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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Published: May 5, 2016 doi: 10.3791/54010
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco

Introduction

Microfluidique Droplet fournissent une plate - forme pour une grande biologie de débit par compartimenter expériences dans un grand nombre de gouttelettes aqueuses en suspension dans une huile de support 1. Les gouttelettes ont été utilisées pour des applications aussi variées que la simple analyse de cellules 2, la réaction en chaîne par polymérase numérique (PCR) , 3 et 4 l' évolution enzymatique. dosages fluorescents sont le mode standard de détection pour la microfluidique de gouttelettes, comme leurs signaux lumineux et temps de réponse rapide sont compatibles avec la détection de volumes de gouttelettes sous-nanolitre à taux de kilohertz. De nombreuses applications nécessitent une détection par fluorescence d'au moins deux couleurs simultanément. Par exemple, notre laboratoire effectue couramment PCR-activé expériences de gouttelettes de tri qui utilisent un canal de détection pour le résultat d'un essai, et utilise un fond de colorant secondaire pour faire test négatif gouttelettes dénombrable 5.

stations de détection typiques pour la microfluidique de gouttelettes sont based sur les microscopes à épifluorescence, et nécessitent des manipulations régimes de lumière compliqué à introduire de la lumière d'excitation des lasers d'espace libre dans un microscope à se concentrer sur l'échantillon. Après que la fluorescence est émise à partir d'une goutte, la lumière émise fluoresce est filtré de telle sorte que chaque canal de détection utilise un tube photomultiplicateur (PMT) centré sur une bande de longueur d'onde. systèmes de détection optique épifluorescence à base microscope fournissent une barrière à l'entrée en raison de leurs frais, la complexité et la nécessité d'entretien. Les fibres optiques fournissent les moyens pour construire un système de détection simplifiée et robuste, étant donné que les fibres peuvent être introduites manuellement dans des dispositifs microfluidiques, en supprimant la nécessité d'un routage de lumière intégrée au rétroviseur, et en permettant des chemins de lumière pour être interfacé avec des connecteurs à fibres optiques.

Dans cet article, nous décrivons l'assemblage et la validation d'un système compact et modulaire pour effectuer une détection de fluorescence multicolore en utilisant un réseau de fibres optiques d'unda photodétecteur unique 6. Les fibres optiques sont couplées à des lasers individuels et sont insérés perpendiculairement à un canal d'écoulement en forme de L avec des décalages spatiaux réguliers. Une fibre de collecte de fluorescence est orienté parallèlement aux régions d'excitation et est reliée à une seule PMT. Parce qu'une goutte passe à travers les faisceaux laser à des moments différents, les données enregistrées par le PMT indique un décalage temporel qui permet à l'utilisateur de faire la distinction entre la fluorescence émise après la gouttelette est excitée par chaque faisceau laser distinct. Ce décalage temporel élimine la nécessité de séparer la lumière émise à PMT séparés en utilisant une série de miroirs dichroïques et filtres passe-bande. Pour valider l'efficacité du détecteur, on quantifier la fluorescence dans les populations de gouttelettes d'encapsulation des colorants de couleur différente et la concentration. La sensibilité du système est étudiée pour la détection de couleur unique à la fluorescéine, et montre la capacité de détecter des gouttelettes ayant des concentrations jusqu'à 0,1 nm, une sensibilité impr 200xOUVEMENT par rapport à des approches à base de fibres récentes rapportées dans la littérature 7.

