Introduction
마이크로 유체 방울은 캐리어 오일에 현탁 한 수용액 방울 다수의 실험으로 구획하여 높은 처리량 생물을위한 플랫폼을 제공한다. 물방울은 단일 세포 분석이 디지털 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 3 등의 다양한 용도에 사용하고, 진화 4 효소되었다. 밝고 신호 빠른 시간 응답 헤르쯔 레이트로 서브 - 나노 리터 액적 부피를 검출 호환되는 형광 분석법, 마이크로 유체 방울의 검출의 표준 모드이다. 많은 애플리케이션은 동시에 두 개 이상의 색상을위한 형광 검출을 필요로한다. 예를 들어, 우리의 실험은 흔히 분석의 결과를 검출 한 채널을 사용하여 액적 분류 실험은 PCR 활성화 행하고, 5 분석 음성 적이 가산 있도록 보조 배경 염료를 사용한다.
액적 미세 유체에 대한 일반적인 탐지 스테이션 바있다표면 형광 현미경에 나오지도, 샘플에 집중 될 현미경에 여유 공간이 레이저에서 여기 광을 소개하는 빛을 조작 체계를 복잡 필요합니다. 형광 액적으로부터 출사 된 후, 각 검출 채널 파장 대역의 중앙에 하나의 광전자 증 배관 (PMT)를 사용되도록 형광을 방출되는 광을 여과한다. 표면 형광 현미경 기반 광 검출 시스템은 그들의 비용, 복잡성 진입 장벽을 제공하고 유지 보수가 필요했다. 광학 섬유는 섬유가 수동 미러 기반 광 경로에 대한 필요성을 제거하고, 광 경로는 광 파이버 커넥터를 사용하여 인터페이스 될 수 있도록 미세 유체 소자에 삽입 될 수 있기 때문에, 상기 수단은, 단순하고 강력한 검출 방식을 구성하기 위해 제공한다.
본 논문에서는 광 화이버의 어레이를 이용하여 다색 형광 검출을 수행하는 컴팩트 한 모듈 방식의 조립 및 검증을 설명다 하나의 광 검출기 (6). 광학 섬유는 개별 레이저에 결합되고, 일정한 공간 오프셋에서 L 형상의 유로로 정상적으로 삽입된다. 형광 수집 섬유 여진 영역과 평행하게 배향되며, 하나의 PMT에 접속된다. 액적들이 다른 시간에 레이저 빔을 통과하기 때문에, PMT에 의해 기록 된 데이터는 시간적 해당 사용자가 액적 각각 별개의 레이저 광에 의해 여기 된 후 방출 된 형광을 구별 할 수 있도록 오프셋을 나타낸다. 이러한 시간 시프트는 이색 미러와 대역 통과 필터의 시리즈를 사용하여 별도의 PMT 출사 광을 분리 할 필요가 없다. 검출기의 효능을 검증하기 위해, 우리는 다른 색상과 농도의 염료를 캡슐화 방울 인구에서 형광을 정량. 시스템의 감도는 단색 형광 검출을 조사하고,이 0.1nm하는 200X 감도 노출 수까지 농도의 액 적을 검출하는 능력을 표시한다문헌 7에서보고 된 최근의 광섬유 기반 방식에 비해 ovement.
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Protocol
1. SU8 마스터 제작
- 디자인 소프트웨어를 사용하여 세 개의 층 제조를위한 미세 유체 구조를 설계하고 10 μm의 해상도 회로 기판 필름의 공급 업체가 인쇄 된 디자인을 가지고있다. 장치 설계의 세부 사항은 첨부 된 문헌 6에 제시되어 채널 형상은도 1에 도시한다. 층은 각 층의 제조 (8)로부터 특징을 배치 할 수 있도록 정렬 마크를 포함한다.
- 스핀 코터에 미리 청소 3 인치 직경의 실리콘 웨이퍼를 놓고 척에 부착하는 진공의 전원을 켭니다. 80 ㎛의 층 두께를 제공 한 다음 1750 rpm에서 30 초, 500 rpm에서 20 초 동안 상기 웨이퍼 및 회전의 중심에 SU8-3050 1 ㎖을 적용한다.
