Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Published: May 5, 2016 doi: 10.3791/54010
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco

Introduction

Damlacık Mikroakiskan bir taşıyıcı yağ 1 içinde süspansiyon haline sulu damlacıkların çok sayıda deney bölümlere yüksek verimli biyoloji için bir platform sağlar. Damlacıklar tek bir hücre analizi 2, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 3 gibi çeşitli uygulamalarda kullanılan ve evrim 4 enzim edilmiştir. Parlak sinyaller ve hızlı zaman yanıtı kilohertz oranlarında alt nanoliter damlacık hacimleri tespit uyumlu olarak Floresan tahlilleri, damlacık Mikroakiskan için algılama standart modu bulunmaktadır. Birçok uygulama, aynı anda en az iki renk için floresans algılama gerektirir. Örneğin, bizim laboratuar yaygın bir tahlil sonucu için bir algılama kanalı kullanmak damlacık sıralama deneyleri PCR aktive gerçekleştirir ve 5 tahlil negatif damlacık sayılabilir yapmak için ikincil bir arka plan boya kullanır.

damlacık Mikroakiskan için tipik algılama istasyonları ba vardırEpifloresans mikroskoplar üzerinde sed ve numune odaklı olmak mikroskop içine boş alan lazerler uyarma ışık tanıtmak için ışık manipülasyonlar düzenleri karmaşık gerektirir. floresan bir damlacık yayılan sonra her algılama kanalı dalgaboyu bandında merkezli bir photomultiplier tüp (PMT) kullanır, böylece yayılan fluoresced ışık süzülür. Epifloresans mikroskop tabanlı optik algılama sistemleri nedeniyle gider, karmaşıklık girişine bir bariyer sağlar ve bakım gereklidir. Optik fiberler fiberler elle ayna tabanlı ışık yönlendirme ihtiyacını ortadan kaldırarak, ve ışık yolları fiber optik konnektörleri kullanarak arabirim sağlayan mikroakışkan cihazlar eklenebilir çünkü araçlar, basitleştirilmiş ve sağlam algılama düzeni inşa etmek sağlarlar.

Bu yazıda, optik fiberler An bir dizi kullanarak çok renkli floresan algılama gerçekleştirmek için kompakt ve modüler bir düzeni montaj ve doğrulama tarifda tek fotodetektör 6. Optik fiberler bağımsız lazer bağlanır ve düzenli mekansal uzaklıklar bir L şeklinde bir akış kanalına dik yerleştirilir. Bir flüoresan toplama fiber uyarım bölgelerine paralel yönlendirilmiş olan ve tek bir PMT bağlanır. Bir damlacık farklı zamanlarda lazer ışınları geçer, çünkü PMT tarafından kaydedilen veriler zamansal kullanıcı damlacık her ayrı lazer ışını tarafından heyecan sonra yayılan floresan ayırt sağlar ofset gösterir. Bu zamansal kayma dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler bir dizi kullanarak ayrı Proje Yönetim Ekipleri yayılan ışık ayırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Dedektörün etkinliğini doğrulamak için, biz farklı renk ve konsantrasyon boyalar encapsulating damlacık popülasyonlarında floresan ölçmek. sistemin duyarlılığı tek renkli floresan saptama için incelenmiş, ve 0.1 nM bir 200x hassasiyet göstr kadar konsantrasyonlarda damlacıklar tespit edilebildiğini gösterirLiteratürde 7 bildirilen son elyaf bazlı yaklaşımlar karşılaştırıldığında ovement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SU8 Ana Fabrikasyon