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Protocol

1. SU8 Fabrication Master

  1. Concevoir les structures microfluidiques pour trois couches de fabrication à l'aide de logiciels de conception et ont les dessins imprimés par un fournisseur sur le film de carte de circuit avec 10 um résolution. Les détails de la conception de l' appareil sont données dans une référence attachée 6 et les géométries de canaux sont présentés dans la figure 1. Les couches doivent inclure des repères d'alignement pour aider colocaliser caractéristiques de chaque couche de fabrication 8.
  2. Placez une tranche de diamètre de silicium de 3 pouces préalablement nettoyé sur une tournette et allumez le vide pour l'apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30 secondes à 1750 tours par minute, offrant une épaisseur de couche de 80 um.
  3. Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 min. Permettre à la plaquette de se refroidir à la température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
  4. Exposer la tranche revêtue au 1 er masque de calque sous un collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l'exposition, placer la plaquette sur une C plaque 135 ° C pendant 1 min, puis refroidir à la température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
  5. Placez la plaquette sur la tournette et tourner sur le vide pour l'apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30 secondes à 5000 tours par minute, ce qui entraîne une couche qui fournit une épaisseur supplémentaire de 40 um.
  6. Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
  7. Alignez le masque de calque 2 e sur la géométrie à motifs en 1.3 et exposer la plaquette revêtu à une collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l'exposition, placer sur une plaque de cuisson C 135 ° C pendant 4 min 30 sec, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
  8. Placez la plaquette sur la tournette et tourner sur le vide pour l'apposer sur le mandrin. Appliquer 1 ml de SU8-3050 dans le centre de la plaquette et de spin pendant 20 secondes à 500 rpm, puis 30s à 1000 tours par minute, ce qui entraîne une couche qui fournit une surépaisseur de 100 um.
  9. Retirer la plaque et cuire au four sur une plaque de cuisson C à 135 ° pendant 30 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
  10. Alignez le masque de calque 3 ème sur la géométrie à motifs en 1.3 et exposer la plaquette revêtu à une collimaté 190 mW, 365 nm LED pendant 3 min. Après l'exposition, placer sur une plaque de cuisson C 135 ° C pendant 9 min, puis refroidir à la température ambiante avant de passer à l'étape suivante.
  11. Développer les masques par immersion dans un bain agité de propylèneglycol acétate de monométhyléther pendant 30 min. Laver la plaque dans de l'isopropanol et cuire au four sur une plaque chauffante à 135 ° C pendant 1 min. Placez le maître développé dans un plat de 100 mm de Pétri pour polydiméthylsiloxane (PDMS) moulage.

2. PDMS de fabrication de l'appareil

  1. Préparer 10: 1 PDMS en combinant 50 g de base de silicone avec 5 g d'agent de durcissement dans une coupelle en plastique. Mélanger le contenu avec un outil rotatif équipé d'un bâtonnet. Degle mélange dans un dessicateur pendant 30 minutes ou jusqu'à ce que toutes les bulles d'air sont éliminées.
  2. Verser le PDMS pour donner une épaisseur de 3 mm au-dessus du maître et de placer de nouveau dans le dessiccateur pour plus de dégazage. Une fois que toutes les bulles sont enlevées, cuire le dispositif à 80 ° C pendant 80 min.
  3. Couper l'appareil du moule à l'aide d'un scalpel et le placer sur une surface propre avec le côté à motifs et perforer les entrées et sorties fluidiques avec une biopsie poinçon de 0,75 mm. Le dispositif doit être coupé de façon à ce que les 120 um et 220 um hautes géométries sont accessibles depuis le côté de l'appareil.
  4. Traiter Plasma le dispositif, avec le côté fonctionnalité jusqu'à, avec un pré-nettoyés 2 pouces par 3 pouces lame de verre à 1 mbar plasma O 2 pendant 20 secondes dans un nettoyeur à plasma de 300 W. Coller le dispositif de PDMS en plaçant la face à motifs du dispositif PDMS sur le côté traité au plasma de la lame de verre. Placez l'appareil dans un four à 80 ° et cuire le dispositif assemblé pendant 40 min.
  5. Rendre les canauxhydrophobe en utilisant une seringue pour rincer le dispositif avec un fluide de traitement de surface fluoré. cuire immédiatement le dispositif à 80 ° C pendant 10 min pour évaporer le solvant.

