Introduction
肝臓の主要な実質細胞型である肝細胞1、の顕著な再生能力にもかかわらず、慢性肝不全、肝前駆細胞（HPC）依存性再生2につながる、この能力を損ないます。
慢性肝障害は、主にアルコールの乱用、慢性C型肝炎ウイルス（HCV）感染3及び非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）4から誘導されます。それは、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の蓄積に関連している持続的な肝線維症につながります。永続化ECMの蓄積はその後、高い罹患率と死亡率との肝硬変で、その結果、線維性瘢痕組織5を形成することにより、無傷の肝アーキテクチャを歪めます。多くの試みがprofibrogenicサイトカインおよび活性化筋線維芽細胞6を阻害することに焦点を当て、主に線維化反応を緩和するために行われてきました。後者は主にH（肝星細胞に由来しますSCS）、肝臓の瘢痕形成4に責任原則肝非実質細胞。それにもかかわらず、持続的な線維形成侮辱の存在下で肝細胞を再生成するのHPCを含む内因性の細胞源を刺激する再生治療は、さらなる調査を待ちます。
肝線維症の多くの実験モデルは、哺乳動物において記載されています。四塩化炭素（CCl 4）の繰り返し注射が広くマウスおよびラットモデル7における肝線維症を誘導するために使用されてきました。高脂肪（HF）ダイエットと組み合わせると、アルコールはprofibrogenic遺伝子発現と肝線維症8の実質的なアップレギュレーションにつながりました。脂肪症（脂質蓄積）が急性アルコール暴露から生じるが、それはより重度の肝損傷9に肝臓が受けやすくなります。
ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは、再生を研究するための貴重な脊椎動物モデル系として浮上しています。しかしこのようなイモリやアホロートルなどの他の下等脊椎動物は、再生のための驚くべき能力を持っている、ゼブラフィッシュは、潜在的な回生要因10を操作するために必要な遺伝子操作と可視化戦略に関して、他のモデル系を超える利点を有しています。ゼブラフィッシュは、単にそれらの水エタノール（エタノール）を添加してアルコール性肝疾患（ALD）を研究するための魅力的な脊椎動物モデルを表します。幼虫と大人のゼブラフィッシュへの急性エタノール曝露は、肝臓脂肪症11-13を引き起こしました 。成体ゼブラフィッシュは、拡張エタノール曝露を受けたときに、コラーゲン沈着は、線維症関連遺伝子14のアップレギュレーションを観察しました。ただし、必要が線維形成刺激としてのEtOHに応じて、肝臓の再生を研究するためのモデルを開発するために存在します。
最近、我々はゼブラフィッシュ15におけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルを開発しました。私たちは、幼虫とADULにエタノール治療と肝細胞特異的遺伝子除去システムを組み合わせましたトンのゼブラフィッシュ。我々は2つのトランスジェニック系統を生成し、Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1及びTg（fabp10a：mCherryを-NTR）GT2、 大腸菌ニトロレダクターゼ（NTR）が制御の下で、それぞれシアン、mCherryを蛍光タンパク質に融合されています肝細胞特異的な脂肪酸のタンパク質10aは結合、肝臓基本 （fabp10a）プロモーター。このシステムでは、NTRは、肝細胞の明示的な死を誘導する、DNAストランド間架橋剤16に非毒性のプロドラッグメトロニダゾール（MTZ）に変換します。このモデルを使用して、我々は、Notchシグナル伝達に応答する肝細胞の集団は、肝細胞の近くにない場合およびECMを超える肝細胞に変換することを実証しました。私たちは、HPCのように、これらの細胞を指定しました。さらに、化学画面を、我々は線維症、肝臓における肝細胞の再生を増強する小分子Wntシグナル伝達の活性化剤およびNotchシグナル伝達の阻害剤を同定しました。 Therefo再は、ゼブラフィッシュにおける当社の線維性肝臓モデルは、セルculture-または哺乳動物に基づくスクリーニングシステムと比較して、優れた化学的スクリーニングシステムを表します。これは、かなりの費用と時間節約のメリットとin vivo系です。ここでは、エタノール誘発性線維症肝臓モデルを確立するためのゼブラフィッシュでは、このモデルを用いて化学スクリーンを実行するための詳細な手順を説明します。また、経時的分析は、肝細胞の再生が線維性肝臓で発生方法の検討を行いました。このプロトコルは、線維性肝臓で肝細胞の再生を促進するメカニズムと戦略を研究するための貴重なツールを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ゼブラフィッシュは上昇し、国立衛生研究所の基準を満たしており、ジョージア工科大学施設内動物管理使用委員会により承認された標準プロトコルを使用して飼育しました。
