оплодотворения. Не используйте Tricaine при сортировке EtOH обработанных личинок, так как это приведет к высокой смертности с последующей обработкой EtOH / MTZ. Хранить отсортированный личинок при плотности 30 эмбрионов на чашку Петри.
- Подготовьте свежий 15 мМ MTZ в эмбрион среде в 0,1% ДМСО. Добавьте необходимое количество этанола в раствор MTZ, чтобы сделать конечной концентрации 1,5%. Выдержите личинок в 20 мл раствора этанола / MTZ на чашку Петри в течение 24 ч при 28 ° С. Накройте чашки Петри с полиэтиленовой пленкой, чтобы поддерживать концентрацию этанола и с алюминиевой фольгой для защиты от света.
- В конце лечения, удалить раствор этанола / MTZ путем переноса личинок на новые чашки Петри со свежей средой эмбриона. Вымойте личинки 3 раза эмбриона среды и держать их в 20 мл эмбриона среде без PTU.
- Чтобы разобраться личинок с почти полной абляции гепатоцитов, наблюдать флуоресценциюпод эпифлуоресцентной микроскопом с фильтром КФП при увеличении 80X. Успешные результаты абляции в минимальной CFP флуоресценции в печени и значительно уменьшенный объем печени.
- Чтобы избежать смерти EtOH / MTZ обработанных личинок, не используют Tricaine для сортировки. Закрепить личинок для иммунным окрашиванием (смотрите раздел 5) или держать отсортированный личинок в чашках Петри при 28 ° С для дальнейших анализов.
4. Химические экраны в EtOH / MTZ-обработанных личинок данио рерио
- Принесите 96-луночные планшеты, содержащие 10 мМ химические запасы в ДМСО (см Перечень материалов для деталей относительно коммерческих химических библиотек) от -80 ° C морозильнике. Покрытие с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотокаталитический разрушение химических веществ. Растаяйте растворы при комнатной температуре с нежным покачиванием.
- Подготовка химических растворов путем разбавления 10 мМ маточных растворов с эмбрионом среде до конечной концентрации 50 мкМ (в 96-луночных планшетах: начальным сCreen; в 1,5 мл пробирки: переаттестации). Личинки управления обрабатывали равными концентрациями ДМСО в среде эмбрионов.
- Личинки Перевод с почти полным гепатоцитов абляции, которые обрабатывают 1,5% EtOH / 15 мМ MTZ и сортировали, как указано выше, либо 96-луночного (начальный экран) или 24-луночного (Повторная проверка) пластины предварительно заполненные с эмбрионом среде при плотности 5 личинок на лунку. Использование дублирующих скважин для каждого химического вещества.
- Удалить эмбрионов среду и добавляют либо 250 мкл (96-луночные планшеты) или 500 мкл (24-луночные планшеты) химических растворов в каждую лунку. Накладки с алюминиевой фольгой и лечить личинок в течение 50 ч при 28 ° С. Проверить химическую-всасывающие личинок ежедневно и удалите мертвых личинок из отдельных скважин.
- В конце химической обработки, с тем количеством и / или интенсивность КФП-экспрессирующих гепатоцитов под микроскопом эпифлуоресцентной с CFP фильтром при увеличении 80X. Фотография живой личинки показ расширения или сокращенияd число и / или интенсивность СФП-экспрессирующих гепатоцитов с цифровой камерой для записи.
- Сохранение личинок формальдегидом фиксации для конфокальной микроскопии, как описано в разделе 5.
- Для повторного тестирования химических веществ, которые способствуют регенерации гепатоцитов на начальном экране, изучить их эффективность при более высоких и более низких концентрациях, чтобы найти наиболее эффективную концентрацию с процедурами, описанными в 4.1-4.5 ( "переаттестации").