  1. tasarım yazılımı kullanarak üç katmanlı imalat için mikroakışkan yapıları tasarlamak ve 10 mikron çözünürlükte devre kartı film üzerine bir satıcı tarafından basılan tasarımları var. Cihaz tasarımı detayları ekli referans 6'da verilmiştir ve kanal geometrileri, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Katmanlar, her imalat tabaka 8'den özellikleri yan yana koymak yardımcı hizalama işaretleri içermelidir.
  2. spin kaplayıcı bir ön temizliği 3 inç çaplı silisyum gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 80 um bir tabaka kalınlığına sağlayan 1,750 rpm'de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır.
  3. gofret çıkarın ve 30 dakika süre ile 135 ° C sıcak plaka üzerinde pişirilir. gofret sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
  4. Bir paralel 190 m altında 1. katman maskesine kaplı gofret Açığa3 dakika için LED mil W, 365. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 1 dakika boyunca oda sonra serin bir 135 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin.
  5. Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 40 um'lik bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka ile sonuçlanan, 5,000 rpm'de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır.
  6. Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın.
  7. 1.3 desenli geometri üzerine 2. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 4 dakika 30 saniye boyunca 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin.
  8. Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. daha sonra, 500 rpm'de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde 30 SU8-3050 1 ml uygulamasan 1000 rpm'de, 100 um bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka elde edilir.
  9. Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın.
  10. 1.3 desenli geometri üzerine 3. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 9 dakika süreyle 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin.
  11. 30 dakika boyunca, propilen glikol monometil eter asetat içinde karıştırılan bir banyoda daldırarak maskeleri geliştirir. 1 dakika için 135 ° C bir sıcak plaka üzerindeki izopropanol ve fırında gofret yıkayın. polidimetilsiloksan (PDMS) kalıplama için 100 mm Petri kabındaki geliştirilen usta yerleştirin.

2. PDMS Cihaz İmalatı

  1. plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g silikon taban 50 g birleştirerek 1 PDMS: 10 hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir döner aracı ile içeriğini karıştırın. deg30 dakika boyunca bir desikatör içinde karışım olarak veya tüm hava kabarcıkları bertaraf kadar devam eder.
  2. Master üzerinde 3 mm kalınlığında vermek ve daha fazla gaz alma için desikatörde geri yerleştirmek için PDMS dökün. Bir kez tüm kabarcıklar kaldırılır, 80 dakika boyunca 80 ° C 'de cihaz fırında.
  3. desenli tarafı ile temiz bir yüzey üzerinde bir neşter ve yer kullanarak kalıp cihazı kesin ve 0.75 mm'lik biyopsi yumruk ile akışkan giriş ve çıkış yumruk. 120 mikron ve 220 mikron boyunda geometrileri cihazın yan erişilebilir, böylece cihaz kesmek gerekir.
  4. Plazma 300 W plazma temizleyici 20 saniye boyunca 1 mbar O 2 plazmada 3 inç cam slayt tarafından önceden temizlenmiş 2 inç ile birlikte yukarı özelliği tarafı, cihazı davranın. cam slayt plazma ile işlenmiş yüzüne PDMS cihazın desenli tarafını yerleştirerek PDMS cihaz Bond. 80 ° C sıcaklıkta fırında Cihazı ve 40 dakika boyunca monte edilmiş cihazın fırında.
  5. kanal Renderflorlanmış bir yüzey işleme sıvısı ile cihaz temizlemek için bir şırınga kullanılarak hidrofobik. 10 dakika çözücünün buharlaşması için hemen 80 ° C'de cihazı fırında.

Optik Bileşenleri 3. hazırlanması

  1. 105 mikron çekirdek, 125 mikron kaplama son 5 mm yalıtımı kaldırarak lazer uyarma lif hazırlayın, NA 0.22 fiber optik =.
  2. Bir 2. özdeş elyaf için 3.1 tekrarlayarak 2. renkli lazer uyarma fiber hazırlayın.
  3. 200 mikron çekirdek, 225 mikron kaplama için 3.1 yineleyerek floresan sinyalini toplamak için fiber hazırlayın, NA 0.39 fiber optik =.
  4. ipuçları düz bir yüzeye sona yoksa, bir lif çubukla uçları yeniden tutunmaya - tüm liflerin ipuçlarını inceleyin.
  5. 50 mW, 405 nm lazer lazer fiber bağlayıcı takın ve lazer 105 mikron çekirdek liflerinin birini ekleyin. Lazer gücünün sensörüne elimden ucunu yönlendirinmetre ve lazer gücünü maksimize etmek lazer coupler ince ayar kullanın.
  6. 50 mW, 473 nm lazer için 3.5 tekrarlayın.
  7. Lazer ışığı bloke ve yayılan floresan iletmek için objektif tüpleri kullanarak PMT bir 446/510/581/703 nm dört band geçiren filtreler monte edin. o ışık PMT isabet önce filtreler üzerinden geçecek, böylece fiber kuplörünü takın.
  8. 3.7 toplandı birimine 3.3 ile fiber takın.