ソリューションの調製
- 胚/幼虫のゼブラフィッシュを維持するために、（同義的に「胚培地」で使用される）20 Lの卵の水を準備します。蒸留水250ミリリットル中に1.5グラムのCaSO 4と6グラムインスタント海の海の塩を溶解させます。 20 Lの蒸留水で満たされたカーボイに注ぎ、かき混ぜます。
- 1 L 1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）ストック溶液（20倍）を準備します。 1 Lの蒸留水に0.6グラムのPTU粉末を溶かします。作動液として0.003％の最終濃度は、20 mlの胚培地当たりストック溶液1mlを加えます。
注意：PTUは、吸入または皮膚暴露後の全身毒性を引き起こす可能性があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 - 1 Lのエチル3- aminobeを準備nzoateメタン（トリカイン）ストック溶液（20倍）。蒸留水で4グラムのトリカイン粉末を溶かします。 1 Mトリス緩衝液（pH 9）を加えることによりpHを7に調整し、蒸留水で1Lの最終容量をもたらします。 -20℃で50ミリリットルにアリコートとストア。使用前に解凍します。
注意：トリカインは、感覚の喪失を誘導することができます。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 - 100ミリリットル幼虫メトロニダゾール（MTZ）ワーキング溶液を調製します。 100 mlの胚培地中の0.1％のジメチルスルホキシド（DMSO）0.25グラムMTZ粉末を溶解することにより、新鮮な15mMのMTZ溶液を作ります。激しく振盪によって完全にMTZ粉末を溶かします。新鮮なMTZ溶液を作成し、MTZの光触媒分解を防ぐためにアルミ箔を使用しています。
注意：MTZが、炎症を引き起こす場合があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 - 100ミリリットル幼虫のエタノール/メトロニダゾール（エタノール/ MTZ）ワーキング溶液を調製します。新鮮なMTZ溶液を作製し、光触媒ドを防ぐためにアルミ箔を使用MTZのグラデーション。使用直前に1.5％の最終濃度まで100ミリリットルMTZ溶液に1.5ミリリットルの100％エタノールを追加します。
- 500ミリリットル大人MTZ作業溶液を準備します。 500ミリリットルシステムの水に0.1％のDMSO中に0.83グラムのMTZ粉末を溶解することにより、新鮮な10mMのMTZソリューションを作成します。激しく振盪によって完全にMTZ粉末を溶かします。新鮮なMTZ溶液を作成し、MTZの光触媒分解を防ぐためにアルミ箔を使用しています。
- 1 L PEMバッファを準備します。 30.2グラムのPIPES、0.74グラムのEGTA、および0.12グラムの蒸留水に硫酸マグネシウムを溶解させます。 NaOHでpHを7に調整します。蒸留水で1リットルに最終容量を持参。
幼虫のゼブラフィッシュの調製
- [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のセットアップ交配GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11] のTg（hand2：EGFP）で15,17大人のゼブラフィッシュは、交配タンク内の13の大人のゼブラフィッシュをPD24。時限交配を行うために仕切りを使用します。
- Dを削除します翌朝ividerと魚が中断することなく交尾することを可能にします。 2時間後、システムの水に負担し、胚培地で100ミリメートルペトリ皿に胚を転送することにより収穫胚。
- ペトリ皿当たりのない100以上の胚を保管してください。実体顕微鏡下では、ガラスピペットを用いて、未受精卵を削除します。 28℃で胚を成長し、顔料の開発を阻害するために10時間ポスト受精（HPF）の後に0.003％の最終濃度にフェニルチオ尿素（PTU）を追加します。
幼虫ゼブラフィッシュ3.エタノール、メトロニダゾール治療と肝再生
- 1.5％の最終濃度まで胚培地にエタノールを添加することにより、新鮮なエタノール溶液を調製します。 PTUを追加しないでください。
- 56〜80 HPFからペトリ皿当たり20ミリリットルのエタノール溶液で胚を扱います。エタノールの蒸発を防ぐためにラップでペトリ皿をカバーしています。
