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Bioengineering

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Published: May 5, 2016 doi: 10.3791/54010
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco

Introduction

Tröpfchen Mikrofluidik eine Plattform für einen hohen Durchsatz biology von 1 in einem Trägeröl suspendiert Experimente in einer Vielzahl von wässrigen Tröpfchen Kompartimentierung. Droplets sind für Anwendungen als Einzelzellanalyse 2, digitale Polymerase - Kettenreaktion (PCR) 3, wie variiert verwendet worden und Enzym Evolution 4. Fluoreszierende Assays sind die Standard-Erfassungsmodus für Tröpfchen Mikrofluidik, als ihre helle Signale und schnelle Zeitverhalten kompatibel sind mit Sub-Nanoliter Tropfenvolumen bei Kilohertz Raten zu erfassen. Viele Anwendungen erfordern Fluoreszenzdetektion, um gleichzeitig mindestens zwei Farben. Zum Beispiel unserem Labor führt häufig Tröpfchensortierexperimente-PCR aktiviert , die ein Detektionskanal für das Ergebnis eines Assays zu verwenden, und verwendet eine Sekundärhintergrundfarbstoff Assay negative Tröpfchen zählbaren 5 zu machen.

Typische Nachweisstationen für Tröpfchen Mikrofluidik sind based auf Epifluoreszenz- Mikroskope und erfordern Licht Manipulationen Systeme kompliziert Anregungslicht von freien Raum Laser in Mikroskop eingeführt werden, die Probe fokussiert werden. Nach Fluoreszenz von einem Tröpfchen abgegeben wird, wird das emittierte fluoreszierte Licht gefiltert, so daß jeder Detektionskanal eine Photovervielfacherröhre (PMT) auf einem Wellenlängenband zentriert verwendet. Epifluoreszenzmikroskop basierte optische Detektionssysteme bieten eine Zutrittsschranke aufgrund ihrer Kosten, die Komplexität und die erforderliche Wartung. Optische Fasern liefern die Mittel eine vereinfachte und robuste Detektionsschema zu konstruieren, da Fasern manuell in mikrofluidischen Vorrichtungen eingesetzt werden, wodurch die Notwendigkeit für spiegelbasierte Lichtführung zu entfernen und so dass Lichtwege unter Verwendung von Lichtwellenleiterverbindern angeschlossen zu werden.

In diesem Dokument beschreiben wir die Montage und Validierung eines kompakten und modularen Schema Mehrfarbenfluoreszenzdetektion durchzuführen, indem eine Anordnung von optischen Fasern eine Verwendungda einzelne Photodetektor 6. Lichtleitfasern sind mit individuellen Lasern und eingesetzt sind senkrecht zu einer L-förmigen Strömungskanal in regelmäßigen räumlichen Offsets. Ein Fluoreszenzsammelfaser wird an die Anregungsbereiche parallel orientiert und an einem einzigen PMT verbunden. Weil ein Tröpfchen zu unterschiedlichen Zeiten den Laserstrahlen durchläuft, durch den PMT aufgezeichneten Daten zeigt einen zeitlichen Versatz, dass der Benutzer zwischen der emittierten Fluoreszenz zu unterscheiden erlaubt, nachdem die Tröpfchen durch jede einzelne Laserstrahl angeregt wird. Diese zeitliche Verschiebung eliminiert die Notwendigkeit emittierte Licht zu trennen PMTs zu trennen, um eine Reihe von dichroitische Spiegel und Bandpassfilter verwendet wird. Um die Wirksamkeit des Detektors zu validieren, zu quantifizieren wir Fluoreszenz in Tröpfchenpopulationen Farbstoffe unterschiedlicher Farbe und Konzentration einkapselt. Die Empfindlichkeit des Systems wird für einfarbige Fluorescein Detektion untersucht und zeigt die Fähigkeit Tröpfchen mit Konzentrationen zu detektieren bis zu 0,1 nm, eine 200x Empfindlichkeit improvement im Vergleich zu bisherigen Vorgehensweisen auf Faserbasis 7 in der Literatur berichtet.