4. Çevrim karıştırılmış bir emülsiyon Üretim

  1. 60 mm x 60 mm delik bir akış odak Mikroakiskan dropmaker cihazı edinin.
  2. % 2 iyonik fluorosurfactant 9 HFE 7500 yağlar ile 1 ml şırınga doldurun.
  3. 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM: floresein aşağıdaki birleşimleri (FITC) ve dekstran-konjuge mavi boyalar PBS (CB) 1 ml şırınga bir dizi doldurun CB, ve 10 nM FITC / 100 nM CB.
  4. ters MICROS sahnede dropmaker cihaz montebaş ve şırınga pompalarında sulu ve yağlı şırınga. Çift PE-2 boru kullanan cihazlar için şırınga.
  5. 500 ul / sulu çözeltiler için bir yağ, 250 ul / saat saat sonra şırınga pompaları çalıştıran, 4.3 çözümler içeren 80 um damlacıkların bir karışım oluşturmak. Sulu örneğin her türü için, çapraz bulaşmayı önlemek için yeni bir dropmaker cihazı kullanın. Boş şırıngaya Her bir boya kombinasyonu emülsiyon ~ 200 ul toplayın.
  6. 4 damlacıklar türleri tek bir koleksiyon şırınga içinde toplanmıştır sonra, defalarca şırınga çevirerek emülsiyonu karıştırın.
  7. Tekrar sulu çözeltiler, PBS içinde 0.1, 1, 10 ve 100 nM FITC içeren 4.2-4.6 adımları tekrarlayın.

5. Fiber Optik Ekleme

  1. <100 mikro-saniye deklanşör hızları yeteneğine sahip dijital kamera ile birleştiğinde ters bir mikroskop sahnede 2. adımda imal mikroakışkan çip yerleştirin.
  2. yan, INSE dikkatle ÇalışmaAna akış kanalı aracılığıyla ponksiyon özen uzak yukarı 120 mikron kanalı içine 473 nm lazer bağlanmış lif rt.
  3. , Uzak aşağı 120 mikron yüksek yan kanalı içine 405 nm lazer bağlanmış lif eklemek 300 mikron fiber boşluk sağlar.
  4. iki lazer uyarım lifleri normal 220 mikron boyunda kanala PMT-birleştiğinde lif yerleştirin.

Karışık Emülsiyonlar 6. Floresan Algılama

  1. PE-2 boru ile bir algılama cihazı aralayıcı yağı girişine% 2 iyonik fluorosurfactant HFE 7500 dolu bir 5 ml şırıngaya monte edin.
  2. PE-2 boru kullanılarak cihazın damlacık reenjeksiyon girişine bir dikey olarak yönlendirilmiş şırınga pompa ve çift karışık FITC / CB emülsiyonu içeren şırınga monte edin. atık konteynerine cihaz çıkışından PE-2 boru uzunluğu bağlayın.
  3. Her iki kadar 1.000 ul / saatte pompaların her çalıştırarak Başbakan cihazYağ ve damlacıkları düzenli cihazda birleştiren ve aşağı akan görülmektedir.
  4. algılama bölgeye seyahat damlacıklar arasında önemli bir boşluk sağlar boşluk yağı 6.000 ul / saat hızında çalışır şekilde debileri ve 100 ul / saatte damlacıklarını ayarlayın.
  5. , Lazerler açmak veri toplama programını başlatın ve bazal gürültü zemin 100x daha vardır sinyalleri sağlamak için PMT kazancı ayarlayın. duble zirveleri tek bir doğrusal ölçekli timetrace üzerinde açıkça görülebilir şekilde lazer gücünü ayarlayın.
  6. en az 20 kHz PMT gerilim timetrace 60 saniye kazanır. Böyle Matlab olarak bilgisayar programına veri almak ve özel bilgisayar programı komut kullanılarak kaydedilen çifti zirvelerinden yükseklikleri ölçülür.
    Not: Bu ilave bilgi olarak verilmektedir.
  7. Tekrarlayın 405 nm lazer kapalı olan, 4,7 oluşturulan FITC sadece karışık emülsiyon kullanılarak 6.2-6.7 adımları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optik fiberlerin yerleştirilmesi için izin veren bir PDMS cihazın imalatı değişen yükseklik (Şekil 1) kanalları oluşturmak için çok adımlı bir fotolitografi prosedürü gerektirir. İlk olarak, SU-8 80 um boyunda tabaka silikon yonga üzerine bükülmüş ve akışkan geometrisini oluşturmak için bir maske kullanılarak şekillendirilmiştir. Sonraki, SU-8 ek 40 mikron katman gofret üzerine bükülmüş ve 120 mikron boyunda lazer fiber ekleme kanalları oluşturacak özellikleri oluşturmak için ikinci bir maske kullanılarak desenli. Son 100 mikron daha SU-8 gofret üzerine bükülmüş ve 220 mikron boyunda algılama fiber ekleme kanalları vermek için desenli. Ana gelişmiş ve bu da cam bir slayta yapıştırılmış olan bir PDMS cihaz, kalıp için kullanılır. Nihai imalat yan aracılığıyla erişilen cihaz ve 120 um ve 220 mikron boyunda fiber optik kanalları üst açılmış delikler üzerinden erişilen, 80 mikron boyunda akış geometri içerircihazı.

