Summary
Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.
Introduction
La difusión de células tumorales de tumor de mama primario se ha demostrado que la participación células tumorales no sólo, pero el anfitrión de las células del estroma incluyendo los macrófagos y células endoteliales. Además, la vasculatura del tumor es anormal con aumento de la permeabilidad 1. Por lo tanto, la determinación de cómo las células tumorales, los macrófagos y las células endoteliales interactúan para mediar en la permeabilidad vascular y intravasación de células tumorales en el microambiente del tumor primario es importante para entender la metástasis. La comprensión de la cinética de la permeabilidad vascular, la intravasación de células tumorales y el mecanismo de señalización subyacente de las interacciones multicelulares en el microambiente tumoral puede proporcionar información crucial en el desarrollo y administración de terapias contra el cáncer.
El principal medio de estudio de la permeabilidad vascular de tumores in vivo ha sido la medición de tintes extravasculares como el azul 2, dextranos Evans alto peso molecular (155 kDa)3 y fluoróforo o proteínas de radiotrazadores conjugado (incluyendo albúmina) 4 en puntos fijos de tiempo después de la inyección del colorante. Los avances en microscopía, modelos animales y tintes fluorescentes han permitido la visualización de procesos celulares y la permeabilidad vascular en animales vivos a través de microscopía intravital 5.
Imágenes de animales vivos con la adquisición de imágenes estáticas o secuencias corto lapso de tiempo sobre varios puntos de tiempo no permite la comprensión completa de eventos dinámicos en el microambiente tumoral 6,7. De hecho, la adquisición de imagen estática durante el transcurso de 24 horas demostró que la vasculatura del tumor es permeable, sin embargo la dinámica de la permeabilidad vascular no se observó 6. Por lo tanto, extendida continua de imágenes de lapso de tiempo de hasta 12 horas capta la cinética de eventos dinámicos en el microambiente tumoral.
Este protocolo describe el uso de multiphot prolongado lapso de tiempoen la microscopía intravital para estudiar eventos multicelulares dinámicos en el microambiente tumoral. Múltiples tipos de células en el microambiente del tumor se marcan con tintes inyectables o mediante el uso de animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes. El uso de un catéter de vena de la cola colorantes vasculares o proteínas pueden ser inyectados después del inicio de formación de imágenes para adquirir datos cinética de eventos multicelulares en el microambiente tumoral. Para imágenes de células vivas del tumor mamario está expuesto a través de la preparación quirúrgica de un colgajo de piel. Las imágenes se adquieren por hasta 12 horas utilizando un microscopio multifotónica equipado con múltiples tubos fotomultiplicadores (PMT) detectores 8. Mediante el uso de filtros adecuados, un algoritmo de sustracción permite 4 detectores PMT para adquirir 5 señales fluorescentes en el microambiente tumoral simultáneamente 9. microscopía de alta resolución multifotónica intravital captura resolución de celda de imagen única de las interacciones tumor-estroma en el microambiente del tumor, lo que lleva a una mejor uOMPRENDER de la permeabilidad vascular y intravasación de células tumorales 10-13. Específicamente, reveladas muy localizadas, eventos de permeabilidad prolongados de formación de imágenes intravital transitorios vasculares que se producen de forma selectiva en los sitios de interacción entre una célula tumoral, un macrófago y una célula endotelial (definido como el microambiente tumoral de metástasis, TMEM 14) 13. Además, la intravasación de células tumorales se produce sólo en TMEM y se espacial y temporalmente correlacionado con la permeabilidad vascular 13. fue posible la resolución de una sola célula de la dinámica de estos eventos a través del uso de prolongado lapso de tiempo múltiple de fotones microscopía de las células marcadas con fluorescencia en el microambiente tumoral.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos deben realizarse de conformidad con las directrices y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa del Albert Einstein College of Medicine Institucional Cuidado de Animales y el empleo.