3. Préparation des composants optiques

  1. Préparer la fibre d'excitation laser en enlevant l'isolation du 5 derniers millimètres de 105 um noyau 125 um gaine, NA = 0,22 fibre optique.
  2. Préparer le laser couleur fibre d'excitation 2 e en répétant 3.1 pour une fibre identique 2 e.
  3. Préparer la fibre pour collecter le signal de fluorescence en répétant 3,1 à 200 um noyau 225 um gaine, NA = 0,39 fibre optique.
  4. Inspecter les conseils de toutes les fibres - si les conseils ne se terminent pas par une surface plane, re-cliver les extrémités avec une pointe en fibre.
  5. Fixer un agent de couplage de la fibre laser à 50 mW, 405 nm laser et attacher une des 105 pm base de fibres au laser. Diriger l'extrémité dénudée au niveau du capteur de la puissance du laserm et utiliser les réglages fins du coupleur laser afin de maximiser la puissance du laser.
  6. Répétez 3,5 pour un laser nm 50 mW, 473.
  7. Monter un 446/510/581/703 nm filtres passe-bande quad sur le PMT en utilisant des tubes de lentilles pour bloquer la lumière laser et transmettre la fluorescence émise. Fixer coupleur de fibres de telle sorte que la lumière se déplace à travers les filtres avant de frapper le PMT.
  8. Fixer la fibre de 3,3 à l'unité assemblée en 3.7.

4. Offline Mixed Generation Emulsion

  1. Obtenir un dispositif microfluidique de dropmaker de mise au point d'écoulement avec un 60 um x 60 um orifice.
  2. Remplir une seringue de 1 ml avec HFE 7500 huiles avec 2% fluoré ionique 9.
  3. Remplir une série de seringues de 1 ml avec les combinaisons suivantes de fluorescéine (FITC) et les colorants bleu dextran conjugué (CB) dans du PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nm CB, et 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. Monter le dispositif de dropmaker sur la scène d'un micros inverséesfaire face et aqueuse et huileuse seringues sur les pompes à seringue. Couple les seringues aux appareils utilisant PE-2 tubes.
  5. Exécution de pompes à seringue à 500 pl / h pour l'huile et 250 pi / h pour les solutions aqueuses, de créer un mélange de 80 um gouttelettes contenant les solutions de 4,3. Pour chaque type d'échantillon aqueux, utiliser un dispositif de dropmaker frais pour éliminer la contamination croisée. Recueillir ~ 200 pi d'émulsion de chaque combinaison de colorant dans une seringue vide.
  6. Après les gouttelettes types 4 ont été rassemblées dans une seule seringue de collecte, mélanger l'émulsion en faisant tourner plusieurs fois sur la seringue.
  7. Répéter les étapes 4.2 à 4.6 avec des solutions aqueuses contenant 0,1, 1, 10 et 100 nM FITC dans du PBS.

5. Fibre optique Insertion

  1. Placez la puce microfluidique fabriqué à l'étape 2 sur la scène d'un microscope inversé couplé avec un appareil photo numérique capable de <100 microsecondes vitesses d'obturation.
  2. Travailler soigneusement de côté, insert la fibre couplée au laser nm 473 dans le canal amont um 120 plus loin, en prenant soin de ne pas percer à travers le canal d'écoulement principal.
  3. Insérez la fibre couplée au laser nm 405 dans le canal um côté haut le plus en aval 120, fournissant un espacement de fibre de 300 um.
  4. Insérez la fibre PMT-couplée dans le grand canal normal aux deux fibres d'excitation laser de 220 nm.