- ソートアウト[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11 SUP>; Tgは（hand2：EGFP）同様の肝臓サイズとPD24]幼虫、80 HPFで、CFP式によって決定されます。エタノールで処理した幼虫をソートするとき、これは、その後のエタノール/ MTZ処理と高い死亡率の原因となりますので、トリカインを使用しないでください。ペトリ皿当たり30の胚の密度でソートされた幼虫を保管してください。
- 0.1％DMSO中の胚培地中で新鮮な15mMのMTZを準備します。 1.5％の最終濃度にするMTZ溶液にエタノールを適量加えます。 28℃で24時間、ペトリ皿当たり20ミリリットルのEtOH / MTZ溶液中の幼虫をインキュベートします。光から保護するために、エタノール濃度とアルミホイルでを維持するために、プラスチック製のラップでカバーペトリ皿。
- 治療の終わりに、新鮮胚培地で新しいペトリ皿に幼虫を転送することによってエタノール/ MTZ溶液を除去。胚培地で幼虫を3回洗浄し、PTUなし20ミリリットル胚培地に保管してください。
- 肝細胞のほぼ完全な切除で幼虫を整理するには、蛍光を観察します80Xの倍率でCFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下で。肝臓での最小限のCFPの蛍光と大幅に減少肝体積で成功したアブレーション結果。
- エタノール/ MTZ-処理した幼虫の死を回避するために、ソートにトリカインを使用しないでください。免疫染色のための幼虫を修正しました（セクション5を参照）、またはさらなる分析のために28℃でペトリ皿に並べ替えられた幼虫を保ちます。
エタノール/ MTZ-処理した幼虫のゼブラフィッシュ4.化学画面
- DMSO中の10mMに化学銘柄を含む96ウェルプレートを持参℃の冷凍庫から-80（商業化学物質ライブラリーに関する詳細については、物質一覧を参照してください）。化学物質の光触媒分解を防ぐためにアルミホイルで覆います。緩やかに揺り動かしながら室温でストック溶液を解凍します。
- 初期秒：96ウェルプレートで、50μMの最終濃度（に胚培地と10mMストック溶液を希釈して薬液を準備creen;再テスト）：1.5ミリリットルチューブインチ対照幼虫を胚培地中のDMSOの同じ濃度で処理しました。
- 1.5％のEtOH / 15mMのMTZで処理し、96ウェル（初期画面）またはの密度で胚培地を予め充填し、24ウェル（再検査）プレートのどちらかに、前述のように分類したほぼ完全な肝切除と転送幼虫ウェルあたり5幼虫。各化学物質のための二連のウェルを使用してください。
- 胚培地を削除し、各ウェルに250μlの（96ウェルプレート）または500μlの（24ウェルプレート）化学溶液のいずれかを追加します。アルミホイルでカバープレートとは、28℃で50時間、幼虫を扱います。毎日化学浸漬幼虫を点検し、個々のウェルからの任意の死んだ幼虫を削除します。
- 化学的処理の終わりには、80Xの倍率でCFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下でCFPを発現する肝細胞の数および/または強度を観察します。写真ライブ幼虫を増強または低下させる示しますD番号および/またはレコードのデジタルカメラでCFPを発現する肝細胞の強度。
- セクション5で説明したように、共焦点イメージングのためのホルムアルデヒド固定によって幼虫を保持します。
- 初期画面での肝細胞の再生を促進する化学物質を再テストするには、4.1から4.5（「再試験」）に記載されている手順と最も効果的な濃度を見つけるために、より高い及びより低い濃度でその効力を調べます。
5.幼虫ゼブラフィッシュ固定、免疫染色、および共焦点イメージング
- 0.02％の最終濃度までトリカインを追加することによって幼虫を麻酔。 1.5mlチューブに10~15幼虫を移し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄します。 PBSを削除し、4℃でO / Nを固定するために、PEM緩衝液中に新たに調製した2％のホルムアルデヒドの1ミリリットルを追加します。
注意：ホルムアルデヒドは炎症を引き起こし、ヒトの発癌物質であることが知られています。化学ドラフト内で取り扱います。 - WA正しく、次いで溶液を固定捨てます室温でPBSでshが3回。固定された幼虫は、数日間まで4℃でPBS中に維持することができます。次のステップに進むには、速やかに優れた免疫染色の結果が得られます。
- 慎重に実体顕微鏡下で＃55ピンセットを用いて肝臓領域をカバー卵黄と皮膚を取り除きます。
- 4℃で透過処理し、ブロックバッファ内のブロックの幼虫（4％のウシ血清アルブミン、PBS中の0.3％トリトンX-100）O / N。
- 1の希釈でウサギ抗コラーゲンI抗体とインキュベート：ブロック・バッファ・O / Nで100 4℃。洗浄緩衝液（PBS中0.3％トリトンX-100）で15分間ずつ5回洗浄します。