1. Generación de fluorescencia tumores etiquetados y macrófagos asociados a tumores
- Generar células tumorales marcadas con fluorescencia cruzando el modelo espontáneo, autóctona, ratón diseñado genéticamente mamaria del cáncer, donde la mama de ratón del virus del tumor repetición terminal larga conduce el antígeno de poliomavirus media T (MMTV-PYMT) con ratones transgénicos con los reporteros fluorescentes [es decir, el aumento de verde fluorescente proteína La proteína (EGFP), el aumento de cian fluorescente (ECFP) o Dendra2] 8,9.
- Macrófagos de la etiqueta fluorescente en animales PYMT con fluorescencia etiquetados células tumorales mediante el cruce de modelos de ratones genéticamente manipulados con los reporteros fluorescentes específicas myeloid- y de macrófagos [es decir, MacGreen 15 o ratones MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- Alternativamente, la etiqueta fluorescente generan tumores a través del trasplante ortotópico de células tumorales marcadas con fluorescencia PYMT (singénicos), líneas celulares de cáncer de mama humano o tumores primarios paciente humano derivados (xenoinjertos) 11,17.
- Implante marcado con fluorescencia células tumorales en ratones singénicos PYMT con células mieloides proteínas marcadas con fluorescencia para generar animales con células tumorales marcadas con fluorescencia y células mieloides 13.
- Inyectar 100 l de 10 mg / kg fluorescente 70 kDa de dextrano por vía intravenosa (iv) vena de la cola en ratones inmunodeficiencia combinada grave (SCID) con tumores de xenoinjertos de líneas celulares humanas o tumores primarios derivados del paciente a los macrófagos de la etiqueta fluorescente 2 hr antes del comienzo de formación de imágenes intravital.
2. Configuración del microscopio e Imagen Preparación
Nota: Este procedimiento describe la puesta a puntopara intravital de imágenes en un microscopio multifotónica 8.
- Encienda todos los componentes del microscopio y láser, incluyendo láseres de dos fotones y los detectores.
- Encienda la caja de calentamiento a 30 ° C para pre-calentar el escenario. Este paso es fundamental para mantener la temperatura fisiológica del animal.
- Para su uso en un lugar microscopio invertido el inserto etapa personalizada en la platina del microscopio. La pieza de enganche personalizada es una hoja de 1/8 "de espesor de aluminio mecanizada para caber en el espacio escénico de inserción y con un diámetro de 1" agujero pasante en el centro de formación de imágenes.
- Limpiar la platina del microscopio y el inserto etapa con 70% de etanol y secar al aire.
- Colocar una gran gota de agua sobre la 20X, 1,05 NA objetivo de microscopio óptico para mantener el contacto con la cubierta de vidrio.
- Coloque la tapa de vidrio (# 1.5 espesor) a través del puerto de imágenes en el inserto de platina del microscopio. Asegure en su lugar con cinta de laboratorio.
- Utilice una perforadora para perforar un agujero de 2 cm x 2 cmen una almohadilla de caucho flexible y colocar la almohadilla de goma en la platina del microscopio con el orificio en la almohadilla alineado con el orificio en el inserto etapa personalizado.
3. Preparación de la vena de la cola del catéter y reactivos para la inyección durante Imaging
- Cortar una longitud de 30 cm de tubo de polietileno (PE).
- Con unas pinzas, mover la aguja de metal de una aguja 31 G de ida y vuelta hasta que se desprende de la conexión de plástico.
- Con unas pinzas, inserte el extremo romo de la aguja individual en el tubo de PE.
- Inserte una aguja 31 G en el otro extremo del tubo de PE.
- Llene una jeringa de 1 cc de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y la inserta en la aguja 31 G y vaciar todo el aire de la tubería y la aguja con PBS. PBS se utiliza para mantener la hidratación y la osmolaridad de la sangre 9,18, solución salina isotónica sin embargo también se puede utilizar.
- Llene una jeringa de 1 cc con 200 l de 3 mg / kg 155 kDa dextrano-tetrametilrodamina (TMR) O puntos cuánticos para el etiquetado vascular.