- 웨이퍼를 제거하고, 30 분 동안 135 ° C의 열판에서 굽는다. 웨이퍼는 다음 단계로 이동하기 전에 실온으로 냉각 할 수있다.
- 평행 190m에서 1 차 레이어 마스크에 코팅 된 웨이퍼를 노출3 분 동안 LED nm의 W, 365. 노출 후, 다음 단계로 진행하기 전에, 1 분 동안 RT에 다음 시원한를 135 ° C 형 열판에 웨이퍼를 배치합니다.
- 스핀 코터에 웨이퍼를 놓고 척에 부착하는 진공의 전원을 켭니다. 40 ㎛의 두께의 부가 층을 제공하는 결과로, 5,000 rpm에서 30 초 후, 500 rpm에서 20 초 동안 상기 웨이퍼 및 회전의 중심에 SU8-3050 1 ㎖을 적용한다.
- 다음 단계로 이동하기 전에 30 분 동안 135 ° C의 열판에 RT로 다음 멋진 웨이퍼와 빵을 제거합니다.
- 1.3 패턴 형상에 2 차 레이어 마스크를 맞추고 3 분 동안 LED nm의 평행 190 mW의 365에 코팅 된 웨이퍼를 노출합니다. 노출 후, 다음 단계로 진행하기 전에, 4 분 30 초 동안 135 ° C의 열판에 RT에 다음 시원한 놓습니다.
- 스핀 코터에 웨이퍼를 놓고 척에 부착하는 진공의 전원을 켭니다. 그 후, 500 rpm에서 20 초 동안 상기 웨이퍼 및 회전의 중심 (30)을 1 ㎖ SU8-3050 적용초 1,000 rpm에서 100 μm의 두께의 부가 층을 제공하는 결과.
- 다음 단계로 이동하기 전에 30 분 동안 135 ° C의 열판에 RT로 다음 멋진 웨이퍼와 빵을 제거합니다.
- 1.3 패턴 형상에 3 번째 레이어 마스크를 맞추고 3 분 동안 LED nm의 평행 190 mW의 365에 코팅 된 웨이퍼를 노출합니다. 노출 후, 다음 단계로 진행하기 전에, 9 분 동안 135 ° C의 열판에 RT에 다음 시원한 놓습니다.
- 30 분, 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트의 교반 욕에 침지하여 마스크를 개발한다. 1 분 동안 135 ° C의 열판에 이소프로판올과 빵의 웨이퍼를 세척 할 것. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 성형 용 100mm 페트리 접시에서 개발 마스터를 놓습니다.
2. PDMS 소자 제조
- 플라스틱 컵에 경화제 5 g과 실리콘계 50 g을 조합하여 하나 PDMS 10을 준비한다. 저어 스틱 장착 된 회전 도구를 사용하여 내용을 섞는다. ℃,30 분 동안 데시 케이 터 내부의 혼합물로서, 또는 모든 기포가 제거 될 때까지.
- 마스터 이상 3mm의 두께를주고 더 탈 가스에 대한 데시 케이 터에 다시 배치 할 PDMS를 따르십시오. 일단 모든 기포를 제거하고, 80 분 동안 80 ℃에서 구워 장치.
- 패터닝 측과 깨끗한 표면에 메스과 장소를 사용하여 금형에서 장치를 잘라 내기 및 0.75 mm 생검 펀치와 유체 입구와 출구를 펀치. 120 ㎛ 내지 220 ㎛의 높이 형상은 장치의 측면에서 접근 할 수 있도록 장치는 절단되어야한다.
- 플라즈마는 300 W의 플라즈마 세정기에서 20 초 동안 1 밀리바 O 2 플라즈마에서 3 인치 유리 슬라이드에 의한 사전 세정 2인치 함께 업 기능면 장치를 취급한다. 유리 슬라이드의 플라즈마 처리면 상에 PDMS 소자의 패턴면을 배치하여 PDMS 소자 접합. 80 ° C의 오븐에서 장치를 넣고 40 분 동안 조립 된 장치를 굽는다.