- 1の希釈でのAlexaFluor 647結合ロバ抗ウサギ抗体でインキュベートする：ブロックバッファO / Nで200 4℃。洗浄バッファーで15分間ずつ5回洗浄します。その後、PBSで1回洗浄。
- 静かに左側面を上に向けてガラスピペット、および配向固定幼虫を用いてガラススライドに幼虫を移します。キムワイプを使用して過剰のPBSを削除してください。取り付けメディアのドロップを追加します。マニキュアと、シールカバーガラス。すぐに共焦点イメージングを行うことは大いに推奨されます。
- 画像をキャプチャするために40X / 1.3オイルレンズを搭載した共焦点システムを使用してください。百分の20から50にレーザー強度を使用してください。 1ミクロン間隔でZスタック画像をキャプチャします。
アダルトゼブラフィッシュの6準備
- [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のセットアップ交配GT1。 Tgは：交配タンク内（Tp1とmCherryを）JH11] 15,17大人のゼブラフィッシュ。収穫は、システムの水に負担し、胚培地で100ミリメートルペトリ皿に胚を転送することにより、翌朝胚。
- ペトリ皿当たりのない100以上の胚を保管してください。実体顕微鏡下では、ガラスピペットを用いて、未受精卵を削除します。 28℃で胚を成長し、顔料の開発を阻害するために10 HPF後の0.003％の最終濃度にPTUを加えます。
- 4 DPFでは、幼虫を麻酔し、整理してトリカインを使用して、[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1; Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11]幼虫。新鮮胚培地を数回に変更することにより、トリカインを洗浄します。彼らは分18あたり120〜180拍の正常な心拍数を達成するまで、幼虫は28℃で回復させます。
- 標準的な手順19に基づいて、6-12ヶ月齢にソートされた幼虫を上げます。
アダルトゼブラフィッシュ7.エタノール、メトロニダゾール治療、および肝再生
- 6-12ヶ月齢[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）転送GT1を 。 Tgは：ネットを使用して、相手側のタンクへ（Tp1のmCherryを）JH11]大人のゼブラフィッシュ。タンクあたり10個以下の魚の密度で魚を保管してください。
- 1％の最終濃度になるようにシステム水にエタノールを添加することにより、新鮮なエタノール溶液を調製します。各タンク内の500ミリリットルのEtOH溶液で成魚を治療し、28℃のインキュベーターでそれらを維持します。
- 毎日新鮮なエタノール溶液への転送成魚、廃棄死んだ魚の小道具バイオハザードとしてerly。連続MTZ処理の前に72時間のために動物を扱います。
- 0.1％DMSO中にシステムの水に新鮮な10 mMのMTZ溶液を調製します。 28℃インキュベーターでMTZソリューションを事前に温めます。 28℃で8時間、1 L交差タンク内の500ミリリットルMTZ溶液で魚を扱い、アルミ箔を使用して、光から保護します。
- 治療中に毎時確認し、すぐに死んだ魚を削除します。バイオハザードとして適切に死んだ魚を捨てます。 MTZ処理の終了時に、二回新鮮なシステムの水に動物を転送することによりMTZを洗い流します。
- 動物は28℃のインキュベーター中で回復し、それらを維持することを可能にします。フィードおよび分析のための時点まで毎日新鮮なシステムの水に魚を移します。
8.アダルトゼブラフィッシュ肝臓固定、免疫染色、および共焦点イメージング
- 0.02％トリカインで大人の魚を麻酔し、15分間氷水中で安楽死させます。パット魚ペーパータオル上で乾燥し、解剖マットの上に置きます。
- 以前に20を説明したように皮膚や筋肉を除去することにより、胃腸の臓器を公開します。臀鰭に戻って後方魚の側面に沿って、その後蓋に臀鰭から腹に沿って皮膚とその下の筋肉をカットするはさみを使用し、。
- 15ミリリットルコニカルチューブに魚を入れ、PBSで1回洗浄。 PBSを削除し、4℃でO / Nを固定するために、PEM緩衝液中に新たに調製した2％のホルムアルデヒドの4ミリリットルを追加します。
- 適切溶液を固定捨て、そして室温でPBSで3回洗浄します。固定したサンプルは、数日間、4℃でPBS中に維持することができます。次のステップに進むには、すぐに優れた免疫染色の結果が得られます。
- 食道を切断することによって、魚の体腔からの肝臓と全体の腸を解剖。セク金型内の低融点アガロース4％と胃腸器官を埋め込みます。