5. Личинки данио рерио Фиксирование, Иммунологическое и конфокальной микроскопии
- Обезболить личинок путем добавления Tricaine до конечной концентрации 0,02%. Перенести 10-15 личинок в 1,5 мл трубки и промыть один раз фосфатным буферным раствором (PBS). Удалить PBS и добавьте 1 мл свежеприготовленного 2% формальдегида в буфере PEM для фиксации O / N при 4 ° С.
ВНИМАНИЕ: Формальдегид вызывает раздражение и, как известно, является канцерогеном для человека. Обращаться в химическом вытяжном шкафу. - Откажитесь фиксируя решение правильно, а затем ваSH 3 раза PBS при комнатной температуре. Фиксированные личинки могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней. Переходя к следующему шагу быстро дает лучшие результаты иммунным окрашиванием.
- Осторожно удалите желток и кожу, покрывающую область печени с помощью # 55 пинцета под стереомикроскопа.
- Проницаемыми и блокировать личинок в буфере блоков (4% бычьего сывороточного альбумина и 0,3% Тритон Х-100 в PBS) O / N при температуре 4 ° С.
- Инкубируйте с кроликом анти-Коллаген I антитела в разведении 1: 100 в буфере блоков O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз в течение 15 мин каждый с промывочным буфером (0,3% Тритон Х-100 в PBS).
- Выдержите с AlexaFluor 647 конъюгированного ослиного антитела против кролика в разведении 1: 200 в буфере блоков O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз в течение 15 мин каждый раз буфером для промывки. Затем промыть один раз PBS.
- Аккуратно перенести личинок в стеклах с использованием стеклянной пипетки, а также ориентировать фиксированные личинки с левый боковой стороной вверх. Удалите излишки PBS, используя Kimwipes. Добавить каплю монтажных средств массовойИ уплотнение крышки стекла с лаком для ногтей. Проведение визуализации конфокальной сразу сильно рекомендуется.
- Используйте конфокальной систему, оснащенную 40X / 1.3 масла объективом захвата изображения. С помощью лазерной прочности на 20-50%. Захват изображений Z стека с интервалом в 1 мкм.
6. Подготовка взрослых данио
- Настройка спаривание [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 взрослых данио в спаривании танках. Урожай эмбрионов на следующее утро напрягает воды в системе и перенос эмбрионов в 100 мм чашки Петри с эмбрионом среды.
- Хранить не более 100 эмбрионов на чашку Петри. Под стереомикроскопа, удалить неоплодотворенные яйца с помощью стеклянной пипетки. Grow эмбрионов при 28 ° С и добавляют PTU до конечной концентрации 0,003% после 10 часов после оплодотворения, чтобы ингибировать развитие пигмента.
- В 4 денье, использовать Tricaine обезболить личинок и разобравшись [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] личинки. Промойте Tricaine путем изменения в свежих эмбрионов в несколько раз среда. Разрешить личинки восстанавливаться при 28 ° С , пока они не достигнуть нормального сердечного ритма 120-180 ударов в минуту 18.
- Приподнять отсортированный личинок 6-12 месяцев на основе стандартной процедуры 19.
7. Этанол, метронидазол Лечение и регенерации печени в взрослых данио
- Передача 6-12 месяцев старый [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] взрослых данио к спариванию танков с использованием сети. Хранить рыбу при плотности не более 10 особей на танк.
- Готовят свежий раствор этанола путем добавления в EtOH системы воде до конечной концентрации 1%. Лечить взрослую рыбу с 500 мл раствора этанола в каждом баке и поддерживать их в 28 ° C инкубатора.
- Передача взрослой рыбы на свежий раствор этанола ежедневно, отбрасывания мертвой рыбы пропкак безупречной Biohazard. Постоянно относиться к животным в течение 72 ч перед обработкой MTZ.
- Готовят свежий раствор 10 мМ MTZ в воде системы в 0,1% ДМСО. Предварительно нагрейте раствор MTZ в C инкубаторе 28 °. Рассматривать рыбу с 500 мл раствора MTZ в 1 л бак пересечения в течение 8 ч при 28 ° С, защищенном от света месте при помощи алюминиевой фольги.
