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Immunology and Infection

Intracellularly से शाही सेना शोधन बढ़ी doi: 10.3791/54044 Published: June 4, 2016

Introduction

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Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों ─ संक्रामक रोगों और बढ़ रही है और मानव सेनाओं के अंदर कोशिकाओं reproducing में सक्षम बैक्टीरिया पैदा ─ एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता का विषय दुनिया भर में 5 हैं। आक्रमण और एक स्तनधारी कोशिका के भीतर दोहराने के लिए, intracellular रोगजनकों परिष्कृत डाह तंत्र और कारकों का अधिग्रहण किया है। जबकि इन तंत्रों एक बीमारी पैदा करने की क्षमता के लिए मौलिक हैं, हम उनके विनियमन और गतिशीलता के बारे में बहुत कम जानते हैं। चूंकि तरल मीडिया में उगाई बैक्टीरिया का जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल मेजबान कोशिकाओं के भीतर वास्तविक पर्यावरण को प्रतिबिंबित नहीं करते, एक बढ़ती आवश्यकता transcriptome के लिए उनके intracellular आलों में उगाया बैक्टीरिया का विश्लेषण करती है। इस तरह के विश्लेषण मेजबान से शुरू हो रहा विशिष्ट जीवाणु रूपांतरों का गूढ़ रहस्य सक्षम हो जाएगा और चिकित्सकीय डिजाइन के लिए नए लक्ष्य की पहचान करने में मदद मिलेगी। intracellularly उगाया बैक्टीरिया की Transcriptome विश्लेषण बेहद चुनौतीपूर्ण है स्तनधारी आरएनए की संख्या से बढ़ना बाद में बैक्टीरियल द्वारा आरएनएकम से कम दस गुना। इस पांडुलिपि में, हम लिस्टेरिया monocytogenes murine मैक्रोफेज कोशिकाओं के अंदर बढ़ रही है बैक्टीरिया से बैक्टीरियल शाही सेना को अलग करने के लिए एक प्रयोगात्मक विधि का वर्णन है। निकाले शाही सेना intracellular रूपांतरों और इस तरह के आरटी पीसीआर, शाही सेना Seq, माइक्रोएरे और अन्य संकरण आधारित प्रौद्योगिकियों के रूप में प्रतिलेखन विश्लेषण के विभिन्न तकनीकों, द्वारा रोगजनक बैक्टीरिया की डाह तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एल monocytogenes मनुष्यों में लिस्टिरिओसिज़ की प्रेरणा का एजेंट, मुख्य रूप से प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों, बुजुर्ग लोगों और गर्भवती महिलाओं को निशाना 6 नैदानिक ​​अभिव्यक्तियों के साथ एक बीमारी है। यह एक ग्राम पॉजिटिव ऐच्छिक intracellular रोगज़नक़ कि स्तनधारी कोशिकाओं है कि मेजबान रोगज़नक़ बातचीत में एक मॉडल के रूप में दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है अध्ययन 7 की एक विस्तृत सरणी पर हमला है। आक्रमण करने पर, यह एक रिक्तिका या एक फेगोसोम (phagocytic कोशिकाओं के मामले में), जिसमें से यह टी में बच चाहिए में शुरू में रहता हैवह आदेश को दोहराने के लिए में सेल cytosol की मेजबानी। कई विषैलापन कारकों भागने प्रक्रिया, मुख्य रूप से ध्यान में लीन होना बनाने hemolysin, Listeriolysin हे (Llo) और दो ​​अतिरिक्त phospholipases 8 मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है। Cytosol में बैक्टीरिया कोशिका के भीतर एक्टिन तंतु पर खुद को प्रेरित करना और (चित्रा 1) सेल से सेल का प्रसार करने के लिए मेजबान actin polymerization मशीनरी का उपयोग करें। एल के सभी प्रमुख विषैलापन कारकों आक्रमण, intracellular अस्तित्व और प्रतिकृति में शामिल monocytogenes, मास्टर डाह प्रतिलेखन नियामक द्वारा सक्रिय कर रहे हैं PrfA। 8-10।