- 前端から出発し、氷冷PBSで50μmの間隔で横断切片にサンプルをカットするためにビブラトームを使用してください。秒の転送＃1ペイントブラシを使用して、PBSで6ウェルプレートにション。
- 4℃でブロックバッファO / Nでの透過処理およびブロックセクション。
- 1の希釈でウサギ抗コラーゲンI抗体とインキュベート：ブロック・バッファ・O / Nで100 4℃。洗浄緩衝液で5回、各15分間洗浄します。
- 1の希釈でのAlexaFluor 647結合ロバ抗ウサギ抗体でインキュベートする：ブロックバッファO / Nで200 4℃。洗浄緩衝液で一度PBSで5回、各15分間洗浄します。
- 静か＃1ペイントブラシを使用してガラススライドにセクションを転送します。キムワイプを使用して過剰のPBSを取り外し、取り付けメディアのドロップを追加し、マニキュアでカバーガラスをシール。共焦点イメージングを行うことは、すぐに非常に示唆されています。
- 画像をキャプチャするために40X / 1.3オイルレンズを搭載した共焦点システムを使用してください。百分の20から50にレーザー強度を使用してください。 1ミクロン間隔でZスタック画像をキャプチャします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1は、幼虫のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発を示しています。 EtOH中にゼブラフィッシュの幼生を露出させるためのプロトコルを最適化するには、まずエタノールの毒性を評価しました。 2.5日 - 受精後（DPF）の幼虫をEtOH濃度1％、1.5％、または同時24時間のエタノール/ MTZ処理に続いて24時間2％を暴露しました。ほぼすべての幼虫が1％EtOHを以下にさらされながら、2％エタノールへの曝露は、高い死亡率の原因となった、コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質のまれな堆積と最小限の線維形成変化を示しました。これらの結果に基づいて、幼虫は、24時間（2.5〜3.5 DPF）とを同時に24時間（3.5〜4.5 DPF）（ 図1A）のためのMTZで処理するために、1.5％EtOHで前処理しました。エタノール/ MTZ-処理した幼虫は、トランクと尾の上向きの曲率、心膜浮腫、スイム膀胱を膨らませるの失敗など、形態異常を示しました。 （ 図1B）。我々エタノール/ MTZ-処理した幼虫の肝臓における線維形成変化を分析するために、3つのトランスジェニック系統を使用する：1） の Tg（fabp10a：CFP-NTR）GT1ラインは、肝細胞特異的fabp10aプロモーター 15の下にシアン蛍光タンパク質と融合NTR遺伝子を発現します。 2） のTg（Tp1は：mCherryを ）JH11ラインは、複数のRBP-を含むTP1モジュールの制御下にある式核mCherryを17、とのアクティブなNotchシグナル伝達（ノッチ応答性細胞、NRCS）や胆管上皮細胞（BECS）で細胞をマークしますJK-結合部位;および3） のTg（hand2：肝星細胞（HSC）13をラベルEGFP）PD24ライン 、。 DMSO処理対照[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11、Tg は（hand2：EGFP）PD24]肝臓をEtOH / MTのに対し、私は堆積4,6,9（ 図1C、C '）をコラーゲンない繊維状型を示しませんでしたZ-処理された肝臓は、私は25と50時間ポストアブレーション（HPA）（ 図1D、D '、E、E'）で蓄積コラーゲン高架タイプを表示しました。また、DMSO処理対照肝臓（ 図1C ''）と比較すると、HSCは（エタノール/ MTZ-処理された再生肝臓で失われた細胞質プロセスと筋線維芽細胞のような形状に星状の構成から変更された形態で数が増加しました図1D ''、E ''）。我々は、エタノール/ MTZ-処理された再生肝臓における25 HPAでmCherryを発現NRCSの2つの別個の集団を観察：赤NRCS（ 図1D '' '、インセット、白矢印 ）と明るい赤NRCS（ 図1Dを' ''薄暗い、インセット、黄色の矢印 ）。 50 HPAでは、肝細胞特異的CFPは、再生肝臓（ 図1E '' '、インセット、白矢印 ）を通じて薄暗いmCherryを発現とNRCSに共発現するようになりました。これらのCFPと薄暗いmCherryを-coexpressing NRCSは、CFP（ 図1E '' '、インセット、黄色矢印 ）に陰性である真っ赤NRCSから明らかに識別可能です。以前の研究では、肝細胞増殖を部分肝切除（PHxの）後に抑制された時、HPCのは、造血幹細胞21の同時増殖に拡大していることを示しました。また、HPCのとBECSは、組織化学的マーカー22を共有しました 。したがって、我々の結果は、CFPと薄暗いmCherryを共発現しているNRCSはノッチダウンレギュレーションに遭遇することにより、肝細胞への分化のHPCのゼブラフィッシュ・カウンターパートを描くことを示しています。 Notchシグナル伝達のより高いレベルを維持しNRCSはBECS 23分化した胆管細胞として残ることがあります。