6. Fluorescence Détection de Emulsions mixtes

  1. Monter une seringue de 5 ml remplie de HFE 7500 avec 2% de tensioactif fluoré ionique à l'entrée d'huile d'écartement du dispositif de détection avec un tube PE-2.
  2. Monter la seringue contenant le FITC / CB émulsion mixte sur une pompe à seringue orienté verticalement et deux à l'entrée de gouttelettes de réinjection de l'appareil en utilisant PE-2 tubes. Connecter une longueur de tube PE-2 de la sortie de l'appareil à un conteneur de déchets.
  3. Premier dispositif en exécutant chacune des pompes à 1000 pi / h jusqu'à ce que lesl'huile et les gouttelettes sont visibles à combiner régulièrement dans le dispositif et qui coule en aval.
  4. Ajuster les débits d'écoulement tels que l'huile d'espacement exécute à 6000 ul / h et les gouttelettes à 100 ul / h, en fournissant un espacement important entre les gouttelettes qui traversent la zone de détection.
  5. Allumez les lasers, démarrez le programme d'acquisition de données, et d'ajuster le gain du PMT pour fournir des signaux qui sont plus que 100x le plancher de bruit de fond. Régler la puissance du laser de telle sorte que tous les pics du doublet sont clairement visibles sur une seule timetrace linéairement à l'échelle.
  6. Acquérir 60 sec de l'timetrace de tension de PMT à au moins 20 kHz. Importez les données dans le programme informatique tels que Matlab et mesurer les hauteurs des pics des doublets enregistrées en utilisant le script de programme informatique personnalisé.
    NOTE: Ceci est fourni à titre d'information complémentaire.
  7. Répétez les étapes 06.02 à 06.07 en utilisant le FITC seule émulsion mixte créée en 4.7, avec le laser nm 405 éteint.

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Representative Results

Fabrication d'un dispositif PDMS qui permet l'insertion de fibres optiques nécessite une procédure en plusieurs étapes de photolithographie pour créer des canaux de hauteur variable (figure 1). Tout d'abord, une couche 80 um de hauteur de SU-8 est mis en rotation sur une tranche de silicium et modelée en utilisant un masque pour créer la géométrie de manipulation de fluide. Ensuite, un 40 um couche supplémentaire de SU-8 est filée sur la plaquette, et modelé en utilisant un second masque pour créer des fonctions qui formeront 120 um grand laser canaux d'insertion de la fibre. Enfin, 100 um plus SU-8 est filée sur la plaquette, et modelé pour donner 220 um détection de haut canaux d'insertion de la fibre. Le maître est développé et utilisé pour mouler un dispositif de PDMS, qui est à son tour lié à une lame de verre. La fabrication finale contient 80 um géométrie d'écoulement de hauteur, accessibles par des trous percés dans la partie supérieure du dispositif et 120 um et 220 um de hauteur des canaux optiques à fibre accessible par le côté de ladispositif.

La géométrie du dispositif utilisé pour la détection est représenté sur la figure 2. Généré extérieurement 80 um émulsions sont réinjectés dans un orifice de réinjection de chute et espacées d'espacement huile avant leur écoulement dans un canal de détection en forme de L. Deux fibres laser à couplage sont insérés dans les canaux 120 um de haut fournissent une excitation à des localisations spatiales discrètes dans le canal d'écoulement. Du fait que les fibres multimodes insérées dans ces canaux ont un diamètre externe de 125 pm et un diamètre de coeur de 105 um, la totalité de la section transversale du canal d'écoulement est éclairé par la lumière laser. Dans notre dispositif, le canal d'écoulement de détection fait un virage brusque de 90 degrés après la dernière zone d'excitation laser pour créer un accès optique proche pour une fibre de OD 225 um utilisé pour détecter la fluorescence émise. La fibre utilisée est plus importante en raison de sa forte ouverture numérique (NA = 0,39), qui est similaire à un objectif de microscope standard.