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Protocol

1. SU8 Meister Fabrication

  1. Entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen für drei Schichtherstellungs Design-Software verwenden und die Entwürfe von einem Lieferanten auf der Leiterplatte Folie gedruckt mit 10 & mgr; m Auflösung. Die Details der Gerätedesign sind in einem angeschlossenen Referenz 6 und die Kanalgeometrien sind in Abbildung 1 gezeigt , gegeben. Die Schichten sollten Ausrichtungsmarken sind auf Merkmale 8 von jeder Herstellungsschicht helfen collocate.
  2. Legen Sie eine vorgereinigte 3 Zoll Durchmesser Silizium-Wafer auf einem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 Sekunden bei 1.750 Umdrehungen pro Minute, mit einer Schichtdicke von 80 & mgr; m bereitstellt.
  3. Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt weitergehen.
  4. Setzen Sie die beschichtete Wafer auf der 1. Schicht Maske unter einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung Stellen Sie den Wafer auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  5. Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 sec bei 5000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 40 um liefert.
  6. Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen.
  7. Richten Sie die 2. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 4 min 30 sec, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  8. Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30sec bei 1000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 100 um bereitstellt.
  9. Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen.
  10. Richten Sie die 3. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 9 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  11. Entwickeln der Masken durch in ein gerührtes Bad aus Propylenglykolmonomethylether-acetat während 30 min eingetaucht wird. Waschen Sie die Wafer in Isopropanol und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min. Platzieren Sie den entwickelten Master in einer 100 mm Petrischale für Polydimethylsiloxan (PDMS) Formen.

2. PDMS Gerätefertigung

  1. Bereiten Sie 10: 1 PDMS von 50 g Silikonbasis kombiniert mit 5 g Mittel in einem Plastikbecher zu heilen. Mischen Sie den Inhalt mit einem Drehwerkzeug mit einem Rührstab ausgestattet. Degals Gemisch in einem Exsikkator für 30 Minuten, oder bis alle Luftblasen entfernt werden.
  2. Gießen Sie die PDMS mit einer Dicke von 3 mm über dem Master zu geben und zurück in den Exsikkator zur weiteren Entgasung. Sobald alle Blasen entfernt werden, backen das Gerät bei 80 ° C für 80 min.
  3. Schneiden Sie das Gerät aus der Form mit einem Skalpell und auf eine saubere Oberfläche mit der strukturierten Seite nach oben und Punsch die fluidische und -auslässe mit einer 0,75 mm Biopsie Stempel verwenden. Das Gerät ist so geschnitten werden, dass die 120 & mgr; m und 220 & mgr; m groß Geometrien von der Seite der Vorrichtung zugänglich sind.
  4. Plasma behandeln Sie das Gerät, mit Feature - Seite nach oben, zusammen mit einer vorgereinigte 2 Zoll von 3 Zoll Glasträger bei 1 mbar O 2 Plasma für 20 Sekunden in einem 300 W Plasma - Reiniger. Bond, die PDMS-Gerät von der strukturierten Seite der PDMS Vorrichtung auf die plasmabehandelte Seite der Glasobjektträger platziert. Stellen Sie das Gerät in einem 80 ° C Ofen und backen Sie die zusammengebauten Vorrichtung für 40 min.
  5. Machen Sie die Kanälehydrophob durch eine Spritze unter Verwendung der Vorrichtung mit einer fluorierten Oberflächenbehandlungsfluid zu spülen. Unmittelbar backen das Gerät bei 80 ° C für 10 min, das Lösungsmittel zu verdampfen.