図2は、大人のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発を示しています。まず、我々は、生存率を評価するために、1％、1.5％、または2％のEtOHに成体ゼブラフィッシュを露出しました。ほとんどの大人のゼブラフィッシュは、nました1％（未発表データ）よりも大きいエタノール濃度への曝露の以上72時間を生き残るオト。したがって、成人のゼブラフィッシュのために、我々は72時間、1％EtOHで魚を前処理し、MTZ処理（ 図2A）と続きます。時間経過分析を行うことにより、我々は、私は2、3でエタノール/ MTZ-処理された再生肝臓に沈着コラーゲン、および大幅に上昇したタイプを示した4日-ポストアブレーション（DPA）（ 図2C '、D'、E '） DMSO処理した肝臓（ 図2B '）と比較。幼虫で観察されたものと同様に、CFPと薄暗いmCherryを共発現する細胞は、12カ月齢[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のエタノール/ MTZ-処理された再生肝臓で検出されたGT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）3および4 DPA（ 図2D、E、インセット、白矢印 ）でJH11]成魚。これらのデータは、Notchシグナルに応答のHPCは、肝細胞として再生する能力を維持することを示しています大人のゼブラフィッシュにおける線維形成侮辱の存在。
図3は、幼虫のゼブラフィッシュにおける当社のエタノール誘発性線維症肝臓モデルを使用して、代表的な化学スクリーニング結果を示しています。線維性肝臓で肝細胞の再生を加速する生物活性化合物を特定するために、我々は、化学遺伝学的スクリーニングを行いました。 CFP：私たちは、[Tgは（fabp10aを使用して、十分に特徴付けられた生物学的および薬理活性を持つ75の小分子のライブラリー（化合物ライブラリを細胞シグナル伝達、Selleckchem幹）1,000あまり特徴付け小分子（ActiProbe-1K図書館、TimTec）のライブラリーをスクリーニングしました-NTR）GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11]幼虫。我々は、1.5％のEtOH / 15mMのMTZの存在下で肝細胞を切除され、その後50時間（ 図 3A）のための化合物の50μMに幼虫を露出しました。このようなSB 415286およびCHIR-990などのWntアゴニストの数図21は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3の阻害剤は、DMSO（ 図3B）と比較して、肝細胞の再生（ 図3C、D）を促進しました。また、[4-（1H-1,2,3,4- tetraazol -5-イル）-1,2,5-オキサジアゾール-3-イルアミン] HTOA、新規なWnt経路活性化物質と略記する、強化された肝細胞の再生に大きな再生された肝臓（ 図3E）によって示されるように線維性の肝臓。これらのデータは、当社の持続的な線維化モデルは、肝細胞の再生を増強する小分子を発見するための貴重なツールを提供することを示唆しています。
幼虫のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの図1.開発。幼虫に線維化肝臓モデルを確立するためのエタノールおよびエタノール/ MTZ治療の期間を示す（A）スキーム。 （B）50時間ポストアブレーション（HPA）、エタノール/ MTZ-扱わリットルでアルバルゼブラフィッシュは、トランクと尾の上向きの曲率、心膜浮腫、および浮き袋を膨らませるの失敗など、形態異常を開発しました。 [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）の肝臓で（CC '' '）GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11、Tg は（hand2：EGFP）DMSOで処理したPD24]の幼虫は、ECMタンパク質コラーゲン1aは（C、C '）はほとんど検出されなかったと静止造血幹細胞は、星状の構成（Cを示した' '）、一方、肝細胞（C、C '' '、挿入図 ）の間に分散NRCS。 （DE '' '）（、E、E'のEtOH / MTZ-処理した幼虫の肝臓において、上昇したコラーゲン1aの堆積はD、D）が観察されました」。