- 채널 렌더링플루오르 표면 처리 유체 장치를 세척하는 주사기를 사용하여 소수성. 10 분, 용매를 증발시켜 즉시 80 ℃에서 장치를 굽는다.
광학 구성 요소 3. 준비
- 105 μm의 코어 125 μm의 클래딩의 마지막 5mm의 피복을 제거하여 레이저 여기 광을 준비 NA 0.22 광파이버 =.
- 2 차 섬유 동일한 3.1를 반복하여 2 차 컬러 레이저 여기 광을 준비한다.
- 200 μm의 코어 225 μm의 클래딩 3.1를 반복하여 형광 신호를 수집하기위한 섬유를 제조, NA 0.39 광파이버 =.
- 끝이 평평한 표면에 끝나지 않는 경우, 섬유 서기관과 끝을 다시 절단 - 모든 섬유의 끝을 검사합니다.
- 50 mW의, 405 nm의 레이저로 레이저 광 커플러를 부착하고 레이저에 105 μm의 핵심 섬유 중 하나를 첨부합니다. 레이저 파워의 센서에서 벗겨진 단부 지시m은 레이저 파워를 최대화하도록 레이저 커플러의 미세 조정을 사용한다.
- 50 mW의, 473 nm의 레이저 3.5를 반복합니다.
- 레이저 광을 차단하고 방출 형광을 전송하는 렌즈 튜브를 사용하여 PMT에 446/510/581/703 나노 쿼드 대역 통과 필터를 탑재. 그 빛이 PMT를 타격하기 전에 필터를 통해 이동하므로 섬유 커플러를 연결합니다.
- 3.7 조립 장치에 3.3에서 섬유를 연결합니다.
4. 오프라인 혼합 된 에멀젼 생성
- 60 μm의 X 60 μm의 구멍과 흐름 초점 마이크로 유체 dropmaker 장치를 가져옵니다.
- 2 % 이온 성 플루오로 9 HFE 7500 오일 1 ML의 주사기를 입력합니다.
- 1 nM의 FITC / 10 나노 미터 CB, 10 nM의 FITC / 10 나노 미터 CB, 1 nM의 FITC / 100 nM의 다음 형광의 다음과 같은 조합 (FITC) 및 덱스 트란 - 복합 파란색 염료 PBS에서 (CB)를 1 ml를 주사기의 일련의 입력 CB 및 10 nM의 FITC / 100 나노 CB.
- 반전 마이크로의 무대에 dropmaker 장치를 장착대처와 주사기 펌프에 수성과 석유 주사기. 커플 PE-2 튜브를 이용하여 단말기로 주사기.
- 500 μL / 수성 솔루션에 대한 석유와 250 μL / 시간 동안 시간에 주사기 펌프를 실행, 4.3에서 솔루션을 포함하는 80 μm의 방울의 혼합물을 만들 수 있습니다. 수성 시료의 종류마다, 교차 오염을 제거하기 위해 새로운 dropmaker 장치를 사용한다. 빈 주사기로 각 염료 조합에서 에멀젼 ~ 200 μl를 수집합니다.
- 4 액적 형태가 단일 컬렉션 주사기에 수집 한 후, 반복적으로 주사기를 회전시킴으로써, 에멀젼을 혼합한다.
- 반복 수용액은 PBS에 0.1, 1, 10, 100 nM의 FITC를 함유 4.2-4.6 단계.
5. 광섬유 삽입
- <100 마이크로 초 셔터 속도를 할 수있는 디지털 카메라와 결합 거꾸로 현미경의 무대에서 2 단계에서 제조 된 미세 유체 칩을 놓습니다.
- 측면, INSE에서 조심스럽게 작업주 유동 채널을 통해 천공 않도록주의하면서 가장 먼 상류 120 ㎛의 채널에 473 nm의 레이저에 연결된 광을 실온.
- 상기 가장 먼 하류 120 μm의 하이 사이드 채널에 405 nm의 레이저에 연결된 광섬유를 삽입 300 ㎛ 인 섬유의 간격을 제공한다.
- 2 개의 레이저 여기 섬유에 수직 220 μm의 높이 채널로 PMT 결합 섬유를 삽입합니다.