- Соблюдайте каждый час в течение лечения и немедленно удалить мертвую рыбу. Откажитесь мертвой рыбы должным образом как Biohazard. В конце лечения MTZ, промыть MTZ путем перевода животных в свежей воде системы в два раза.
- Разрешить животных для восстановления и поддержания их в инкубаторе при температуре 28 ° C. Корма и перечисляют рыбу свежей воды в системе ежедневно до момента времени для анализа.
8. Печень взрослых данио Фиксирование, Иммунологическое и конфокальной микроскопии
- Обезболить взрослую рыбу с 0,02% Tricaine и эвтаназии в ледяной воде в течение 15 мин. Пэт рыба сухая на бумажное полотенце и поместить его на секционном мат.
- Защиту органов желудочно - кишечного тракта путем удаления кожи и мышц как описано выше 20. Используйте ножницы, чтобы отрезать кожи и основные мышцы вдоль брюха от анального плавника до жаберной крышкой, а затем кзади вдоль боковой стороны рыбы обратно к анального плавника.
- Положите рыбу в коническую пробирку 15 мл и мыть один раз PBS. Удалить PBS и добавляют 4 мл свежеприготовленного 2% формальдегида в буфере PEM для фиксации O / N при температуре 4 ° С.
- Откажитесь фиксируя решение правильно, и промыть 3 раза PBS при комнатной температуре. Фиксированные образцы можно хранить в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней. Переходя к следующему шагу немедленно дает лучшие результаты, иммунное окрашивание.
- Dissect весь кишечник печень из полости тела рыбы путем разрезания пищевод. Вставить желудочно-кишечные органы с 4% легкоплавкой агарозы в секционирования плесени.
- Используйте vibratome вырезать образцы в поперечном сечении с интервалами 50 мкм в охлажденный льдом PBS, начиная от переднего конца. Передача секции на 6-луночный планшет с PBS, используя # 1 кисть.
- Проницаемыми и блок-секций в блоке буфера O / N при 4 ° С.
- Инкубируйте с кроликом анти-Коллаген I антитела в разведении 1: 100 в буфере блоков O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз, через 15 мин каждый с буфером для промывки.
- Выдержите с AlexaFluor 647 конъюгированного ослиного антитела против кролика в разведении 1: 200 в буфере блоков O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз, 15 мин каждый раз буфером для промывки и один раз PBS.
- Аккуратно перенести разделы на стеклянные слайды, используя # 1 кисточка. Удалите излишки PBS с помощью Kimwipes, добавить каплю крепежных средств массовой информации, а также уплотнение крышки стекла с лаком для ногтей. Проведение конфокальной микроскопии немедленно настоятельно рекомендуется.