- Preparar las otras proteínas inyectables tales como una isoforma de 165 aminoácidos del factor de crecimiento vascular endotelial A (VEGFA 165) en una jeringa de 1 cc y el lugar en el hielo. Inyectar 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 a una concentración de 0,05 mg / ml.
4. La inserción de la cola de mora en el interior de la vena con catéter
- Colocar el animal bajo anestesia utilizando una cámara de inducción con 5% de isoflurano con O 2 como gas portador.
- Transferir el ratón a la plataforma quirúrgica, una vez que esté completamente anestesiado y no responde a una pizca dedo del pie.
- Abrir línea de anestesia con isoflurano a la plataforma quirúrgica, cerca de la línea de la anestesia a la cámara de inducción y colocar el cono de la nariz sobre el hocico del animal. Reducir el isoflurano del 5% al 2,5%.
- Aplicar la pomada oftálmica de los ojos del ratón para evitar la sequedad durante la anestesia.
- Calentar el animal bajo la lámpara de calordurante 2 min para aumentar la circulación en la cola ya que la circulación se ralentiza con anestesia profunda.
- Esterilizar la vena de la cola del ratón con un 70% de etanol.
- Inserte la punta de la aguja de 31 G del catéter construido en la Sección 3 en la vena lateral de la cola del animal y empuje la aguja en 2-3 mm.
- Tire hacia atrás de la jeringa para ver la sangre, lo que garantiza que el catéter se coloca en la vena de la cola.
- Utilice una longitud 1 cm de cinta de laboratorio se coloca sobre la aguja para sujetar la aguja en su lugar en paralelo a la vena a lo largo de la longitud de la cola.
5. Procedimiento quirúrgico colgajo de piel para exponer el tumor mamario
- Con el animal en la plataforma quirúrgica limpiar el tumor y la superficie ventral con el 70% de etanol. Nota: Como se ha descrito, este procedimiento no se realiza completamente de forma aséptica. Para las sesiones de formación de imágenes largas donde la infección puede llegar a ser un factor de confusión, se recomienda utilizar una técnica aséptica adecuada.
- usando steriLe fórceps, levantar la piel ventral y con tijeras estériles hacen una incisión subcutánea a lo largo de la línea media ventral aproximadamente 1 cm de longitud. Evitar perforar el peritoneo durante la incisión.
- cortar suavemente el tejido conectivo fijar la glándula mamaria y el tumor lejos del peritoneo para exponer el tumor mamario.
- El uso de tijeras y pinzas, retire suavemente y cortar la fascia y la grasa de la superficie expuesta del tumor mientras se mantiene la integridad de la vasculatura del tumor y minimizar el sangrado. Este paso es crítico en el mantenimiento de la arquitectura tumoral y la vasculatura de alimentación del tumor.
6. Preparación de los animales de Microscopía
- Transferir el animal a la etapa de formación de imágenes pre-calentado con el tumor expuesto colocado en el cubreobjetos en el inserto de la etapa sobre el objetivo del microscopio para la imagen. Tener cuidado para transferir el catéter vena de la cola suavemente con el animal con el fin de no desplazar la aguja.
- º lugare anestesia nariz cono sobre el hocico del animal para mantener el conjunto de la anestesia isoflurano al 3%.
- Coloque el animal de modo que el tumor se basa en el orificio de la almohadilla de goma y hace contacto con el cubreobjetos de vidrio.
- Utilice dos almohadillas de goma para sujetar suavemente el tumor en su lugar y fijarlos a la platina del microscopio con cinta de laboratorio para reducir el movimiento durante la adquisición de imágenes.
- Llenar la cámara de la almohadilla de goma con PBS para mantener el tejido hidratado y mantener el contacto óptico con el cubreobjetos.
- Comenzar a monitorear los signos vitales del animal con una sonda de oxímetro de pulso. Adjuntar un sensor clip para el muslo del animal. Alternativamente, un cuello que está configurado para encajar alrededor del cuello se puede utilizar.
- Coloque la caja de calentamiento sobre el animal para mantener 30 ° C 20.
- Lentamente reducir el nivel de isoflurano al 0,5-1% para mantener la anestesia y mantener el flujo de sangre.
7. Adquisición de imágenes y la inyección de FLUORESCLas proteínas inyectables ent Colorantes y
- Utilizando el enfoque del microscopio ocular sobre las células tumorales fluorescentes en la superficie del tumor.
- Seleccione un área de interés mediante la búsqueda de zonas de escape de los vasos sanguíneos. La selección de un área de interés con la que fluyen los vasos sanguíneos es fundamental para la evaluación de la vasculatura del tumor.
- Una vez se ha seleccionado una región de interés conmutar el microscopio en el modo de imagen multifotónica.
- Establecer los límites superior e inferior de una z-series. Establecer el límite superior de la serie Z utilizando el ajustador de enfoque para mover el objetivo a la posición de inicio deseada y hacer clic en el botón de posición Z "Inicio". Determinar el límite superior de la serie z mediante la visualización de la red de fibras de colágeno en la superficie del tumor en el canal de segunda generación armónica (SHG) y la observación de cuando no hay células, pero sólo las fibras de colágeno son visibles.
- Establecer el límite inferior de la serie Z moviendo el objetivo de la profundidad de imagen deseada (typically 50 - 150 micras) y haciendo clic en el botón de posición Z "inferior".
- Ajuste el tamaño de paso escribiendo el valor deseado en el campo Tamaño de paso. Determinar el tamaño del paso sobre la base de consideraciones para la resolución y el tiempo de adquisición (normalmente 2 micras se utiliza para la alta resolución de la reconstrucción 3D y 5 micras de otra manera).
- Establecer el intervalo de lapso de tiempo al cambiar al panel de intervalos de tiempo y entrar en el lapso de tiempo deseado en el campo de lapso de tiempo. Para la resolución temporal óptima establecer el intervalo de tiempo de 0 segundos para la imagen continua. Nota: Para obtener imágenes a intervalos de tiempo que se recomienda ajustar el intervalo de tiempo de 10 segundos entre las adquisiciones para reponer el líquido de inmersión objetivo.
- Una vez que se han determinado los parámetros para imágenes, inyectar lentamente 155 kDa dextrano-TMR.
- Retire la jeringa con PBS en el catéter de vena de la cola y reemplazar con la jeringa que contiene 155 kDa dextrano-TMR teniendo cuidado de no introducir burbujas en el linordeste.
- inyectar lentamente 155 kDa dextrano-TMR en el ratón, con un volumen máximo de 200 l, y vuelva a colocar la jeringa con la jeringa que contenía PBS. Paso crítico: Realizar la inyección lentamente y tomar las precauciones necesarias para evitar que la solución fuera de la vena.
- Iniciar la adquisición de la imagen de lapso de tiempo pila Z haciendo clic en los botones de lapso de tiempo Z-Stack y para deprimir ellos y luego hacer clic en el botón de grabación.
- Si otros dextranos fluorescentes, es decir, isotiocianato de 10 kDa de dextrano-fluoresceína (FITC), o proteínas, es decir, VEGFA 165, han sido preparados de antemano, inyectarlos después del inicio de la adquisición de imágenes para at = 0 inicio min.
- Retire la jeringa con PBS en el catéter de vena de la cola y reemplazar con la jeringa que contiene 10 kDa dextrano-FITC o VEGFA 165 teniendo cuidado de no introducir burbujas en la línea.
- inyectar lentamente inyectables en el ratón a través del catéter en la vena caudaly sustituir la jeringa con una jeringa que contiene PBS.
- Cada 30 a 45 min, inyectar lentamente 50 l de PBS o solución salina para mantener la hidratación del animal.
8. La eutanasia
- A la terminación de la adquisición de imágenes, la eutanasia del animal.
- Aumentar el isoflurano al 5%.
- Mantener al animal por debajo del 5% de isoflurano hasta 30 segundos después de que se deja de respirar y eliminar al animal de la etapa.
- Realizar la dislocación cervical para asegurar la eutanasia completa.
Procesamiento 9. Imagen
- Adquirir imágenes en archivos TIFF de 16 bits para cada canal individual en cada punto de tiempo y ahorrar de forma secuencial.
- Realizar la separación de solapamiento espectral (es decir, las buenas prácticas agrarias y PPC), la eliminación de la deriva xy y la generación de películas a partir de secuencias de lapso de tiempo utilizando los métodos establecidos en ImageJ 9. Realizar reconstrucciones de superficie 3D de imágenes de alta resolución 13.
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Representative Results
Extendido microscopía intravital de lapso de tiempo permite la resolución de la célula de imagen única de los procesos multicelulares en el microambiente tumoral. Por las células tumorales con fluorescencia etiquetado, macrófagos, el espacio vascular, y la visualización de la red de fibras de colágeno mediante la segunda señal de generación de armónicos, múltiples compartimentos en el microambiente del tumor se realiza un seguimiento de forma simultánea durante la exploración. Las células tumorales marcadas con proteínas fluorescentes pueden ser generados en ratones transgénicos como se ha hecho en los ratones MMTV-PYMT-Dendra2, con células tumorales mamarias marcadas con Dendra2 (Figura 1A). Al cruzar estos ratones transgénicos con ratones Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP, que tienen los macrófagos marcados con ECFP, tanto las células tumorales y los macrófagos están etiquetados en los ratones MMTV-PYMT. Con la estrategia de doble etiquetado de las células tumorales y los macrófagos, la interacción directa de los dos tipos de células se puede visualizar en tiempo real (Figura 1A). Además, cáncer de mama líneas de células humanas o células tumorales derivadas del paciente transducidas con GFP se pueden utilizar para etiquetar las células tumorales. Los macrófagos pueden rotularse con la etiqueta fluorescente 70 kDa de dextrano que se acumula en los macrófagos fagocíticas (Figura 1B). Estos métodos han promovido el estudio de los acontecimientos multicelulares dinámicos tales como la motilidad tumor de células de macrófagos streaming, la permeabilidad vascular y intravasación de células tumorales. Para visualizar los cambios en la permeabilidad vascular del tumor, (se recomienda 155 kDa o más alto 9,13,21,22) un dextrano de alto peso molecular marcado con fluorescencia peso o puntos cuánticos se utilizan para etiquetar el espacio vascular (Figura 1). 155 kDa de dextrano o puntos cuánticos son lo suficientemente grandes que no difunden fácilmente a través de los espacios 23 interendoteliales.
de formación de imágenes continua de alta resolución facilita la captura de eventos la permeabilidad vascular y lala cuantificación de la cinética de la extravasación de dextrano y el aclaramiento en TMEM (Figura 2 y la película 1). Dado que el espacio vascular se define fácilmente por el kDa dextrano 155 en el inicio de la secuencia de lapso de tiempo (como en 0 'de la figura 2) de dextrano fluorescente extravascular se puede cuantificar en cada fotograma de la secuencia de lapso de tiempo. La Figura 2 y la película 1 demostrar la extravasación de 155 kDa de dextrano-TMR inyecta a través de un catéter en la vena caudal en un MMTV-PYMT-Dendra2; Ratón Csf1r-PPC. Se utilizan células tumorales Dendra2 marcado (verde) y los macrófagos marcados con PPC (cian) para identificar TMEM de animales vivos. La estructura TMEM en el sitio de la permeabilidad vascular se describe en una caja blanca. El espacio vascular se marca con 155 kDa de dextrano-TMR (rojo) para visualizar que fluye vasculatura y la extravasación de contenidos vasculares durante los eventos de la permeabilidad vascular. El pico de 155 kDa de dextrano-TMR extravasaciónen la figura 2 se ve entre 29 'y 34'. dextrano extravascular se ve en la punta de flecha blanca en los paneles superior y en la punta de flecha roja en los paneles inferiores, que muestra sólo el canal de la 155 kDa de dextrano-TMR. El 155 kDa de dextrano-TMR despeja desde el tejido y se observa como una disminución en la señal de TMR extravascular como se ve en 97 'en la Figura 2. Después se cuantifica la compilación de la secuencia de lapso de tiempo en ImageJ dextrano extravascular.
Además de observar eventos espontáneos en el microambiente tumoral, es importante para estudiar el mecanismo molecular subyacente de los fenómenos identificados. La inyección de colorantes o proteínas para inducir la permeabilidad vascular puede dar una idea de los eventos de señalización que regulan la permeabilidad vascular vasculares adicionales. Figura 3 muestra la diferencia en la extravasación de 10 kDa de dextrano-FITC (verde) y 155 kDa de dextrano-TMR (rojo).de alto peso molecular 155 kDa dextrano-TMR se administra inmediatamente antes del inicio de la proyección de imagen de lapso de tiempo. Cinco Z-pilas se adquieren en la secuencia de lapso de tiempo para establecer una línea de base antes de inyectar 10 kDa dextrano-FITC. Después de la adquisición de la 5ª Z-Stack el 10 kDa dextrano-FITC se administra a través del catéter en la vena de la cola sin interrumpir la adquisición de imágenes. El dextrano-FITC se ve entrando en la vasculatura con extravasación de inmediato, mientras que el 155 kDa dextrano-TMR permanece confinado al espacio vascular (Figura 3, 0 'y 6'). El 10 kDa de dextrano-FITC extravasa completamente del vaso sanguíneo y borra de los tejidos que salen de la 155 kDa de dextrano-TMR en el vaso sanguíneo (Figura 3 como se ve en 56 'y de la película 2). El uso de un punto de tiempo desde antes de la inyección, la cinética de 10 kDa dextrano-FITC extravasación pueden ser fácilmente comparados con 155 kDa dextrano-13 TMR. La extravasación inmediata de 10 kDa dextrAN-FITC después de la inyección es significativamente diferente de la retención de 155 kDa de dextrano-TMR en la vasculatura y los eventos de permeabilidad vascular espontáneos 13. Controles experimentales adicionales pueden llevarse a cabo incluyendo la inducción de la permeabilidad vascular a través de la rotura mecánica del endotelio o por medio de VEGFA 165 permeabilidad mediada por 13. La cinética de la extravasación de 155 kDa de dextrano-TMR de eventos de permeabilidad espontáneos pueden ser comparados con 10 dextrano kDa, y otros medios de inducción de la permeabilidad vascular para entender los eventos y señales involucradas en acontecimientos de permeabilidad vascular en el microambiente tumoral.
Figura 1. Estrategias para el etiquetado de las células y la vasculatura en el microambiente tumoral. (A) de ratones transgénicos MMTV-PYMT con células tumorales marcadas con Dendra2 (MMTV-ICRE / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PYMT) y macrófagos etiquetados con PPC (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). vasculatura del tumor se marca con 155 kDa dextrano-TMR son administrados por catéter en la vena caudal. (B) xenoinjertos de tumores derivados del paciente TN1-GFP con macrófagos marcadas con 70 kDa de dextrano-Texas Red y la vasculatura marcadas con puntos cuánticos utilizando el catéter de vena de la cola. Barra de escala, 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La visualización de la permeabilidad vascular transitoria. (A) la microscopía intravital (IVM) de lapso de tiempo de 155 kDa de dextrano-TMR (rojo) y el tumor de extravasación intravasación celular en TMEM (caja blanca). Las células tumorales marcadas con Dendra2 (verde, TC), macrófagos con ECFP (cian, M) y blood vasos con 155 kDa dextrano-TMR (rojo, BV). sitios permeabilidad de los vasos sanguíneos (punta de flecha blanca). (B) Aislados canal de 155 kDa de dextrano-TMR. Las flechas rojas marcan extravasación dextrano (blanco). Barra de escala, 50 micras. Película de la microscopía de lapso de tiempo en la película 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Visualización de múltiples dextranos marcados con fluorescencia. IVM lapso de tiempo de diferencia en la extravasación de 155 kDa de dextrano-TMR (rojo) y 10 kDa dextrano-FITC (verde). Los macrófagos son etiquetados con ECFP (cian) y colágeno en azul (SHG). La superposición de rojo 155 kDa dextrano-TMR y verde 10 kDa dextrano-FITC en la vasculatura es de color amarillo. extravasación rápida de verde pico 10 kDa dextrano-FITC es a los 6 min. scale Bar, 50 micras. Película de la microscopía de lapso de tiempo en la película 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1. La visualización de la permeabilidad vascular transitoria espontánea con IVM lapso de tiempo. Microscopía de lapso de tiempo (como se ve en la figura 2) del transitoria la permeabilidad de los vasos sanguíneos se visualizaron en un ratón transgénico MMTV-PYMT con células tumorales marcadas con Dendra2 (MMTV-ICRE / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PYMT) y macrófagos etiquetados con PPC (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). La extravasación de 155 kDa de dextrano-TMR extravasación (rojo en el panel izquierdo, el panel blanco a la derecha) se observa en el punto de los vasos sanguíneos del tumor rama. Parrendar clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)
2. La visualización de la película extravasación de múltiples dextranos marcados con fluorescencia por IVM lapso de tiempo. Microscopía de lapso de tiempo (como se ve en la figura 3) de la extravasación de 155 kDa de dextrano-TMR (rojo) y 10 kDa dextrano-FITC (verde) en un transgénico ratón MMTV-PYMT con macrófagos etiquetados con PPC (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG de colágeno se marca en azul. Rojo 155 kDa dextrano-TMR permanece en la vasculatura del tumor durante la duración del lapso de tiempo, mientras que el color verde de 10 kDa dextrano-FITC extravasa y borra de los vasos sanguíneos y el tejido rápidamente. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)
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Discussion
interacciones celulares que se producen de forma espontánea en el microambiente del tumor puede conducir a cambios en la motilidad de las células tumorales y intravasación. -Alta resolución de imagen intravital del tejido tumoral vivo permite la visualización de la dinámica multicelulares que pueden ser altamente 10,13,24 transitoria. Punto final en ensayos in vivo o imágenes con lapso de tiempo adquiridos con puntos de tiempo discretos pueden proporcionar información esencial sobre los mecanismos moleculares de los procesos en el microambiente tumoral. Estudios de imagen intravital se han utilizado para los procesos en el microambiente tumoral que se producen durante varios días estudiar, la generación de nuevos conocimientos sobre la angiogénesis, migración de células tumorales y la respuesta al tratamiento con fármacos 25-30. Sin embargo, estos ensayos pueden no captar la cinética de eventos transitorios en el microambiente del tumor debido a la escala de tiempo de los procesos en estudio 7,31. Distinguir múltiples eventos transitorios de procesos constantes es un anuncio importanteventajosa de la microscopía intravital.
La técnica de imagen intravital se describe en este protocolo permite la visualización directa de la dinámica celular en el microambiente del tumor por medio del etiquetado de fluorescencia de múltiples linajes de células y estructuras. N fotones microscopía permite una mayor profundidad de imagen sobre un solo fotón microscopía confocal con profundidades de 300 micras a cabo de forma rutinaria 24. Adquisición de Z-pilas de 50 - 100 micras con 2 micras pasos es de alta resolución suficiente para generar la reconstrucción 3D de las interacciones celulares, incluyendo células salientes que hacen medida que se extienden hacia la otra 13 y vasculares estructuras en el microambiente tumoral. Películas y reconstrucciones 3D a partir de secuencias de imágenes con lapso de tiempo permiten la cuantificación de la motilidad celular (velocidad y direccionalidad) y, utilizando cambios en la intensidad de la señal fluorescente de los colorantes inyectables, permeabilidad vascular.
Con el fin de capturar speventos celulares ontaneous el número de imágenes individuales capturados en una única secuencia debe ser optimizado para permitir una velocidad de adquisición de imágenes que captura la cinética del evento, pero que también cubre un espacio físico suficiente para aumentar la probabilidad de capturar cualquier caso individual durante una única secuencia de lapso de tiempo. Los parámetros de formación de imágenes espaciales que deben tenerse en cuenta incluyen; el número de cortes en una pila Z, el número de campos de visión con Z-pilas adquiridos y la distancia axial entre las rebanadas individuales en una pila Z. Por lo tanto, la configuración de estos parámetros antes de iniciar la adquisición de imágenes es un paso crítico en el protocolo. Utilizando el microscopio multifotónica, la adquisición de 30 cuadros (500 micras x 500 micras) en una serie z es de aproximadamente 60 seg. Dado que la duración de intravasación de células tumorales observada puede ser del orden de minutos 13, capturando varios Z-pilas para la reconstrucción 3D de intravasación, el tiempo de adquisición de una Z-pila se limita to 60 seg. Por lo tanto, se adquirió un único campo de visión con hasta 30 rebanadas en una pila Z. Además, puesto que se deseaba reconstrucción 3D de células, el paso axial entre Z-rebanadas se fijó en 2 micras. Esto permite que la información suficiente sobre los volúmenes de células para permitir la reconstrucción 3D. Estos parámetros deben ser optimizados para cualquier software de microscopio y de imagen utilizada basado en la cinética de los eventos que se están estudiando.
La modificación de la almohadilla de goma en la platina del microscopio y el catéter iv vena de la cola han permitido tanto un aumento significativo en el tiempo de formación de imágenes. Las formas almohadilla de goma de un pozo para permitir la hidratación mantenida del tumor y reducir al mínimo la deriva XY sobre el cubreobjetos de vidrio. La combinación de la cámara de calentamiento con la administración de PBS mantiene la hidratación y la temperatura fisiológica de los animales. Estas condiciones combinadas mantener la perfusión vascular y el flujo sanguíneo para permitir la formación de imágenes ampliada de acontecimientos celulares en los conductos tumoralesIlsma incluyendo la permeabilidad vascular y intravasación de células tumorales.
Una limitación de esta técnica es el número de etiquetas fluorescentes que se pueden utilizar para visualizar las células en el microambiente tumoral. Generación de ratones transgénicos con tipos adicionales de células (es decir, células endoteliales, fibroblastos o pericitos) que contienen la proteína fluorescente puede ser difícil y consume tiempo. Sin embargo, las aplicaciones potenciales futuras podrían utilizar una combinación de etiquetado proteína fluorescente de tipos de células estromales con células tumorales implantadas y 70 kDa de dextrano etiquetado de los macrófagos. Mediante el uso de una combinación de estas estrategias de etiquetado y el cruce de ratones transgénicos nuevas combinaciones de etiquetas celulares pueden ser generados para evaluar el movimiento y eventos celulares en el microambiente tumoral.
A diferencia de los experimentos de punto final basado en la tinción de inmunofluorescencia, la microscopía de alta resolución intravital permite la visualización de espontáneo y transitoriaeventos en el microambiente tumoral. El procedimiento intravital de imágenes descrito aquí revela nuevos eventos e interacciones celulares en el microambiente del tumor que no puede ser descifrado a partir de imágenes estáticas. Con novela información sobre los tipos o procesos células que interactúan, y la cinética de estos eventos, se pueden generar hipótesis para investigar las vías de señalización que conducen a estas interacciones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Departamento de Defensa de mama Cancer Research Program con el número de concesión (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, CA100324 PPG, y el Programa Integrado de imagen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
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