혼합 유제 6. 형광 검출
- PE-2 관으로 검출 장치의 스페이서 오일 입구에 2 % 이온 성 플루오로 HFE 7500 가득 5 ML의 주사기를 탑재합니다.
- PE-2 튜브를 사용하여 장치의 액적 재 주입 입구에 수직 배향 주사기 펌프와 커플 혼합 FITC / CB 에멀젼을 함유하는 주사기를 탑재. 폐기물 용기에 장치 출구에서 PE-2 튜브의 길이를 연결합니다.
- 두까지 1,000 μL / 시간에 펌프를 각각 실행하여 국무 장치기름 방울은 정기적으로 장치에 결합하고 하류 유입 될 볼 수 있습니다.
- 상기 검출 영역을 이동하는 액적 사이에 상당한 간격을 제공하는 스페이서 오일 6000 μL / 시간 실행되도록 유속 100 μL / 시간 방울을 조정한다.
- 상기 레이저를 켜고 데이터 취득 프로그램을 시작하고, 초기 잡음 플로어를 100 배 이상이다 신호를 제공하는 PMT의 이득을 조정한다. 겹의 모든 피크가 하나의 선형 스케일링 timetrace에 잘 볼 수 있도록 레이저 출력을 조정한다.
- 적어도 20 kHz에서의 PMT 전압 timetrace 60 초 획득. 이러한 matlab에 같은 컴퓨팅 프로그램에 데이터를 가져 오기 및 사용자 지정 계산 프로그램 스크립트를 사용하여 기록 이중선의 피크의 높이를 측정한다.
참고 :이 보충 정보로 제공됩니다. - 반복 405 nm의 레이저가 꺼져로, 4.7에서 만든 FITC 전용 혼합 된 에멀젼을 사용하여 6.2-6.7 단계를 반복합니다.
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Representative Results
광섬유의 삽입을 허용하는 PDMS 소자의 제조는 다양한 높이 (도 1)의 채널을 만들 수있는 여러 단계의 포토 리소그래피 절차를 필요로한다. 먼저, SU-8 80 μm의 높은 층은 실리콘 웨이퍼 상에 스핀 및 유체 핸들링 형상을 작성하는 마스크를 이용하여 패터닝된다. 다음, SU-8의 부가 40 ㎛의 층이 웨이퍼 상에 방사하고, 120 ㎛의 높이 레이저 광 삽입 채널을 형성 할 것이다 형상을 생성하는 제 2 마스크를 사용하여 패터닝된다. 마지막으로, 100 ㎛의보다 SU-8은 웨이퍼 상에 방사하고, 220 ㎛의 높이 검출 광섬유 삽입 채널을 제공하기 위해 패터닝된다. 마스터 개발 차례로 유리 슬라이드에 결합 된 PDMS 소자를 몰드하기 위해 사용된다. 최종 조립은 측면을 통해 액세스 디바이스 120 ㎛ 내지 220 ㎛의 높이 광섬유 채널의 상부에 천공 구멍을 통해 액세스 80 μm의 높이 유동 형상을 포함장치.
검출을 위해 사용 된 장치의 구조는도 2에 도시되어있다. 외부에서 생성 된 80 ㎛의 에멀젼 드롭 재 주입 포트에 다시 주입하고이 L 형상 검출 채널로 유입되기 전에 스페이서 오일에 의해 이격된다. 120 μm의 높이 채널의 유동 채널 내에서 이산 공간 위치에 음원 제공 개의 레이저로 결합 섬유가 삽입된다. 이들 채널에 삽입 된 다중 모드 섬유는 125 ㎛의 외부 직경 105 μm의 코어 직경을 가지고 있기 때문에, 유로의 전체 단면은 레이저 광에 의해 조명된다. 우리의 장치에서의 검출 유로는 형광 방출을 검출하기 위해 사용되는 225 ㎛의 외경 섬유 광학 근접 접속을 생성하는 마지막 레이저 여기 영역 후의 급격한 90도 회전한다. 더 큰 섬유로 인해 표준 현미경 목적과 유사 높은 개구 수 (NA = 0.39), 사용됩니다.