Une goutte circulant à travers le canal de détection rencontre des zones discrètes d'excitation en face de chacune des fibres optiques couplés au laser (figure 3A). Le seul PMT couplé aux enregistrements de fibre de détection émis fluorescence avec un décalage temporel des cartes à la source d'excitation. Pour une gouttelette contenant des colorants qui excitent à 473 nm (région "1" sur la figure 3A) et à 405 nm (région "2" sur la figure 3B), le signal de PMT résultant contient un doublet de signal avec une séparation de pic qui est en corrélation avec le temps qu'il faut une gouttelette pour passer d'une région d'excitation à l'autre. En codant temporellement des données spectrales de cette manière, la nécessité de poursuivre le filtrage de lumière et PMT séparés pour chaque couleur de fluorophore est éliminé. La figure 3B montre doublets de signal pour un train de 4 gouttelettes avec différentes combinaisons de colorants. Le premier pic dans le double correspondents à la fluorescence émise après excitation par le laser 473 nm dans la région de "1" et le deuxième pic correspond à la fluorescence émise après excitation par un laser à 405 nm dans la région "2".

L'efficacité du système de détection a été testée par la détection d'une émulsion mixte de gouttelettes contenant des colorants qui excitent à 405 nm (dextran conjugué bleu, CB) et à 473 nm (fluorescéine, FITC). Gouttelettes ont coulé à travers les régions de détection à environ 50 Hz et les données ont été enregistrées pendant 60 secondes, puis un post-traitement avec un script de programme informatique. Les données sont reportées dans la figure 4 et montre la séparation claire entre les quatre types de gouttelettes ré-injecté. Parce que le système de détection ne fait pas de distinction entre les différentes couleurs de la lumière émise, chaque gouttelette est décrit par sa fluorescence totale maximale après avoir été excité dans la région "1" (pic 1) et dans la région 2 (pic 2).

(Figure 5). Les données montrent la capacité de détecter la concentration en colorant comprise entre 0,1 et 100 nM FITC sur un détecteur unique avec les mêmes paramètres de détection.

Figure 1
Figure 1. Multi-couche photolithographie. Le dispositif microfluidique est fabriqué en créant un maître avec trois longs hauteurs différentes. D'abord, un 80 um grande couche de SU-8 est filé sur et modelée en utilisant un masque pour les canaux de fluide. Ensuite, 40 plus um SU-8 est filé sur et 120 um caractéristiques de grande taille sont modelés avec un 2 e masque à travers les deux SU-8 couches pour obtenir la géométrie pour accueillir 125 um fibres optiques de grande taille. Après cela, 100 um plus SU-8 est filé sur et à motifs avec un 3 ème masque pour obtenir 225 um caractéristiques de hauteur. Après avoir développé, PDMS moulage et plasma collage au verre, le dispositif résultant contient de grandes chaînes accessibles depuis le côté pour l' insertion de la fibre, en plus des canaux de fluide fermés standard. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. conception de l' appareil et la disposition optique. Les parties fluidiques du dispositif sont constitués d'une reinjector des gouttelettes et une entretoise d'huile, couplé à un canal en forme de L. Des fibres couplées à des lasers individuels sont insérés perpendiculairement à la direction de l'écoulement. Une fibre de détection est insérée perpendiculairement aux fibres laser afin de collecter la lumière fluorescente. Cette lumière est filtrée à travers abandpass filtre, avant d' être détecté par un seul PMT. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. encodage temporel de l' information multicolore. (A) Gouttelettes coulent à travers des régions d'excitation "1" et "2" à des moments différents, fournissant décalage de temps qui permet l'identification de la lumière émise. (B) Les données d'un train de 4 gouttes différentes circulant à travers le canal de détection. Le premier pic de chaque doublet correspond à la fluorescence émise après excitation dans la région de "1" et le deuxième pic dans chaque double correspond à la fluorescence émise après excitation dans la région "2". La hauteur des pics de gouttelettes sont proportionnelles la quantité de colorant excité à unlongueur d'onde donnée, sauf en cas de purge spectrale est due à l'utilisation de colorants qui se chevauchent avec les spectres d'excitation. La largeur des pics sont déterminées par la quantité de temps qu'il faut une gouttelette pour traverser une région d'excitation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. détection Multicolor d'une population de gouttelettes mixte. diagramme de dispersion montrant les intensités de gouttelettes maximales pour une population de gouttelettes mixte après excitation et d'émission par un 473 nm laser (pic 1) et un laser de 405 nm (pic 2). Les gouttelettes contiennent des combinaisons de fluorescéine (FITC) et bleu en cascade (CB) à des concentrations nM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.