- Используйте конфокальной систему, оснащенную 40X / 1.3 масла объективом захвата изображения. С помощью лазерной прочности на 20-50%. Захват изображений Z стека с интервалом в 1 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показано развитие в смеси этанол-индуцированной фиброзной модели печени в личиночной данио. Чтобы оптимизировать протокол для воздействия данио личинок этанола, мы сначала оценивали токсичность этанола. 2,5 дня, после оплодотворения (DPF) личинки подвергались воздействию концентрации этанола 1%, 1,5%, или на 2% в течение 24 ч с последующим одновременным 24 ч этанола обработки / MTZ. Воздействие 2% этанола вызвали высокую смертность, в то время как почти все личинки подвергали воздействию 1% этанола или менее показали минимальные фиброгенетические изменения с редким отложению белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген. На основании этих результатов, личинки предварительно обрабатывают с 1,5% этанола в течение 24 ч (2,5-3,5 DPF) , а затем одновременно обрабатывают MTZ в течение 24 ч (3,5-4,5 DPF) (Рис . 1А) EtOH / MTZ обработанных личинок показали морфологические аномалии в том числе восходящей кривизны туловища и хвоста, перикарда отек, а также неспособность раздувать плавательного пузыря. (Фигура 1В). Мыиспользовали три трансгенные линии для анализа фиброгенетические изменений в EtOH / MTZ-обработанных личиночной печени: 1) Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1 линия экспрессирует ген NTR , слитый с бирюзового флуоресцентного белка под гепатоцитов специфических fabp10a промотора 15; 2) Tg (Tp1: mCherry) jh11 линия обозначает клетки с сигнализацией активным Notch (клетки Notch-отзывчивым, НРЦ) или желчных протоков эпителиальных клеток (БЭК) с ядерным mCherry 17, выражение которого находится под контролем модуля ТР1 , содержащего несколько RBP- Jk-сайты связывания; и 3) Тг (hand2: EGFP) PD24 линия, которая маркирует звездчатых клеток печени (ГСК) 13. ДМСО-контроль , обработанный [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) PD24] Печень не показал тип фибрилловую коллагена осаждения 4,6,9 (рис 1C, C '), в то время как этанол / MTZ обработанных печенки отображается повышенный тип коллагена накопление в 25 и 50 ч-пост-абляции (HPA) (рис 1D, D ', Е, Е'). Кроме того, по сравнению с ДМСО обработанных печенью контрольных (фиг.1С ''), гемопоэтические стволовые клетки увеличилось число с измененной морфологией из звездообразной конфигурации в миофибробластного-образную форму с потерей цитоплазматических процессов в EtOH / MTZ обработанного регенерирующей печени ( Рисунок 1D '', Е ''). Мы наблюдали два дискретных популяций mCherry экспрессирующих НРДК при 25 гПа в EtOH / MTZ обработанных регенерирующей печени: тусклый красный НРДК (рис 1D '' ', вставка, белые стрелки) и ярко - красными НРДК (рис 1D' '', вставка , желтые наконечники стрел). При 50 гПа, гепатоцитов специфические CFP начали сотрудничать экспресс в НРДК с тусклым выражением mCherry по всей регенерирующей печени (рис 1E '' ', вставка, белые стрелки). Эти CFP и тусклый mCherry-coexpressing НРЦ, очевидно , отличаются от ярко - красных НРДК , что негативные для CFP (рис 1E '' ', врезка, желтые стрелки). Предыдущие исследования показали , что при пролиферации гепатоцитов было подавлено после частичной гепатэктомии (PHX), HPCS расширен с сопутствующей пролиферации ГСК 21. Кроме того, HPCS и BECs совместно гистохимические маркеры 22. Таким образом, наши результаты показывают, что CFP и тусклый mCherry коэкспрессирующей НРЦ изображают данио-аналог HPCS, которые дифференцируются в гепатоциты, встречаясь понижающей регуляции Notch. В НРЦ поддерживающие более высокие уровни передачи сигналов Notch может оставаться холангиоцитов, которые дифференцированы BECs 23.
На рисунке 2 показано развитие в смеси этанол-индуцированной фиброзной модели печени у взрослых данио. Во-первых, мы подвержены взрослых данио до 1%, 1,5%, или 2% этанола для оценки жизнеспособности. Большинство взрослых данио сделал нOT выживают более 72 ч воздействия концентраций EtOH более 1% (неопубликованные данные). Поэтому для взрослых данио, мы предварительно обрабатывают рыбу с 1% этанола в течение 72 ч и с последующим лечением MTZ (Рисунок 2А). При выполнении анализа времени , конечно, мы показали значительно повышенный тип коллагена осаждения в EtOH / MTZ-обработанных регенерирующей печени в 2, 3, и 4 дня, после абляции (DPA) (рис 2C ', D', E ') по сравнению с ДМСО обработанных печенью (Фигура 2В '). Подобно тому , что наблюдается у личинок, в CFP и тусклый mCherry коэкспрессирующей клетки были обнаружены в EtOH / MTZ-обработанных регенерирующей печени 12-месячным [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] взрослая рыба на 3 и 4 DPA (рис 2D, E, вклейки, белые стрелки). Эти данные указывают на то, что HPCS, реагирующий на Notch сигнализации, сохраняют свою способность к регенерации, как гепатоцитовналичие фиброгенной инсульта у взрослых данио.