상기 검출 된 채널을 통해 흐르는 액 레이저 접속 광파이버 (도 3a)의 각각 앞의 개별 여기 영역을 발견. 단일 PMT는지도 여진 원에 시간 시프트 발색 검출 광 기록 결합. 473 나노 미터 (도 3a의 영역 "1")에서, 405 나노 미터 (도 3b에서의 영역 "2")에 자극 염료를 포함하는 액체 방울의 경우, 생성 된 PMT의 신호는과 상관 피크 분리와 신호 이중선을 포함 시간은 하나의 여기 영역에서 다음으로 이동 방울을합니다. 이와 같이 시간적 스펙트럼 데이터를 인코딩함으로써, 상기 광 필터, 각 형광 컬러의 별도의 PMT에 대한 필요성이 제거된다.도 3b는 다른 염료를 조합 4 액적 기차 신호 이중선을 나타낸다. 이중 대응의 첫 번째 피크"1"영역의 473 nm의 레이저 및 제 2 피크에서의 여기 광을 방출하는 형광들 "2"영역의 405 nm의 레이저에 의해 여기 광을 방출하는 형광에 대응한다.
검출 방식의 효능은 405 나노 미터 (덱스 트란 공역 블루, CB)에 흥분과 473 nm의 (형광, FITC)에서 염료를 포함하는 방울의 혼합 에멀젼을 감지하여 시험 하였다. 방울은 약 50 Hz에서 검출 영역을 통해 유입 된 데이터는 컴퓨팅 프로그램 스크립트를 사용하여 후 처리 60 초 기록했다. 데이터는 그림 4에 그려진 4 개의 재 주입 방울 유형 간의 명확한 분리를 보여줍니다. 상기 검출 시스템은 방출 된 빛의 다른 색상을 구별하지 않기 때문에, 각 액적 2 (피크 2) (피크 1) 영역 "1"흥분되는 후 영역의 최대 총 형광에 의해 설명된다.
(도 5) 405 nm의 레이저를 끄고 형광 만 방울을 함유하는 에멀젼의 형광을 측정함으로써 조사 하였다. 데이터는 동일한 검출 설정을 단일 검출기에서 0.1 내지 100 nM의 범위 FITC 염료 농도를 검출 할 수있는 능력을 나타낸다.
1. 멀티 레이어 포토 리소그래피 그림. 미세 유동 장치는 세 개의 다른 기능 높이와 마스터를 생성함으로써 제조된다. 먼저, SU-8의 80 μm의 높이 층에 스핀 유체 채널 용 마스크를 사용하여 패터닝된다. 다음으로, 40 ㎛의 더 SU-8에 방사하고, 120 ㎛의 높이가 125 μm의 기능 키 광파이버를 수용하는 형상을 생성하기 위해 SU-8 층 모두를 통해 2 차 마스크 패터닝된다. 그 후, 100 μm의 더 SU-8에 스펀 225 μm의 신장 기능을 수득하는 제 3 마스크로 패터닝된다. 유리, PDMS 성형, 플라즈마 결합을 개발 한 후, 생성 된 장치는 표준 밀폐 된 유체 채널에 더하여, 섬유 삽입 측면에서 접근 많은 채널이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 장치 설계 및 광학 레이아웃. 장치의 유체 부분은 L 자형 통로에 결합 액적 reinjector 및 오일 스페이서로 구성된다. 개별 레이저에 결합 섬유의 흐름 방향에 수직으로 삽입된다. 검출 섬유가 형광을 수집하기 위해 상기 레이저 섬유에 수직으로 삽입된다. 이 빛은 AB를 통해 여과andpass 필터, 하나의 PMT에 의해 감지되기 전에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여러 가지 빛깔의 정보 3. 임시 인코딩을줍니다. (A) 액 적은 발광 식별을 허용 시간 시프트를 제공하고, 서로 다른 시간에 여진 영역 "1"과 "2"를 통해 흐른다. 상기 검출 된 채널을 통해 유동하는 4 개의 액적 기차에서 (B) 데이터. 각 겹의 제 1 피크는 「1」영역의 여기 및 "2"영역의 여기 광을 방출 형광 각 배 상당의 제 2 피크 이후에 방출 된 형광에 대응한다. 액적 피크의 높이는 여기에서 염료의 양을 비례스펙트럼 블리드 여기 스펙트럼 겹치는 염료의 사용으로 인해 발생하는 경우를 제외하고, 소정의 파장. 피크의 폭이 여기 영역을 통과하는 방울을 걸리는 시간의 양에 의해 결정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
혼합 방울 인구의 4 가지 빛깔의 검출 그림. 473 nm의 레이저 (피크 1)에 의해 여기 및 방출 후 혼합 방울 인구의 최대 방울 강도를 나타내는 산포도와 405 nm의 레이저 (피크 2). 방울은 nM의 농도에서 형광 (FITC)와 캐스케이드 블루 (CB)의 조합을 포함한다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.