Tespiti için kullanılan cihazın geometrisi Şekil 2'de gösterilmiştir. Harici olarak oluşturulan 80 um emülsiyonlar bir damla yeniden enjeksiyon portuna yeniden enjekte edildiği ve bir L şekli algılama kanalına akış önce boşluk yağı ile aralanmıştır. 120 mikron boyunda kanallar akış kanalında ayrı uzaysal noktada uyarılmaya sağlamak içine iki lazer birleştiğinde lifler eklenir. bu kanallar içine yerleştirilir modlu fiberler, bir 125 mikron dış çapa ve 105 um'lik bir çekirdek çapa sahip olduğundan, akış kanalının toplam enine kesiti lazer ışığı ile aydınlatılır. Bizim cihazda algılama akış kanalı yayılan floresan algılamak için kullanılan bir 225 mikron OD elyaf yakın optik erişim oluşturmak için son lazer uyarma bölgesinden sonra ani bir 90 derecelik dönüş yapar. Büyük lif nedeniyle standart bir mikroskop objektif benzer yüksek sayısal açıklık (NA = 0.39), kullanılır.

Algılama kanalı boyunca akan bir damlacık lazer bağlanmış optik fiberlerin (Şekil 3A), her birinin önünde ayrı uyarı bölgeleri karşılaşır. Tek PMT haritaları uyarım kaynağına zamansal değişimi ile floresan yayılan algılama fiber kayıtlarına birleştiğinde. 473 nm'de (Şekil 3A'da bölge "1") de ve 405 nm'de (Şekil 3B'de bölge "2") de tahrik boyaları içeren bir damlacık için, elde edilen PMT sinyali ile korele tepe ayrılması sahip bir sinyal dublet içeren kez bir uyarım bölgeden diğerine taşımak için bir damlacık alır. Geçici olarak bu şekilde spektral veri kodlama ile, bundan başka bir ışık filtreleme ve her bir flüorofor renk için ayrı Proje Yönetim Ekipleri ihtiyacı ortadan kalkar. Şekil 3B, farklı boya kombinasyonları ile 4 damlacıkların bir tren sinyal çiftleri göstermektedir. çift ​​tekabül ilk zirve"1" Bölgede 473 nm lazer ve ikinci zirve ile uyarma sonrasında yayılan floresan s "2" Bölgede 405 nm lazer ile uyarma sonrasında yayılan floresan gelir.

algılama düzeni etkinliği 405 nm'de (dekstran-bağlı, mavi, CB) olarak tahrik ve 473 nm'de (florosein FITC) de boyalar içeren damlacıkların bir karıştırılmış bir emülsiyon tespit test edilmiştir. Damlacıklar kabaca 50 Hz'de algılama bölgelerine akan ve veriler daha sonra bir bilgisayar programı komut post-işlenmiş 60 saniye, kaydedildi. Veri Şekil 4'te çizilen ve dört yeniden enjekte damlacık türleri arasındaki net bir ayrım gösterir. algılama sistemi yayılan ışığın farklı renklerde arasında ayrım yapmaz, çünkü her damlacık 2 (pik 2) (tepe 1) bölge "1" de heyecanlı kaldıktan sonra ve bölgedeki maksimum toplam floresan tarif edilmektedir.