На рисунке 3 показаны репрезентативные результаты химического скрининга с использованием нашего этанол-индуцированной фиброзной модель печени в личиночной данио. Для того, чтобы точно определить биологически активные соединения, которые ускоряют регенерацию гепатоцитов в печени фиброзной, мы провели химические генетические экраны. Мы скринингу библиотеку 75 малых молекул с хорошо охарактеризованных биологической и фармацевтической деятельности (Stem Cell Signaling Library соединение, Selleckchem) и библиотека 1000 менее охарактеризованный малых молекул (ActiProbe-1K библиотеки, TimTec) с использованием [Tg (fabp10a: CFP -NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] личинки. Мы абляции гепатоцитов в присутствии 1,5% EtOH / 15 мМ MTZ и затем подвергали воздействию личинок до 50 мкМ соединений в течение 50 ч (фиг.3А). Ряд агонистов Wnt, таких как SB 415286 и Чир-99021, ингибиторы гликоген - синтазы - киназы-3, способствовало гепатоцитов регенерации (рис 3C, D) по сравнению с ДМСО (рис 3B). Кроме того, [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-ил) -1,2,5-оксадиазол-3-иламин], сокращенно HTOA, нового Wnt затрагивающего пути активатора, усиливается гепатоцитов регенерации в фиброзной печени , как указано большей регенерированной печени (рис 3Е). Эти данные свидетельствуют о том, что наша устойчивая фиброзных модель представляет собой бесценный инструмент, чтобы обнаружить малые молекулы, которые усиливают регенерацию гепатоцитов.
Рисунок 1. Разработка этанола-индуцированной фиброзной модели печени в личиночной данио. (А) Схема , иллюстрирующая периоды этанола и этанола / MTZ обработки для создания фиброзной модели печени у личинок. (B) В 50 часов-пост-абляции (HPA), этанол / MTZ обработанных лARVAL данио разработаны морфологические аномалии в том числе восходящей кривизны туловища и хвоста, перикарда отек, а также неспособность раздувать плавательного пузыря. (CC '' ') в печени [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) PD24] личинки обрабатывают ДМСО, ECM белок коллаген 1a был почти незаметного (C, C ') и в состоянии покоя ГСК показал звездообразную конфигурацию (C' '), в то время как НРЦ распределены между гепатоцитов (C, C '' ', вставка). (DE '' ') в печени EtOH / MTZ обработанных личинок, наблюдалось повышенное отложение коллагена 1а (D, D', Е, Е '). ГСК увеличилось количество и потерял сложные цитоплазматические процессы (D '', E ''). При температуре 25 гПа, mCherry-экспрессирующие НРЦ состоят из двух различных популяций, Желтые наконечники стрел указывают на ярко - красные НРДК (D '' ', вставка), в то время как белые стрелки указывают тусклые красные НРДК (D' '', вставка). При 50 гПа, Tg (fabp10a: CFP-NTR) и Tg (Tp1: mCherry) коэкспрессирующей клетки начали появляться по всему регенерирующей печени (Е '' ', вкладных, белые стрелки), в то время как ярко - красные НРЦ не было никакого выражения CFP (Е '' ', вставка, желтые стрелки). Все конфокальной изображения одиночных изображений плоскости , за исключением C '', D '', Е '', которые являются проекционные изображения. Шкала баров: B, 100 мкм; CE '' ', 20 мкм. Этанол, этиловый спирт; MTZ, метронидазол; гПа, часы-пост-абляции; DPF, дни-после оплодотворения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Разработка этанол-индуцированной фиброзной модели печени у взрослых данио. (А) Схема , иллюстрирующая периоды этанола и MTZ обработки для создания фиброзной модели печени у взрослых. (BE ') Tg (fabp10a: CFP-NTR), Tg (Tp1: mCherry), и экспрессия коллагена 1a в vibratome участках ДМСО (B и B') и EtOH / MTZ обработке (CE ') для взрослых данио печенки. (ВВ ') в ДМСО-контрольной группой, обработанной, коллаген 1a был почти невозможно обнаружить (В') без Tg (fabp10a: КФП-НТР) и Tg (Tp1: mCherry) коэкспрессирующей клетки (В). (СЕ ') в EtOH / MTZ обработанного регенерирующей печени, отложение коллагена 1а заметно повышен в 2, 3, и 4 , DPA (C', D ', E') снаселение Tg (fabp10a: CFP-NTR) и Tg (Tp1: mCherry) коэкспрессирующей клеток в 3 и 4 DPA (D, E, вставках, белые стрелки). Ярко - красный НРЦ не было никакого выражения CFP (D, E, вклейки, желтые стрелки). BE, конфокальной одной плоскости изображения. B'-Е ', конфокальной проекции изображения. Шкала бар, 20 мкм. Этанол, этиловый спирт; MTZ, метронидазол; DPA, дни-пост-абляции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель результаты химического скрининга с использованием этанол-индуцированной фиброзной модель печени в личиночной данио. (А) Схема для экрана регенерации гепатоцитов в печени фиброзной. (BE) Известные и новые Wntактиваторы увеличивают регенерацию гепатоцитов в печени фиброзной. Конфокальные проекции EtOH / MTZ-обработанных печенью в [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] личинки , которым вводили с ДМСО (B), SB415286 (С), Чир-99021 ( D), или новый Wnt активатор [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-ил) -1,2,5-оксадиазол-3-иламин] (сокращенно HTOA) (Е). SB415286 и Чир-99021 являются гликоген-синтазы ингибиторов киназы-3. Все изображения являются конфокальной проекции изображения. Шкала бар, 20 мкм. Этанол, этиловый спирт; MTZ, метронидазол; гПа, часы-пост-абляции; DPF, дни-после оплодотворения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы наблюдали ГПЦ-опосредованной гепатоцитов регенерации в EtOH / MTZ обработанных выздоравливающих печенью, предполагая, что даже при наличии значительного количества белков ЕСМ в том числе типа фибриллярный коллаген I, то HPCS сохраняют свою правомочность регенерировать в гепатоцитах. MTZ только обработка не увеличивали осаждение белков ЕСМ значительно, в то время как этанол только обработка не вызывает активацию ГПЦ 15. Используя комбинированное лечение EtOH / MTZ, мы смогли исследовать регенерацию ГПЦ-возбуждаться в фиброзной печени. Как почти полная ликвидация гепатоцитов вызывает ГПЦ управляемой регенерации гепатоцитов, очень важно, чтобы разобраться в MTZ-обработанных личинок на основе критериев отсутствия гепатоцитов конкретной флуоресценции и значительно уменьшенный объем печени по кластерной НРДК. У рыб, кровеносные сосуды жабр и кожи поглощать спирт 24, так что нет никакой необходимости , чтобы позволить животным пить вволю или требовать intragastric настой, как в моделях млекопитающих. Мы размещались EtOH- и последующих MTZ обработанных взрослых рыб в отдельных резервуарах без циркуляции воды. Чрезвычайно важно, чтобы передать рыбу в свежем растворе этанола ежедневно и держать крышку на, чтобы свести к минимуму испарение этанола. Хотя 48-72 ч этанол / MTZ лечение эффективно индуцирует синтез белков ЕСМ в наших протоколах, ни фиброз, ни цирроза печени была разработана в этих рыб. Таким образом, сочетание MTZ при длительном воздействии этанола , таких как 12 недель лечения 14, особенно у взрослых рыб, может вызвать более серьезные повреждения печени , чтобы правильно симулировать и допросить ГПЦ управляемой регенерации при хронической печеночной недостаточности.