造血幹細胞の数が増加し、複雑な細胞質突起（D ''、E ''を ）失いました。 25 HPAでは、mCherryを発現NRCS、2つの異なる集団から構成されています。 '（' '、インセット白矢印は暗赤色NRCS D）を示しているのに対し、（ 挿入図の黄色矢じりは明るい赤NRCS D'を'）'を示しています。 50 HPAでは、Tgは（fabp10a：CFP-NTR）及びTg（Tp1は：mCherryを）明るい赤NRCSはないCFP発現がなかった共発現する細胞は、再生肝臓（E '' '、インセット、白矢印 ）を通じて新興開始しました（E '' '、インセット、黄色の矢印 ）。すべての共焦点画像は、投影画像であるC '、D'、E ''を除いて、単一の平面画像です 。スケールバー：B、100ミクロン; CE '' '、20μmです。エタノール、エタノール; MTZ、メトロニダゾール; HPA、時間ポストアブレーション。 DPF、日、受精後。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
大人のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの図2.開発。大人に線維化肝臓モデルを確立するためのエタノールとMTZ治療の期間を示す（A）スキーム。 '（し、EtOH / MTZ-処理した（CE'）大人のゼブラフィッシュの肝臓：：、Tgは（Tp1の mCherryを）、およびDMSO-BおよびB）のビブラトーム切片中のコラーゲン1aの発現のTg（CFP-NTR fabp10a）（BE）」。無Tgを有する（BB '）DMSO処理した対照では、コラーゲン1aは、（Bほとんど検出されなかった'）（fabp10a：CFP-NTR）及びTg（Tp1は：mCherryを）同時発現している細胞（B）。 （CE '）のEtOH / MTZ処置再生肝臓において、コラーゲン1aの沈着が顕著2で昇温し、3、及び4 DPA（C'で、D '、E'）3と4 DPA（D、E、インセット、白矢印 ）で同時発現している細胞：及びTg（mCherryをTp1の ）：Tgは（CFP-NTR fabp10a）の人口。真っ赤NRCSにはCFP式（D、E、インセット、黄色矢じり）を持っていません。、共焦点単一平面画像。B'-E '、共焦点投影像BE。スケールバーは20μm。エタノール、エタノール; MTZ、メトロニダゾール; DPAは、日・ポストアブレーション。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
線維性肝臓における肝細胞の再生画面については、 図幼虫のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルを使用して3.代表的な化学スクリーニング結果。（A）スキーム。既知および新規のWnt（BE）活性化剤は、線維症、肝臓における肝細胞の再生を増強します。 DMSO（B）、SB415286（C）、CHIR-99021（で投与した幼虫：;：[JH11のTg（mCherryをTp1の ）GT1 のTg（CFP-NTR fabp10a）]でエタノール/ MTZ-処理された肝臓の共焦点の突起D）、またはHTOAと略記する新規なWnt活性化剤[4-（1H-1,2,3,4- tetraazol -5-イル）-1,2,5-オキサジアゾール-3-イルアミン（）（E）。 SB415286およびCHIR-99021は、合成酵素キナーゼ-3阻害剤をグリコーゲンされています。すべての画像は、共焦点投影画像です。スケールバーは20μm。エタノール、エタノール; MTZ、メトロニダゾール; HPA、時間ポストアブレーション。 DPF、日、受精後。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
私たちも、私はコラーゲン線維状の型を含むECMタンパク質の実質的な量の存在下では、HPCのが肝細胞として再生するために自分の能力を保持していることを示唆し、エタノール/ MTZ-扱わ回復肝臓におけるHPC媒介肝細胞の再生を観察しました。エタノールのみ処理はHPCの活性化15を誘導しなかったMTZのみ処理は、大幅にECMタンパク質の沈着を増加させませんでした。合わせたエタノール/ MTZ処理を利用することにより、我々は線維性肝臓でHPC-駆動再生を調査することができました。肝細胞のほぼ完全な除去はHPC-駆動肝細胞の再生を誘発するように、クラスタ化されたNRCSにより肝細胞特異的蛍光の欠如の基準に基づいてMTZ処理した幼虫と大幅に減少肝体積を整理することが重要です。動物は自由に飲んだりintragaを必要とすることを可能にする必要がないように魚では、鰓や皮膚の血管は、アルコール24を吸収します哺乳動物のモデルのようにstric注入。私たちは水を循環させることなく、別々のタンクでEtOH-、その後のMTZ処理された成魚を収容しました。毎日新鮮なエタノール溶液に魚を転送し、EtOHの蒸発を最小限にするために蓋を保つために不可欠です。 48〜72時間のエタノール/ MTZ処理が効率的に我々のプロトコルにおいてECMタンパク質の合成を誘導するが、高度な線維症や肝硬変のいずれも、これらの魚に開発されました。したがって、エタノールの長期暴露のような12週間の治療14とMTZの組み合わせは、特に成魚で、適切にシミュレートし、慢性肝不全におけるHPC-駆動再生を調べるために、より深刻な肝臓障害を誘発する可能性があります。