(Şekil 5) 405 nm lazer kapatarak ve floresan damlacıklar ihtiva eden bir emülsiyonun floresan ölçüm incelenmiştir. Veriler aynı algılama ayarları ile tek bir dedektör 0.1 ila 100 nM FITC değişir boya konsantrasyonu tespit yeteneğini gösterir.

Şekil 1
1. Çok katmanlı fotolitografi rakam. mikroakışkan cihaz üç farklı özellik yükseklikleri ile bir master oluşturarak imal edilir. İlk olarak, SU-8 bir 80 mikron boyunda tabaka üzerinde bükülmüş ve sıvı kanallar için bir maske kullanılarak desenli. Sonraki 40 mikron daha SU-8 bükülmüş ve 120 mikron boyunda özellikler 125 mikron boyunda optik fiberler karşılamak için geometri elde etmek için SU-8 tabakadan hem aracılığıyla 2 ile desenli nd maske vardır. Bundan sonra, 100 mikron daha SU-8 bükülmüş ve 225 mikron boyunda özellikleri elde etmek için bir 3. maskesi ile desenli. Cam, PDMS döküm ve plazma yapıştırma geliştirdikten sonra, ortaya çıkan cihaz standart kapalı akışkan kanallarına ek olarak, lif yerleştirilmesi için taraftan erişilebilir büyük kanalları içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Aygıt tasarımı ve optik düzen. Cihazın akışkan bölümleri, bir L-şekilli kanala birleştirilmiş bir damlacık reinjector ve bir yağ ayırıcı, oluşmaktadır. Bireysel lazerler bağlanmış lifler akış yönüne dik yerleştirilir. Bir algılama fiber flüoresan ışığı toplamak üzere bir lazer liflerine dik yerleştirilir. Bu ışık ab ile süzülürandpass filtre, tek bir PMT tarafından tespit edilmeden önce. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Çok renkli bilgilerin 3. Geçici kodlama rakam. (A), damlalar yayılan ışığın belirlenmesini sağlar zaman değişimi sağlayan, farklı zamanlarda uyarım bölgeleri "1" ve "2" akar. Algılama kanalından akan 4 farklı damlacıkların bir tren (B) veri. Her ikilisinin ilk zirve "1" Bölgedeki uyarma ve "2" Bölgede uyarım sonrasında yayılan floresan her çift tekabül ikinci zirve sonrasında yayılan floresan karşılık gelir. damlacık dorukları yüksekliği de boya heyecanlı miktarını orantılıdırspektral kanama uyarma spektrumları örtüşen boyaların kullanımı nedeniyle meydana dışında, dalga boyu verilen. Piklerin genişliği bir uyarım bölgeyi çapraz bir damlacık geçen süre miktarına göre belirlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Karışık damlacık nüfusun 4. Multicolor algılama rakam. Bir 473 nm lazer (pik 1) ile uyarma ve emisyon sonra karışık bir damlacık nüfus için maksimum damlacık yoğunlukları gösteren dağılım çizim ve 405 nm lazer (pik 2). Damlacıkları nM konsantrasyonlarda floresein (FITC) ve kaskad mavi (CB) kombinasyonlarını içermektedir. Bu büyük halini görmek için tıklayınızrakam.