Данио служит выдающейся животной модели для естественных условиях сложного тестирования в связи с его малыми размерами, большим потомством, прозрачность и проницаемость для малых молекул 25. Используя фиброзной модель печени у данио, мы определили ряд известных и новых Wnt ACTiактиваторов и ингибиторов Notch , которые ускорили гепатоцитов регенерации 15. В настоящее время мы флуоресценция протокол на основе химического скрининга состоит из нескольких этапов все выполняемые вручную, включая подготовку химических веществ, перенося этанол-обработанную / гепатоцитов-абляции личинок 24-луночные планшеты, обработки химических веществ, а также анализа воздействия химических веществ на регенерацию гепатоцитов. Он специально использует эпифлуоресцентной и / или конфокальной микроскопии для захвата изображений для отдельного животного, которое является трудоемким и занимает много времени. Высокая пропускная способность платформы , которые автоматически обрабатывать и получать сотовой разрешающей способностью визуализации данио в сочетании с количественной сбора данных будет способствовать широкомасштабный скрининг 26,27 .Эти функции будут усилены , если в сочетании с системой дозирования автоматизирован наркотиков , которая определяет диапазон химических концентраций 28, который может дать минимальную токсичность с максимальной эффективностью для усиления регенерации гепатоцитов. Несмотря на эти лимитойции, так как многие важные игроки и основные типы клеток печени сохраняются между данио и млекопитающих 29, используя в естественных условиях -На малую молекулу скрининга с использованием данио фиброзной модели печени будет катализировать действительное открытие новых терапевтических стратегий для хронических заболеваний печени.
Две дополнительные группы независимо друг от друга показали , что после почти полной потери гепатоцитов без фиброгенных оскорблений, BECs transdifferentiated в гепатоцитах через стадию дедифференциации 30,31 с предположением , что холангиоцитов, полностью дифференцированные BECs, в основном , включают NRCS / БЭК в данио. Хотя трансдифференцировка может быть одним из механизмов вождения регенерации гепатоцитов, наши результаты указывают на то, что HPCS, которые , как известно, составляют большинство БЭК в данио печени 32, подавляют активность Notch дифференцироваться в гепатоциты. В то же время, то вполне вероятно предположить, что йе полностью дифференцированные BECs, холангиоцитов, поддерживать более высокие уровни активности Notch без преобразования в гепатоцитах во время регенерации. Интересно, что в присутствии этанола, как сообщалось ранее 13, мы обнаружили , что ГСК увеличилось число с измененной морфологией от звездчатой конфигурации к миофибробластного-образную форму с несостоявшимся цитоплазматических процессов. Активированные ГСК характеризуется синтезом белков ЕСМ являются основным виновником ответственность за аномальное заживление раны во время процесса комплексного ремонта печени 4. Хотя хроническая травма часто перекрывает замечательную способность печени для регенерации, пересаживают HPCS успешно заселили фиброзного / цирротический печени крысы 33. Таким образом, наша данио фиброзных модель печени будет важным инструментом для выяснения молекулярных и клеточных механизмов, которые обеспечивают эффект устойчивого фиброза на ЦВД-опосредованной гепатоцитов регенерации. Кроме того, определение многоклеточных грrosstalk, балансирующий регенерации и фиброзом, используя нашу данио фиброзной модель печени будет дополнительно способствовать тому, чтобы разработать жизнеспособные терапевтические стратегии для лечения хронической печеночной недостаточности в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантами от GTEC (2731336 и 1411318), НИЗ (K01DK081351) и НФС (1354837) в CHS Мы благодарим Alem Гиоргис за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K.
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L.
- Bataller, R., Brenner, D. A.
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P.
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