Figure 5
Figure 5. Simple détection des couleurs très variées sur la population des gouttelettes. Histogramme des émissions par une population de gouttelettes mixte contenant 0,1-100 nM de fluorescéine après excitation par un laser 473 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

détection de fibre optique nécessite l'alignement des fibres optiques par rapport aux canaux de fluide. Parce que notre dispositif utilise des canaux de guidage fabriqués avec photolithographie multicouche, le placement des masques par rapport à l'autre est d'une grande importance. Si les canaux de guidage des fibres sont trop proches du canal de fluide, il existe un risque de fuite de fluide; si les canaux de guidage sont situés trop loin ou mal alignée, le signal de fluorescence recueillie par la fibre de détection peut être considérablement diminuée. Un bon alignement peut être facilitée par la conception de repères d'alignement, comme les cercles concentriques en masques pour être co-situés pendant la photo de motifs. En outre, l'insertion manuelle de la fibre optique dans le dispositif est un processus délicat avec le potentiel de briser les extrémités des fibres dans le dispositif, les rendant inutilisables. Contention fibre contre la lame de verre collé sur le dispositif de PDMS et en insérant les fibres lentement tout en observant au microscope sont les clés pour succinsertion de fibre essful. Enfin, la réinjection d'émulsions préformées doit se produire avec un minimum de manipulation. Dans l'idéal, une fois que l'émulsion est réalisée et déposée directement dans une seringue vide, il ne doit pas être transféré jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour la réinjection des gouttelettes.

la détection multicouleur exige que les pics d'un doublet de signaux soient distincts les uns des autres et que les signaux provenant des gouttelettes consécutives ne se chevauchent pas. Le réglage de la détection que l'on utilise ici utilise une paire de fibres optiques 125 um séparées à une certaine distance de centre à centre de 300 um, fournissant une zone non éclairée de ~ 175 um entre les régions d'excitation. Ceci permet une gouttelette de 80 um à être excité par une seule source lumineuse à la fois et assure que chacun des pics dans un seul doublet à la suite d'un premier type d'excitation laser. Conceptions où la séparation entre les zones d'excitation est similaire au diamètre des gouttelettes donnent des signaux qui se chevauchent problématiques doublets de pic d'émission. Til a la largeur d'un signal doublet est en corrélation avec le temps qu'il faut pour que le bord avant d'une gouttelette d'entrer dans les premières régions d'excitation au moment où le bord arrière de la gouttelette de quitter la zone d'excitation finale, une distance de ~ 500 pm dans la dispositif nous décrivons. Afin de maintenir la clarté de gouttelettes détectées adjacentes, doublets de signal doivent être espacés d'une région de signal bas au moins aussi large que le doublet de signaux. Pour la configuration décrite ici, 80 um gouttelettes sont espacés d'au moins 1 mm.

Bien que la détection multi-couleur avec un seul photodétecteur permet de réaliser d'importantes économies en termes de coût et de la complexité par rapport aux techniques classiques, il y a une certaine perte de robustesse parce que la lumière émise est pas filtrée par longueur d'onde. Cela peut être problématique lors de la détection des gouttelettes qui contiennent de multiples fluorophores qui excitent les mêmes longueurs d'onde, car la source de fluorescence ne peut être distinguée. Ces limitations peuvent être overcome en effectuant des expériences avec des profils d'excitation ne se chevauchent pas, ou en concevant des expériences où spectrale saignent plus ne se produit pas dans un «canal» où un essai sensible est en cours d'exécution. Ceci est compatible avec de nombreuses applications de détection de gouttelettes microfluidique, où un fond colorant lumineux est utilisé pour indiquer la présence d'une goutte, et un second fluorophore est utilisé pour signaler le résultat d'un test de biologie moléculaire 10,11.