Şekil 5,
Çok çeşitli damlacık nüfus 5. Tek renk algılama rakam. Bir 473 nm lazer ile uyarma sonra floresein 0.1-100 nM içeren karışık bir damlacık nüfus tarafından emisyonların histogram. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fiber optik algılama akışkan kanal ile ilgili olarak, optik fiberlerin hizalanmasını gerektirir. Bizim cihaz çok tabakalı fotolitografiyle imal kılavuz kanalları kullandığından, birbirlerine göre olan maske yerleştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Fiber kılavuz kanallar sıvı kanala çok yakın ise, sıvı sızması için bir potansiyel var; kılavuz kanallar çok uzakta bulunan ya da hizadan ise, algılama fiber tarafından toplanan floresan sinyali önemli ölçüde azalabilir. Tam hizalama fotoğraf desen sırasında birlikte bulunduğu için maskeler bu tür konsantrik daireler olarak hizalama işaretlerini, tasarlayarak destekli olabilir. Ayrıca, cihazın içine fiber optik manuel yerleştirme kullanılamaz onları render cihaz içinde liflerin ipuçları kırmaya potansiyeline sahip hassas bir süreçtir. Mikroskop ile gözlemlerken tuşları olan PDMS cihazına bağlanmış cam slayt karşı lif kısıtlama ve yavaş yavaş lifleri ekleyerek SUCC içinessful lif ekleme. önceden oluşturulmuş emülsiyonların Son yeniden enjeksiyon işleme minimum gerçekleşmelidir. emülsiyon hazırlanmadan ve boş şırınga içine doğrudan bırakıldığı, bir kez damlacık tekrar enjeksiyon için kullanılan kadar İdeal olarak, bu transfer olmamalıdır.

Çok renkli algılama sinyal duble içinde zirveleri birbirlerinden ve ardışık damlacıkların gelen sinyaller üst üste olmadığını farklı olmasını gerektirir. Burada kullanımı algılama ayarları uyarım bölgeler arasında ~ 175 um ışıksız bölge temin 300 um bir merkez-merkez mesafede ayrılan 125 um, optik elyafın bir çift kullanır. Bu 80 um damla aynı anda yalnızca tek bir ışık kaynağı tarafından uyarılan sağlar ve dubletin piklerin her sadece lazer uyarma bir tipinin bir sonucu olduğunu garanti eder. uyarma bölgeler arasındaki ayrım damlacık çapı benzer Tasarımlar emisyon tepe çiftleri üst üste sorunlu sinyallerini veriyor. To çiftli final uyarma bölgesini içinde ~ 500 mikron mesafe bırakmak için zaman damlacık arka kenarını ilk uyarım bölgeleri girmek için bir damlacık ön kenarına için gereken süre ilişkilendirir bir sinyalin genişliği cihaz biz tarif. Bitişik tespit damlacıkların farklılığı korumak için, sinyal ikili sinyal duble en az kadar geniş bir düşük sinyal bölgeye göre aralıklı olması gerekir. Burada açıklanan yapılandırma için, 80 mikron damlacıkları birbirinden en az 1 mm aralıklı.

Tek bir fotodetektör ile çok renkli algılama maliyet ve standart tekniklere göre karmaşıklık açısından önemli tasarruflar için izin verse yayılan ışık dalga boyu tarafından filtre değil çünkü, sağlamlık bazı kaybı vardır. floresan kaynağı ayırt edilemez, çünkü aynı dalga boylarında heyecanlandırmak birden fluorophores ihtiva damlacıklar tespit ettiğinde bu sorunlu olabilir. Bu sınırlamalar overc olabilirörtüşmeyen uyarma profilleri ile deneyler yaparak, ya da hassas bir tahlil yapılmaktadır bir "kanal" olarak oluşmaz üzerinde kanamaya spektral deneyleri tasarlayarak ome. Bu parlak bir arka boyası bir damlacık varlığını belirtmek için kullanılan bir çok damlacık mikroakışkan algılama uygulamaları ile uyumlu, ve bir ikinci fluorofor moleküler biyoloji tahlilinde 10,11 sonucunu bildirmek için kullanılır.