3. Herstellung von optischen Komponenten

  1. Bereiten Sie die Laseranregung Faser, die durch die Isolierung von der letzten 5 mm von einer 105 & mgr; m-Kern, 125 um Mantel zu entfernen, NA = 0,22 optischen Faser.
  2. Bereiten Sie die 2. Farbe Laseranregung Faser um 3,1 für eine 2. identische Faser zu wiederholen.
  3. Bereiten Sie die Faser zum Sammeln des Fluoreszenzsignals von 3,1 für einen 200 & mgr; m-Kern, 225 & mgr; m Mantel wiederholen, NA = 0,39 optische Faser.
  4. Überprüfen Sie die Spitzen aller Fasern - wenn die Spitzen in einer flachen Oberfläche nicht zu Ende, wieder spalten die Enden mit einem Faserschreiber.
  5. Bringen Sie einen Laser-Faserkoppler mit einem 50 mW, 405 nm Laser und befestigen Sie eine der 105 & mgr; m Kernfasern an den Laser. Richten Sie das abisolierte Ende am Sensor der LaserleistungMeter, und die Feinjustierung des Lasers Koppler verwenden, um die Laserleistung zu maximieren.
  6. Wiederholen 3.5 für eine 50 mW, 473 nm-Laser.
  7. Montieren Sie einen 446/510/581/703 nm Quad-Bandpassfilter auf der PMT Linse Röhren mit Laserlicht zu blockieren und emittiert Fluoreszenz übertragen. Bringen Sie Faserkoppler, so dass Licht den Filter durchläuft, bevor die PMT zu schlagen.
  8. Bringen Sie die Faser von 3,3 auf der montierten Einheit in 3.7.

4. Offline-Mischemulsion-Generation

  1. Besorgen Sie sich einen Strömungs Fokus Mikrofluidik dropmaker Gerät mit einem 60 & mgr; m × 60 & mgr; m Öffnung.
  2. Füllen Sie eine 1 - ml - Spritze mit HFE 7500 Ölen mit 2% ionisches Fluortensid 9.
  3. Füllen einer Reihe von 1 ml Spritzen mit den folgenden Kombinationen von Fluorescein (FITC) und Dextran-konjugiertes blaue Farbstoffe (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB und 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. Montieren Sie die dropmaker Gerät auf der Bühne eines invertierten Microsbewältigen und die wässrigen und Öl Spritzen auf Spritzenpumpen. Paar die Spritzen an die Geräte PE-2 Schläuche verwenden.
  5. Laufspritzenpumpen bei 500 & mgr; l / h für die Öl- und 250 & mgr; l / h für die wässrigen Lösungen, erstellen einer Mischung aus 80 & mgr; m-Tröpfchen, die Lösungen von 4,3 enthält. Für jede Art von wässrigen Probe, mit einem frischen dropmaker Gerät eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Sammeln Sie ~ 200 & mgr; l Emulsion aus jeder Farbstoffkombination in eine leere Spritze.
  6. Nachdem die vier Tröpfchen Typen haben in einer einzigen Sammlung Spritze, mischen die Emulsion durch mehrmaliges Drehen der Spritze gesammelt.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,6 mit wässrigen Lösungen, die 0,1, 1, 10 und 100 nM FITC in PBS.

5. Optical Fiber Insertion

  1. Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip hergestellt in Schritt 2 auf der Stufe eines inversen Mikroskops gekoppelt mit einer digitalen Kamera in der Lage von <100 & mgr; s Verschlusszeiten.
  2. Arbeiten sorgfältig von der Seite, insert die Faser mit dem 473-nm-Laser in die am weitesten vorgelagerten 120 & mgr; m Kanal gekoppelt, dabei nicht bis zur Hauptströmungskanal zu durchstechen.
  3. Legen Sie die Faser mit dem 405-nm-Laser in die am weitesten stromabwärts 120 & mgr; m hohen Seitenkanal und bietet Faserabstand von 300 & mgr; m.
  4. Legen Sie die PMT-gekoppelten Faser in den 220 & mgr; m groß Kanal senkrecht zu den beiden Laseranregungsfasern.