Par rapport aux techniques classiques, notre approche présente deux avantages principaux: 1) les régions d'excitation spatialement enregistrés éliminent la nécessité d'un filtrage de lumière compliqué, et 2) l'utilisation de la fibre optique élimine les besoins d'un microscope et le matériel optique à la lumière directe. Parce que nous abordons les problèmes techniques communs avec les systèmes de détection microfluidiques, les enquêteurs précédents ont développé des méthodes pour répondre aux préoccupations similaires. Par exemple, Martini et al. , La fréquence de fluorescence enregistrée encode multicolorepar un détecteur unique en projetant une source d'excitation à travers un motif unique "code à barres" filtres 12. Notre utilisation d'un réseau de fibre optique permet l'utilisation d'un système similaire d'encodage temporel en utilisant la norme, au large des composants du plateau. La littérature montre de nombreuses techniques de couplage optique optiques qui sont plus contrôlés que l'insertion de la fibre simple que nous décrivons. Bliss et al. Utiliser remplis de liquide guides d'ondes optiques pour la livraison soigneusement contrôlée et la collecte de la lumière à partir d' emplacements de microcanaux spécifiques 13, Martinez Vasquez et al. Utiliser des guides d' ondes gravé au laser dans des substrats de silice fondue pour fournir une excitation lumineuse 14 et Vishnubhatla et al. Sont capable de fabriquer avec précision des canaux d'insertion de la fibre en utilisant une combinaison de l' irradiation au laser et la gravure chimique 15. Chacune de ces techniques nécessitent des étapes supplémentaires au-delà de celles qui sont utilisées pour fabriquer l'architecture fluidiques de base d'un microflpuce uidique. Bien que ces procédés de fabrication peuvent être nécessaires pour des applications de détection hautement sensibles, nous avons découvert que l'insertion de la fibre dans un canal de PDMS moulé est suffisant pour la plupart des applications courantes dans notre laboratoire. Le système de détection est capable de détecter des concentrations FITC jusqu'à 100 pM dans 80 um gouttelettes, à peu près équivalente à la détection de ~ 17.000 molécules fluorophores. Cette sensibilité est suffisante pour la plupart des applications de détection dans notre laboratoire qui utilisent actuellement un système basé sur épifluorescence, le plus commun d' entre eux étant PCR activé le tri cellulaire de dosage des gouttelettes positives contenant l'équivalent de 10 6 molécules fluorophores 11. La sensibilité de détection se compare favorablement à la sensibilité récemment rapporté d'autres systèmes à base de fibres optiques - par exemple, il est 200x plus sensible que la limite de détection de 20 nM de Alexa Fluor 488> 100 rapportée dans des gouttelettes 7 um.

We ont présenté un microfluidique système de détection multi-couleur gouttelette compacte et modulaire comme une alternative aux systèmes à base épifluorescence microscope plus coûteux, complexes et encombrants. Les composants de détection nécessaires utilisés ici (lasers, des fibres, des adaptateurs de fibres, filtre, et PMT) peuvent être achetés pour <10 000 $, ce qui rend la détection des gouttelettes multi-couleur accessible à un grand nombre de chercheurs, et permettant aux enquêteurs individuels pour se permettre des stations de détection multiples dans un laboratoire. Le système supprime également des obstacles fondés sur l'expertise à l'entrée, comme un degré de familiarité est nécessaire pour aligner les systèmes optiques d'espace libre en conjonction avec un microscope à épifluorescence. En outre, le faible encombrement de l'installation de détection, il est parfaitement adapté pour les applications portables et diagnostiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
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Bioengineering numéro 111 Droplet microfluidique la détection de la fluorescence la fibre optique multicolore cytométrie en flux la lithographie multicouche
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Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

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