ゼブラフィッシュは、その小さなサイズ、大きな子孫、透明性、および小分子25に対する透過性をin vivoでの化合物試験のための優れた動物モデルとして機能します。ゼブラフィッシュにおける線維性肝臓モデルを使用して、我々は、既知および新規のWnt ACTIの数を同定しvatorsと肝細胞の再生15を加速ノッチ阻害剤。我々の現在の蛍光ベースの化学スクリーニングプロトコルは、すべての化学物質の準備、24ウェルプレートにエタノールで処理した/肝切除された幼虫を転送する、化学物質の治療、および肝細胞の再生に対する化学物質の影響の分析を含む手動で実行いくつかのステップがあります。これは、特に面倒で時間がかかり、個々の動物のための画像をキャプチャする落射蛍光または共焦点顕微鏡を使用します。自動的に処理し、定量的なデータ収集と組み合わせて、ゼブラフィッシュの細胞分解能イメージングを取得するハイスループットプラットフォームは、化学物質の濃度の範囲を決定する自動化された薬剤投与システムと組み合わせた場合に26,27。これらの機能が強化される大規模なスクリーニングを容易にします28、肝細胞の再生を増強するための最大の効力と最小毒性を与えることができます。これらlimitaにもかかわらず、肝臓ション、のような多くの重要なプレーヤー、主な細胞型は、インビボで慢性肝疾患のための新規治療戦略の有効な発見を触媒するゼブラフィッシュ線維肝臓モデルを用いたスクリーニング小分子をベース用いて、ゼブラフィッシュおよび哺乳29との間で保存されています。
二つの追加のグループは独立して胆管細胞、完全に分化BECSは、主にゼブラフィッシュでNRCS / BECSを含むことが線維形成性傷害のない肝細胞のほぼ完全な損失の後、BECSが前提と脱分化30,31の工程を経て肝細胞へ分化転換することを実証しました。分化転換は、肝細胞の再生を駆動する機構の一つであってもよいが、我々の結果は、ゼブラフィッシュの肝臓32にBECSの大部分を構成することが知られているのHPCは、肝細胞に分化するNotch活性をダウンレギュレートすることを示しています。一方、その目を推測することはもっともらしいです電子完全に分化BECS、胆管細胞、再生時の肝細胞に変換することなく、Notch活性の高いレベルを維持します。以前に13を報告したように興味深いことに、エタノールの存在下で、我々はHSCが失われた細胞質プロセスと筋線維芽細胞のような形状に星状の構成から変更された形態で数が増加していることがわかりました。 ECMタンパク質の合成によって特徴付けられる活性化されたHSCは、肝臓の修復4の統合プロセス中に異常な創傷治癒のための責任の原則犯人です。慢性傷害は、多くの場合、再生のための肝臓の驚くべき能力をオーバーライドしますが、移植のHPCが正常線維症/肝硬変ラットの肝臓33を再増殖しました。したがって、私たちのゼブラフィッシュ線維性肝臓モデルはHPC媒介肝細胞の再生に対する持続的な線維症の効果を媒介する分子・細胞メカニズムを解明するための不可欠なツールとなります。さらに、多細胞Cを定義します私たちのゼブラフィッシュ線維性肝臓モデルを利用することにより、再生および線維症をバランスrosstalkはさらに、in vivoで慢性肝不全のための実行可能な治療戦略を設計することが容易になります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品は、私たちは、原稿の重要な読書のためのアレムGiorgisに感謝CHSにGTEC（2731336および1411318）、NIH（K01DK081351）、およびNSF（1354837）からの助成金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K.
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L.
- Bataller, R., Brenner, D. A.
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P.
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