6. Fluoreszenzdetektion von gemischten Emulsionen

  1. Halterung eine 5 ml Spritze mit HFE 7500 mit 2% ionisches Fluortensid mit dem Spacer Öleinlaß der Detektionseinrichtung mit PE-2 Schlauch gefüllt.
  2. Montieren Sie die Spritze mit dem gemischten FITC / CB-Emulsion auf einem vertikal ausgerichteten Spritzenpumpe und koppeln an das Gerät des Tröpfchens reinjection Einlass mit PE-2 Schläuche enthalten. Schließen Sie eine Länge von PE-2 Schlauch aus dem Gerät Ausgang in einen Abfallbehälter.
  3. Prime das Gerät von jeder der Pumpen bei 1000 & mgr; l / h, bis beide LaufÖl und Tröpfchen werden zu sehen regelmäßig in dem Gerät und fließt stromabwärts kombiniert werden.
  4. Stellen Sie die Durchflussraten, so dass das Abstands Öl läuft bei 6.000 & mgr; l / h und die Tröpfchen bei 100 & mgr; l / h und bietet erhebliche Abstand zwischen den Tröpfchen durch den Detektionsbereich reisen.
  5. Schalten Sie den Laser, das Datenerfassungsprogramm zu starten, und stellen Sie die PMT-Verstärkung um Signale zu liefern, die mehr sind als das Grundrauschen Boden 100x. Stellen Sie die Laserleistung so, dass alle der Dublett Peaks auf einem einzelnen, linear skaliert Timetrace deutlich sichtbar sind.
  6. Erwerben Sie 60 Sekunden der PMT-Spannung Timetrace bei mindestens 20 kHz. Importieren Sie die Daten in Rechenprogramm wie Matlab und messen die Höhen der Spitzen der aufgenommenen Dubletten das benutzerdefinierte Berechnungsprogramm Skript.
    Hinweis: Dies wird als zusätzliche Information zur Verfügung gestellt.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 6,2-6,7 die FITC-nur gemischte Emulsion in 4.7 erstellt wurden, mit der 405-nm-Laser ausgeschaltet.

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Representative Results

Herstellung eines PDMS - Gerät , das für das Einsetzen von optischen Fasern ermöglicht , erfordert ein mehrstufiges photolithographischen Verfahren zu schaffen Kanäle unterschiedlicher Höhe (Abbildung 1). Zuerst wird eine 80 um hohe Schicht aus SU-8 wird auf einen Siliziumwafer versponnen und strukturiert, um eine Maske mit dem Fluidhandhabungs Geometrie zu schaffen. Als nächstes wird eine weitere 40 & mgr; m Schicht aus SU-8 auf den Wafer gesponnen und strukturiert, um eine zweite Maske unter Verwendung von Merkmalen zu erzeugen, die 120 & mgr; m groß Laserfaser Einführungskanäle bilden. Last 100 um mehr SU-8 auf den Wafer gesponnen und gemusterten Kanäle 220 um tall Detektions Fasereinsteckloch zu geben. Der Master wird entwickelt und verwendet, um ein PDMS-Gerät zu formen, die an einen Glasobjektträger geklebt wiederum. Die endgültige Herstellung enthält 80 & mgr; m hohen Strömungsgeometrie, Durchkontaktierungslöcher zugegriffen in der Oberseite der Vorrichtung ausgestanzt und 120 & mgr; m und 220 & mgr; m groß optische Faserkanäle durch die Seite der abgerufenenGerät.

Die Geometrie der Vorrichtung zur Detektion verwendet wird in Abbildung 2 dargestellt. Extern erzeugte 80 um Emulsionen werden reinjiziert in einen Drop - Port und Reinjektion durch Abstandsöl beabstandet , bevor sie eine L - Form Detektionskanal strömen. Zwei Laser-gekoppelten Fasern eingesetzt sind, in 120 & mgr; m groß Kanäle Anregung bei diskreten räumlichen Orten in dem Strömungskanal bereitzustellen. Da die Multimode-Fasern eingesetzt in diese Kanäle haben eine 125 & mgr; m Außendurchmesser und einen Kerndurchmesser 105 & mgr; m, der gesamte Querschnitt des Strömungskanals wird durch Laserlicht beleuchtet. In unserem Gerät macht die Detektionsströmungskanal einen abrupten 90-Grad-Kurve nach dem letzten Bereich Laseranregung der Nähe optischen Zugang für eine 225 & mgr; m OD Faser zu schaffen verwendet, um emittierte Fluoreszenz zu erkennen. Je größer Faser wird verwendet wegen seiner hohen numerischen Apertur (NA = 0,39), die auf einem Standard-Mikroskopobjektiv ähnlich ist.

Ein Tröpfchen durch den Detektionskanal fließt trifft diskreten Anregungsbereiche vor jedem der Laser gekoppelten optischen Fasern (3A). Die einzelnen PMT gekoppelt mit den Detektionsfaser Aufzeichnungen emittierten Fluoreszenz mit einer zeitlichen Verschiebung die Karten zu der Anregungsquelle. Für ein Tröpfchen , die Farbstoffe , die bei 473 nm (Bereich "1" in 3A) erregt und bei 405 nm (Bereich "2" in 3B), die sich ergebende PMT - Signal enthält ein Signal Dublett mit einer Spitzentrennung enthält , die mit dem korreliert Zeit, die ein Tröpfchen aus einem Anregungsbereich zu dem nächsten zu bewegen. Durch zeitliches spektralen Daten auf diese Weise codiert, die Notwendigkeit für weitere Lichtfilterung und separaten PMTs für jeden Fluorophor Farbe beseitigt wird . 3B zeigt Signal Dubletts für einen Zug von 4 Tropfen mit unterschiedlichen Farbstoffkombinationen. Der erste Peak in der Doppel entsprechens auf die Fluoreszenz nach Anregung mit dem 473-nm-Laser in Bereich "1" ausgesendet und der zweite Peak entspricht der 405-nm-Laser in Bereich "2" nach der Anregung emittierten Fluoreszenz.

Die Wirksamkeit des Detektionsschema wurde durch Detektieren einer gemischten Emulsion von Tröpfchen getestet Farbstoffe enthalten, die bei 405 nm (Dextran-konjugiertes blau, CB) und bei 473 nm (Fluoreszein, FITC) erregen. Tröpfchen wurden bei etwa 50 Hz durch die Erfassungsbereiche floß und die Daten wurden für 60 Sekunden aufgezeichnet werden, dann mit einem Rechenprogramm Skript nachbearbeitet. Die Daten sind in Figur 4 aufgetragen , und zeigt eine klare Trennung zwischen den vier reinjiziert Tröpfchentypen. Weil das Erfassungssystem zwischen verschiedenen Farben des emittierten Lichts unterscheidet nicht, wird jedes Tröpfchen durch seine maximale Gesamtfluoreszenz beschrieben, nachdem in Region erregt wird "1" (Peak 1) und in Region 2 (Peak 2).

(Abbildung 5). Die Daten zeigen die Fähigkeit der Farbstoffkonzentration, die von 0,1 bis 100 nM FITC auf einem einzigen Detektor mit den gleichen Erkennungseinstellungen Bereich zu erfassen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Multi-Layer - Photolithographie. Die Mikrofluidik-Vorrichtung wird hergestellt, indem ein Master mit drei unterschiedlichen Merkmalshöhen zu schaffen. Zuerst wird eine 80 um hohe Schicht aus SU-8 wird aufgeschleudert und unter Verwendung einer Maske für die Fluidkanäle strukturiert. Als nächstes 40 um mehr SU-8 wird aufgeschleudert und 120 & mgr; m groß Funktionen mit einem 2 gemustert sind nd durch beide Schichten SU-8 Maskengeometrie zu ergeben 125 & mgr; m groß Lichtleitfasern aufzunehmen. Danach wird 100 & mgr; m mehr SU-8 aufgeschleudert und mit einer 3 rd Maske strukturiert 225 & mgr; m groß Eigenschaften zu erhalten. Nach dem Entwickeln PDMS Formen und Plasma - Bindung an Glas, enthält das resultierende Gerät große Kanäle von der Seite zugänglich für Fasereinführung, zusätzlich zu den Standard geschlossenen Fluidkanäle. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Geräte - Design und optische Layout. Die fluidischen Teile der Vorrichtung bestehen aus einem Tröpfchen reinjector besteht und einem Öl Spacer, der mit einem L-förmigen Kanal. Fasern gekoppelt einzelnen Laser werden in Strömungsrichtung eingefügt normal. Eine Detektionsfaser senkrecht zu den Laserfasern eingesetzt, um Fluoreszenzlicht zu sammeln. Dieses Licht wird durch ab gefiltertandpass Filter, bevor sie von einem einzigen PMT entdeckt zu werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Zeitlicher Codierung von mehrfarbigen Informationen. (A) Droplets fließen durch Anregungsbereiche "1" und "2" zu verschiedenen Zeitpunkten, Zeitverschiebung , vorausgesetzt die Identifizierung des emittierten Lichts erlaubt. (B) von einem Zug von 4 verschiedenen Tröpfchen durch den Detektionskanal fließt. Der erste Peak jedes Dublett entspricht der Fluoreszenz nach Anregung in dem Bereich "1" ausgesendet und die zweite Spitze in jedem Doppel entspricht der Fluoreszenz nach Anregung in dem Bereich "2" ausgegeben. Die Höhe des Tropfenspitzen proportional der Menge an Farbstoff im angeregten agegebenen Wellenlänge, mit der Ausnahme, wenn spektrale Ausbluten mit überlappenden Anregungsspektren auf die Verwendung von Farbstoffen durch. Die Breite der Spitzen , die durch die Höhe der Zeit bestimmt werden , dass es ein Tröpfchen nimmt einen Anregungsbereich zu durchqueren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Multicolor Detektion eines gemischten Tröpfchenpopulation. Streudiagramm zeigt maximale Tröpfchenintensitäten für eine gemischte Tröpfchenpopulation nach Anregung und Emission durch einen 473-nm-Laser (Peak 1) und einem 405 nm-Laser (Peak 2). Die Tröpfchen enthalten Kombinationen von Fluorescein (FITC) und Kaskaden blau (CB) in nM - Konzentrationen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version davon zu sehenZahl.

Abbildung 5
Abbildung 5. Einzelfarberkennung auf sehr unterschiedlichen Tröpfchen Bevölkerung. Histogramm der Emissionen durch eine gemischte Tröpfchenpopulation von 0,1 bis 100 nM Fluorescein nach Anregung durch einen 473 - nm - Laser enthalten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

LWL-Erkennung erfordert die Ausrichtung der optischen Fasern in Bezug auf Fluidkanäle. Da unser Gerät Führungskanäle hergestellt mit mehrschichtigen Photolithographie verwendet, die Platzierung von Masken in Bezug zueinander ist von großer Bedeutung. Wenn die Faserleitkanäle zu nahe an der Fluidkanal sind, gibt es ein Potential für eine Fluidleckage; wenn die Führungskanäle zu weit entfernt oder falsch ausgerichtet angeordnet sind, kann das Fluoreszenzsignal von der Detektionsfaser gesammelt werden deutlich vermindert. Die richtige Ausrichtung kann durch die Gestaltung Ausrichtungsmarkierungen, wie konzentrische Kreise in Masken unterstützt werden, während der Fotostrukturierungs gemeinsam angeordnet werden. Zusätzlich manuelles Einlegen von Faseroptik in das Gerät ist ein heikler Prozess mit dem Potenzial, die Spitzen der Fasern innerhalb der Vorrichtung zu brechen, sie unbrauchbar zu machen. Fesselung Faser gegen den Glasobjektträger mit dem PDMS-Gerät verbunden ist und die Fasern langsam Einsetzen, während sie mit dem Mikroskop beobachtet werden Tasten successful Fasereinführung. Schließlich Reinjektion von vorgeformten Emulsionen sollten mit einem Minimum an Handhabung auftreten. Im Idealfall, wenn die Emulsion hergestellt wird und direkt in eine leere Spritze aufgebracht, sollte sie nicht übertragen werden, bis es zur Tropfen Reinjektion verwendet wird.

Mehrfarbenerkennung erfordert, dass die Spitzen in einem Signal Dublett verschieden voneinander sein können und dass Signale von aufeinanderfolgenden Tröpfchen nicht überlappen. Die Erfassungsaufbau, die wir hier verwenden, verwendet ein Paar von 125 um optische Fasern in einem Mitte-zu-Mitte-Abstand von 300 & mgr; m getrennt sind, einen nicht beleuchteten Bereich von ~ 175 & mgr; m zwischen Anregung Regionen bereitstellt. Dies ermöglicht eine 80 um Tröpfchen zu einem Zeitpunkt nur von einer Lichtquelle angeregt zu werden, und stellt sicher, dass jede der Spitzen in einem Dublett ausschließlich eine Folge eines Typs von Laseranregung ist. Konstruktionen, bei denen die Trennung zwischen den Anregungsbereichen ähnlich dem Tröpfchendurchmesser geben problematische Signale mit überlappenden Emissionsspitze Dubletten. Ter Breite eines Signals Dublett zu der Zeit korreliert, dass es für die Vorderkante eines Tropfens nimmt die erste Erregungsregionen auf die Zeit, die Hinterkante des Tröpfchens einzugeben, um die endgültige Anregungsbereich, einen Abstand von ~ 500 & mgr; m in der zu verlassen Gerät beschreiben wir. Um die Unterscheidbarkeit von benachbarten detektierten Tröpfchen zu erhalten, müssen Signal Dubletts durch einen niedrigen Signalbereich mindestens so breit wie das Signal Dublett beabstandet sind. Für die hier beschriebene Konfiguration, 80 & mgr; m Tröpfchen wenigstens 1 mm voneinander beabstandet sind.

Obwohl Mehrfarbenerkennung mit einem einzigen Photodetektor zum erhebliche Einsparungen in Bezug auf die Kosten und die Komplexität im Vergleich zu Standardtechniken ermöglicht, besteht ein gewisser Verlust an Robustheit, da emittiertes Licht nicht von der Wellenlänge gefiltert wird. Dies kann problematisch sein, wenn Tröpfchen Erfassungs die mehrere Fluorophore enthalten, die bei den gleichen Wellenlängen anzuregen, da die Fluoreszenzquelle nicht zu unterscheiden ist. Diese Einschränkungen können overc seinome durch Experimente mit nicht überlappenden Anregungsprofile durchgeführt werden oder durch Experimente entwerfen, wo bluten über spectral tritt nicht in einen "Kanal", wo ein empfindlicher Test durchgeführt wird. Dies ist kompatibel mit vielen Tröpfchen mikrofluidischen Detektionsanwendungen, wo ein heller Hintergrund Farbstoff verwendet wird , das Vorhandensein eines Tropfens , um anzuzeigen, und ein zweites Fluorophor verwendet wird , um das Ergebnis eines Assays Molekularbiologie 10,11 zu melden.

Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken, unser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile: 1) räumlich registriert Anregung Regionen die Notwendigkeit für komplizierte Lichtfilterung zu beseitigen, und 2) die Verwendung von Faseroptik entfernt die Anforderungen für ein Mikroskop und optische Hardware, um Licht. Da wir gemeinsame technische Belange mit mikrofluidischen Detektionssysteme adressieren, haben frühere Forscher Methoden entwickelt, ähnliche Bedenken auszuräumen. Zum Beispiel Martini et al. Frequenz kodieren mehrfarbige Fluoreszenz aufgezeichnetdurch einen einzigen Detektor durch eine Anregungsquelle durch eindeutig strukturiert "Strichcode" Projizieren Filter 12. Unsere Verwendung eines optischen Faseranordnung ermöglicht die Verwendung eines ähnlichen Schema zeitlichen Codierung unter Verwendung von Standard, Komponenten aus dem Regal. Die Literatur zeigt optische zahlreiche optische Kopplungstechniken, die mehr gesteuert werden, dass die einfache Fasereinführung, die wir beschreiben. Bliss et al. Flüssigkeit gefüllt Lichtwellenleiter für die sorgfältig kontrollierte Lieferung und Sammlung von Licht , das von bestimmten Mikrokanalstellen 13, Martinez Vasquez et al. Achten Sie auf Wellenleiter - Laser in Quarzglas Substrate geätzt Anregungslicht 14 und Vishnubhatla et al liefern. Sind können präzise Ätzung 15 Fasereinführungskanälen unter Verwendung einer Kombination von Laserbestrahlung und chemische herzustellen. Jede dieser Techniken erfordern zusätzliche Schritte als diejenigen verwendet, um die Basis fluidischer Architektur eines microfl fabrizierenuidic Chip. Während diese Herstellungsverfahren für hochempfindliche Detektionsanwendungen erforderlich sein können, haben wir das Faser Einführen in einen geformten PDMS-Kanal gefunden für die meisten der alltäglichen Anwendungen in unserem Labor ausreichend ist. Das Detektionssystem konnte FITC-Konzentrationen zu detektieren bis 100 pM in 80 & mgr; m-Tröpfchen, entspricht in etwa dem Nachweis von ~ 17.000 Fluorophor-Moleküle. Diese Empfindlichkeit ist adäquat für die meisten Anwendungen Detektions in unserem Labor derzeit ein Epifluoreszenz-basierten System, die am häufigsten von dem Zellsortierung von Assay positive Tröpfchen das Äquivalent von 10 6 Fluorophor - Moleküle PCR-aktiviert werden , die 11. Die Detektionsempfindlichkeit vergleicht auch vorteilhaft auf kurzem Empfindlichkeiten anderer optischer Faser - basierten Systemen berichtet , - zum Beispiel, ist es 200x empfindlicher als die Nachweisgrenze von 20 nM von Alexa Fluor 488 berichtet in> 100 um Tröpfchen 7.

We haben eine kompakte und modulare Tröpfchens mikrofluidischen Mehrfarberfassungsschema als Alternative zu den teureren, komplex und voluminös Epifluoreszenzmikroskop basierten Systemen dargestellt. Die erforderlichen Nachweiskomponenten verwendet hier (Laser, Fasern, Faser Adapter, Filter und PMT) für <$ 10.000 gekauft werden so dass die Mehrfarbentropfenerkennung zugänglich zu einer großen Anzahl von Forschern, und so dass einzelne Ermittler mehrere Erkennungsstationen zu leisten in einem Labor. Das System kann auch einige Erfahrung basierende Zutrittsschranken entfernen, da ein Grad der Vertrautheit erforderlich ist freien Raum optische Systeme in Verbindung mit einem Epifluoreszenzmikroskop auszurichten. Zusätzlich wird die kleine Stellfläche der Erkennungen Setup macht es ideal für tragbare und diagnostische Anwendungen geeignet.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
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Bioengineering Heft 111 Droplet Mikrofluidik Fluoreszenzdetektion Faseroptik Multicolor Durchflusszytometrie mehrschichtige Lithographie
Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers
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Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

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