매우 다양한 방울 인구 5. 단일 색상 감지 그림. 473 nm의 레이저에 의해 여기 후 형광의 0.1 내지 100 nm의를 포함하는 혼합 액체 방울 인구에 의한 배출량의 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
광섬유 검출 유체 채널에 대해 광섬유의 정렬을 필요로한다. 우리 장치 다층 포토 리소그래피로 제조 된 가이드 채널을 이용하기 때문에, 서로에 대한 마스크의 위치가 매우 중요하다. 섬유 가이드 채널은 유체 채널에 너무 근접하면, 유체 누출 가능성이있다; 상기 가이드 채널이 너무 멀리 위치하거나 오정렬되는 경우, 검출 섬유에 의해 수집 된 형광 신호는 크게 감소 될 수있다. 적절한 정렬은 사진 패터닝 동안 함께 배치되는 마스크에 같은 동심원으로 정렬 마크를 디자인하여 도움을받을 수 있습니다. 또한, 장치에 광섬유를 수동으로 삽입 사용할 수 없게 그들을 렌더링, 장치 내에서 섬유의 끝을 깰 수있는 잠재력을 가진 섬세한 과정이다. 현미경으로 관찰하면서 키 된 PDMS 장치에 결합 된 유리 슬라이드에 대해 섬유 억제 천천히 섬유를 삽입하기 SUCCessful 섬유 삽입. 미리 형성된 에멀젼의 마지막 재 주입 취급의 최소 발생한다. 유화가 만든 빈 주사기로 직접 입금되면이 방울 재 주입에 사용되는 때까지 이상적으로, 그것은 양도 할 수 없습니다.
다색 검출 신호 이중선의 피크가 서로 연속적인 방울의 신호가 겹치지 않도록 구별하는 것이 필요하다. 우리는 여기에 사용하는 검출 설치 여기 영역 사이 ~ 175 ㎛의 비 조명 영역을 제공하는 300 ㎛의 중심 간 거리에서 125 ㎛의 분리 된 광섬유 한 쌍을 사용한다. 이 80 ㎛의 소적이 한 번에 하나의 광원에 의해 여기 될 수 있도록하고, 이중에서 피크는 각각 단독으로 레이저 여기 한 종류의 결과임을 보장한다. 여기 영역 사이의 분리가, 액적 지름과 유사한 디자인 발광 피크 이중선 겹치는 문제가 신호를 제공한다. 티그 이중 그것이 최종 여기 영역은에서 ~ 500 ㎛의 간격을두고시에 액체 방울의 트레일 링 에지를 제 1 여진 영역 입력 방울의 선단에 걸리는 시간으로 상관 신호 폭 장치 우리는 설명합니다. 인접한 감지 방울 영성을 유지하기 위해, 신호는 이중의 신호 이중 적어도 넓은 낮은 신호 영역에 의해 이격 될 필요가있다. 여기에 설명되는 구성을, 80 ㎛의 방울이 떨어져 적어도 1mm 이격되어있다.
단일 광 검출기와 다색 검출 선정 된 표준 기법에 비해 복잡도면에서 상당한 절감이 가능하더라도 출사 광 파장에 의해 필터링되지 않기 때문에, 내구성의 일부 손실이 존재한다. 형광 원이 구별되기 때문에, 동일 파장에서 여기 여러 형광체를 함유 방울을 검출 할 때 문제가 될 수있다. 이러한 제한은 overc 될 수 있습니다겹치지 않는 여자 프로필과 실험을 수행하여, 또는 민감한 분석이 수행되고있는 "채널"로 발생하지 않는 이상 출혈 스펙트럼 실험을 설계하여 오메. 이것은 밝은 배경 염료 액체 방울의 존재를 표시하기 위해 사용되는 다수의 미세 액적 검출 애플리케이션과 호환 가능하며, 제 형광은 분자 생물학적 분석법 10,11 결과를보고하기 위해 사용된다.