1) mekansal kayıtlı uyarma bölgeleri karmaşık ışık filtreleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve fiber optik 2) kullanımı doğrudan ışığa mikroskop ve optik donanım ihtiyaçlarını kaldırır: standart tekniklere göre, bizim yaklaşımımız iki ana avantajı vardır. Biz mikroakışkan algılama sistemleri ile ortak teknik kaygılarını, çünkü daha önceki araştırmacılar benzer endişeleri gidermek için yöntemler geliştirmişlerdir. Örneğin, Martini ve ark. Frekans kodlamak çok renkli floresan kaydedildibenzersiz desenli "barkod" aracılığıyla bir uyarım kaynağı yansıtarak, tek bir detektör ile 12 filtreler. fiber optik dizinin Bizim kullanılması raf bileşenleri kapalı standardını kullanarak benzer bir zamansal kodlama şemasının kullanımı, izin verir. Literatür daha biz tarif basit lif ekleme kontrollü optik sayıda optik bağlantı teknikleri gösterir. Uyarma ışık 14 ve Vishnubhatla ark sunmak için erimiş silika yüzeyler kazınmış Bliss ve ark. Martinez Vasquez ve arkadaşları belirli mikrokanal yerleri 13, ışık titizlikle kontrol dağıtımı ve toplanması için sıvı dolu optik dalga kılavuzları kullanın. Kullanın dalgakılavuzları lazer. Vardır tam 15 gravür, lazer ışınlama ve kimyasal bir arada kullanarak elyaf ekleme kanalları imal etmek mümkün. Bu tekniklerin her biri, bir microfl taban akışkan mimarisi imal etmek için kullanılan ötesinde ek adımlar gerektirmezuidic çip. Bu üretim işlemleri çok hassas algılama uygulamaları için gerekli olmakla birlikte, bir kalıplanmış PDMS kanalı içine elyaf ekleme laboratuarımızda, günlük uygulama için en uygun olduğunu bulduk. algılama sistemi ~ 17.000 florofor moleküllerinin tespiti kabaca eşdeğer, 80 mikron damlacıklar halinde 100 pm'den aşağı FITC konsantrasyonlarını tespit etmeyi başardı. Bu duyarlılık, şu anda 10 6 florofor moleküllerinin 11 eşdeğeri içeren tahlil pozitif damlacıkların hücre sıralama PCR aktif hale En yaygın olan bir Epifloresans tabanlı bir sistem kullanılarak laboratuvarımızda en algılama uygulamaları için yeterlidir. Algılama hassasiyeti yakın zamanda diğer fiber optik tabanlı sistemlerin hassasiyetlerini bildirilen olumlu karşılaştırır - örneğin, o> 100 mikron damlacıklar 7 rapor Alexa Fluor 488 20 nM algılama sınırından daha 200x daha duyarlıdır.

We daha pahalı, karmaşık ve hantal Epifloresans mikroskop tabanlı sistemlerine alternatif olarak kompakt ve modüler damlacık mikroakışkan çok renkli algılama düzeni sundu. Burada kullanılan gerekli algılama bileşenleri (lazerler, lifler, lif adaptörler, filtre ve PMT) çoklu algılama istasyonları göze bireysel araştırmacılara araştırmacılar çok sayıda çoklu renk damlacık algılama erişilebilir hale ve izin <10.000 $ için satın alınabilir bir laboratuarda. yakınlık derecesi bir Epifloresans mikroskop ile birlikte serbest uzay optik sistemleri hizalamak için gerekli olan sistem aynı zamanda, giriş bazı uzmanlık tabanlı engelleri kaldırmak. Ayrıca tespitler kurulum küçük ayak izi bu ideal taşınabilir ve teşhis uygulamaları için uygun hale getirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref #10
Dextran-conjugated cascade blue dye Life Technologies D-1976
Fluorescein sodium salt Sigma 28803
Quad bandpass filter Semrock FF01-446/510/581/703-25
PMT Thorlabs PMM02
Fiber port Thorlabs PAFA-X-4-A
lens tube Thorlabs SM1L05
Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector Thorlabs Custom
125 μm fiber stripping tool Thorlabs T08S13
225 μm fiber stripping tool Thorlabs T10S13
laser fiber adapter OptoEngine FC/PC Adapter
405 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MDL-III-405 Distributor for CNI lasers
473 nm CW laser at 50 mW OptoEngine MLL-FN-473-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  2. Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
  3. Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
  4. Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
  5. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
  6. Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
  7. Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
  8. Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  9. DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
  10. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
  11. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
  12. Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
  13. Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
  14. Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
  15. Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).

Tags

Biyomühendislik Sayı 111 Damlacık mikroakışkanlar floresan algılama fiber optik çok renkli flow sitometri çok katmanlı litografi
Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate,… More

Cole, R. H., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers. J. Vis. Exp. (111), e54010, doi:10.3791/54010 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter