Intracellularly से शाही सेना शोधन बढ़ी<em> लिस्टेरिया monocytogenes</em> बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं में
Summary
Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Abstract
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Introduction
Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों ─ संक्रामक रोगों और बढ़ रही है और मानव सेनाओं के अंदर कोशिकाओं reproducing में सक्षम बैक्टीरिया पैदा ─ एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता का विषय दुनिया भर में 5 हैं। आक्रमण और एक स्तनधारी कोशिका के भीतर दोहराने के लिए, intracellular रोगजनकों परिष्कृत डाह तंत्र और कारकों का अधिग्रहण किया है। जबकि इन तंत्रों एक बीमारी पैदा करने की क्षमता के लिए मौलिक हैं, हम उनके विनियमन और गतिशीलता के बारे में बहुत कम जानते हैं। चूंकि तरल मीडिया में उगाई बैक्टीरिया का जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल मेजबान कोशिकाओं के भीतर वास्तविक पर्यावरण को प्रतिबिंबित नहीं करते, एक बढ़ती आवश्यकता transcriptome के लिए उनके intracellular आलों में उगाया बैक्टीरिया का विश्लेषण करती है। इस तरह के विश्लेषण मेजबान से शुरू हो रहा विशिष्ट जीवाणु रूपांतरों का गूढ़ रहस्य सक्षम हो जाएगा और चिकित्सकीय डिजाइन के लिए नए लक्ष्य की पहचान करने में मदद मिलेगी। intracellularly उगाया बैक्टीरिया की Transcriptome विश्लेषण बेहद चुनौतीपूर्ण है स्तनधारी आरएनए की संख्या से बढ़ना बाद में बैक्टीरियल द्वारा आरएनएकम से कम दस गुना। इस पांडुलिपि में, हम लिस्टेरिया monocytogenes murine मैक्रोफेज कोशिकाओं के अंदर बढ़ रही है बैक्टीरिया से बैक्टीरियल शाही सेना को अलग करने के लिए एक प्रयोगात्मक विधि का वर्णन है। निकाले शाही सेना intracellular रूपांतरों और इस तरह के आरटी पीसीआर, शाही सेना Seq, माइक्रोएरे और अन्य संकरण आधारित प्रौद्योगिकियों के रूप में प्रतिलेखन विश्लेषण के विभिन्न तकनीकों, द्वारा रोगजनक बैक्टीरिया की डाह तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एल monocytogenes मनुष्यों में लिस्टिरिओसिज़ की प्रेरणा का एजेंट, मुख्य रूप से प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों, बुजुर्ग लोगों और गर्भवती महिलाओं को निशाना 6 नैदानिक अभिव्यक्तियों के साथ एक बीमारी है। यह एक ग्राम पॉजिटिव ऐच्छिक intracellular रोगज़नक़ कि स्तनधारी कोशिकाओं है कि मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में एक मॉडल के रूप में दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है अध्ययन 7 की एक विस्तृत सरणी पर हमला है। आक्रमण करने पर, यह एक रिक्तिका या एक फेगोसोम (phagocytic कोशिकाओं के मामले में), जिसमें से यह टी में बच चाहिए में शुरू में रहता हैवह आदेश को दोहराने के लिए में सेल cytosol की मेजबानी। कई विषैलापन कारकों भागने प्रक्रिया, मुख्य रूप से ध्यान में लीन होना बनाने hemolysin, Listeriolysin हे (Llo) और दो अतिरिक्त phospholipases 8 मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है। Cytosol में बैक्टीरिया कोशिका के भीतर एक्टिन तंतु पर खुद को प्रेरित करना और (चित्रा 1) सेल से सेल का प्रसार करने के लिए मेजबान actin polymerization मशीनरी का उपयोग करें। एल के सभी प्रमुख विषैलापन कारकों आक्रमण, intracellular अस्तित्व और प्रतिकृति में शामिल monocytogenes, मास्टर डाह प्रतिलेखन नियामक द्वारा सक्रिय कर रहे हैं PrfA। 8-10।
पिछले दशक में, कई अध्ययनों से हमारे द्वारा किए गए एक और दूसरों को सफलतापूर्वक मेजबान कोशिकाओं 2,11-15 के अंदर आवेदन किया है intracellularly उगाया बैक्टीरिया की transcriptome विश्लेषण के लिए तरीके। diffe द्वारा बैक्टीरियल शाही सेना की 1) चयनात्मक संवर्धन और 2) आरएनए अलगाव: दो मुख्य दृष्टिकोण मेजबान आरएनए जिसके आधार पर कर रहे हैं से बैक्टीरियल आरएनए अलग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंrential सेल। पहले दृष्टिकोण subtractive (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर उदाहरण के लिए) स्तनधारी आरएनए अणुओं के लिए कुल शाही सेना के अर्क के संकरण या बैक्टीरियल लिखित दृश्यों (स्कॉट्स) 11 के चुनिंदा कब्जा करने पर निर्भर करता है। दूसरा दृष्टिकोण बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं, जिसमें मेजबान कोशिकाओं lysed रहे हैं, जबकि बैक्टीरियल कोशिकाओं बरकरार रहने का अंतर सेल पर निर्भर करता है। बैक्टीरियल कोशिकाओं को फिर मेजबान सेल lysate से अलग हो रहे हैं, आम तौर पर centrifugation द्वारा, और आरएनए मानक तकनीक का उपयोग कर निकाला जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग मुख्य समस्या यह है कि एक साथ के साथ बरकरार बैक्टीरिया, मेजबान कोशिकाओं के नाभिक भी अलग कर रहे हैं, इस प्रकार की शाही सेना की तैयारी अभी भी स्तनधारी आरएनए शामिल है। एक तरह से इस समस्या को दूर करने के लिए अंतर centrifugation का उपयोग मेजबान कोशिकाओं के नाभिक से बरकरार बैक्टीरिया अलग करने के लिए, हालांकि यह प्रक्रिया आम तौर पर निकासी के दौरान जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में परिवर्तन की चिंता जुटाने में समय लगता है। इस पत्र में हम एक बेहतर और तेजी से बीए पेशcteria आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल है, जो सेल अंतर सेल दृष्टिकोण पर आधारित है। सबसे पहले, एल मैक्रोफेज कोशिकाओं को संक्रमित monocytogenes ठंडे पानी के साथ lysed रहे हैं। इसके बाद, मैक्रोफेज नाभिक एक संक्षिप्त centrifugation द्वारा हटा रहे हैं और बरकरार बैक्टीरिया तेजी से फिल्टर पर एकत्र कर रहे हैं, जो शाही सेना से बैक्टीरियल न्यूक्लिक एसिड की गर्म फिनोल-एसडीएस निकासी का उपयोग कर अलग किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एल से बैक्टीरियल शाही सेना के अलगाव के लिए एक अनुकूलित विधि का प्रतिनिधित्व करता है मैक्रोफेज कोशिकाओं में intracellularly बढ़ रही बैक्टीरिया monocytogenes। इस प्रोटोकॉल सेल अंतर सेल पर आ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Materials
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30°C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
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