1) 공간적 등록 여기 영역이 복잡 광 필터링에 대한 필요성을 제거하고, 광섬유 2)를 사용하여 직접 광 현미경 및 광학 하드웨어에 대한 요구를 제거한다 : 표준 기술에 비해, 우리의 접근 방법은 두 가지 장점을 갖는다. 우리는 마이크로 유체 탐지 시스템과 공통의 기술적 문제를 해결하기 때문에, 이전의 연구자들은 유사한 문제를 해결하는 방법을 개발했다. 예를 들어, 마티니 등. 주파수 인코딩 여러 가지 빛깔의 형광 기록고유 패턴 "바코드"를 통해 여기 원을 투영함으로써 단일 검출기 (12)를 필터링한다. 광섬유 어레이의 우리의 이용은 유효 성분 오프 표준을 사용하여 유사한 시간적 인코딩 방식의 이용을 허용한다. 문헌은 더 우리가 설명하는 간단한 섬유 삽입 것을 제어 광학 다수의 광 커플 링 기법을 보여줍니다. 여기 광 (14), 및 Vishnubhatla 등을 제공하기 위해 용융 실리카 기판에 에칭 블리스 등. 마르티네즈 바스케즈 등 특정 마이크로 위치 (13)에서 빛의주의 깊게 통제 배달 및 수집 액체 충전 광 도파관을 사용합니다. 사용 도파관 레이저.입니다 정확하게 15을 에칭, 레이저 조사 및 화학 물질의 조합을 이용하여 광섬유 삽입 채널을 제조 할. 이들 기술들 각각은 microfl의베이스 유체 구조를 제조하는데 사용되는 것 이외의 추가 단계가 필요uidic 칩. 이러한 제조 과정은 매우 민감한 검출 응용 프로그램에 필요한 수 있지만, 우리는 성형 PDMS 채널에 섬유 삽입은 우리의 실험실에서 일상 응용 프로그램의 대부분을 적절한 것으로 나타났습니다. 검출 시스템은 17,000 ~ 형광 분자의 검출에 대략 등가 80 ㎛의 소적 100 pM의 아래 FITC 농도를 검출 할 수 있었다. 이 감도는 현재 열 여섯 형광 분자 (11)의 등가를 포함하는 분석 긍정적 액적 셀 정렬 PCR 활성화되는 가장 일반적인 어떤의 표면 형광 기반의 시스템을 사용하여 실험실에서 가장 검출 애플리케이션에 적합하다. 검출 감도는 최근 다른 광섬유 기반 시스템의 감도를 양호하게보고 비교 - 예를 들어,> 100 ㎛의 소적 7보고 알렉사 형석 488 20 ㎚의 검출 한계보다 200X 더 민감하다.
W전자는 더 비싸고 복잡하고 부피가 큰 표면 형광 현미경 기반 시스템에 대한 대안으로서 소형 마이크로 유체 모듈 액적 다색 검출 방식을 제시하고있다. 여기서 사용 된 필요한 검출 요소는 (레이저, 섬유, 광섬유 어댑터, 필터 및 PMT)은 다중 감지 스테이션 수득 개별 조사관 연구자의 다수의 멀티 컬러 액적 검출 액세스 할 수 있도록하고, 허용 <$ 10,000 살 수 실험실한다. 친숙도가 표면 형광 현미경과 함께 자유 공간 광학 시스템을 정렬하기 위해 요구되는 바와 같이 상기 시스템은 또한, 엔트리 몇몇 전문 기반 장벽을 제거한다. 추가로 탐지 설정의 작은 풋 프린트는 이상적으로 휴대용 및 진단 응용 프로그램에 적합합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran-conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 μm fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 μm fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
References
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