पिछले दशक में, कई अध्ययनों से हमारे द्वारा किए गए एक और दूसरों को सफलतापूर्वक मेजबान कोशिकाओं 2,11-15 के अंदर आवेदन किया है intracellularly उगाया बैक्टीरिया की transcriptome विश्लेषण के लिए तरीके। diffe द्वारा बैक्टीरियल शाही सेना की 1) चयनात्मक संवर्धन और 2) आरएनए अलगाव: दो मुख्य दृष्टिकोण मेजबान आरएनए जिसके आधार पर कर रहे हैं से बैक्टीरियल आरएनए अलग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंrential सेल। पहले दृष्टिकोण subtractive (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर उदाहरण के लिए) स्तनधारी आरएनए अणुओं के लिए कुल शाही सेना के अर्क के संकरण या बैक्टीरियल लिखित दृश्यों (स्कॉट्स) 11 के चुनिंदा कब्जा करने पर निर्भर करता है। दूसरा दृष्टिकोण बैक्टीरिया और मेजबान कोशिकाओं, जिसमें मेजबान कोशिकाओं lysed रहे हैं, जबकि बैक्टीरियल कोशिकाओं बरकरार रहने का अंतर सेल पर निर्भर करता है। बैक्टीरियल कोशिकाओं को फिर मेजबान सेल lysate से अलग हो रहे हैं, आम तौर पर centrifugation द्वारा, और आरएनए मानक तकनीक का उपयोग कर निकाला जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग मुख्य समस्या यह है कि एक साथ के साथ बरकरार बैक्टीरिया, मेजबान कोशिकाओं के नाभिक भी अलग कर रहे हैं, इस प्रकार की शाही सेना की तैयारी अभी भी स्तनधारी आरएनए शामिल है। एक तरह से इस समस्या को दूर करने के लिए अंतर centrifugation का उपयोग मेजबान कोशिकाओं के नाभिक से बरकरार बैक्टीरिया अलग करने के लिए, हालांकि यह प्रक्रिया आम तौर पर निकासी के दौरान जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में परिवर्तन की चिंता जुटाने में समय लगता है। इस पत्र में हम एक बेहतर और तेजी से बीए पेशcteria आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल है, जो सेल अंतर सेल दृष्टिकोण पर आधारित है। सबसे पहले, एल मैक्रोफेज कोशिकाओं को संक्रमित monocytogenes ठंडे पानी के साथ lysed रहे हैं। इसके बाद, मैक्रोफेज नाभिक एक संक्षिप्त centrifugation द्वारा हटा रहे हैं और बरकरार बैक्टीरिया तेजी से फिल्टर पर एकत्र कर रहे हैं, जो शाही सेना से बैक्टीरियल न्यूक्लिक एसिड की गर्म फिनोल-एसडीएस निकासी का उपयोग कर अलग किया जाता है।

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Protocol

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नोट: पूरे प्रयोग के दौरान, मैक्रोफेज कोशिकाओं को एक 5% सीओ 2 मजबूर हवा इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated और केवल प्रयोगात्मक जोड़तोड़, जो एक द्वितीय श्रेणी के जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन कर रहे हैं के लिए इनक्यूबेटर से बाहर ले जाया जाता है। एल के साथ कार्य करना monocytogenes बैक्टीरिया जैविक सुरक्षा स्तर 2 नियमों के अनुसार है।

1. सेल तैयार है और बैक्टीरियल संक्रमण (दिन 1 और 2)

  1. पहला दिन
    1. बीज 2.0 10 x 7 अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज कोशिकाओं (BMDM) 30 मिलीलीटर BMDM + कलम strep मीडिया (तालिका 2) में एक 145 मिमी पकवान पर। प्रत्येक बैक्टीरियल तनाव के लिए बीज 3 प्लेटों का विश्लेषण किया जाए। एक 5% सीओ 2 मजबूर हवा इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    2. जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) एल की एक रात में जीवाणु संस्कृति शुरू एक मानक इनक्यूबेटर में, मस्तिष्क दिल अर्क (भी) के माध्यम के 10 मिलीलीटर में तनाव 10403S monocytogenes 30 डिग्री सेल्सियस पर। प्लेस संस्कृति ट्यूबों मिलाते हुए बिना slanted। ध्यान दें:ये विकास की स्थिति flagella जीनों की अभिव्यक्ति है, जो कुशल संक्रमण को बढ़ावा अप-विनियमित।
  2. दूसरा दिन
    1. पूर्व गर्म BMDM मध्यम (बिना कलम strep एंटीबायोटिक) (तालिका 2) और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. बृहतभक्षककोशिका monolayer पूर्व गर्म पीबीएस के 25 मिलीलीटर के साथ दो बार धो एंटीबायोटिक दवाओं हटा दें। 30 मिलीलीटर ताजा BMDM मध्यम जोड़ें।
    3. 1 मिनट के लिए> 14,000 XG पर बैक्टीरिया centrifuging, तैरनेवाला discarding, और pipetting द्वारा पीबीएस के 1.5 मिलीलीटर में धीरे बैक्टीरिया resuspending द्वारा पीबीएस के साथ रात भर जीवाणु संस्कृति के 1.5 मिलीलीटर धो लें। दो बार दोहराएँ।
    4. जंगली प्रकार एल के एक धोया रातोंरात संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक बृहतभक्षककोशिका प्लेट संक्रमित monocytogenes। कई प्लेटों का उपयोग करते हैं, के अलावा एक थाली 15 मिनट संक्रमित। इस समय अंतराल संक्रमण के अंत में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्लेट की कटाई के लिए सक्षम हो जाएगा।
      नोट: संक्रमण की बहुलता (MOI) धारावाहिक कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा यत्न किया हैजीवाणु संस्कृति की रों के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों के 24 घंटा ऊष्मायन BHI अगर प्लेटें और गिनती कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) पर संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया। गुम्मट एल के 0.5 मिलीलीटर का प्रयोग monocytogenes ~ 100 का एक MOI में 10403S परिणाम (100 बैक्टीरिया CFU बृहतभक्षककोशिका सेल प्रति) तनाव। जब intracellular विकास में दोषपूर्ण बैक्टीरियल म्यूटेंट का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च MOI विचार किया जाना चाहिए।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 घंटा ऊष्मायन के बाद, संक्रमित कोशिकाओं में दो बार पीबीएस के साथ, स्वाधीन बैक्टीरिया को दूर करने के लिए धोने, और 30 मिलीलीटर पूर्व गर्म BMDM माध्यम जोड़ें। संलग्न बैक्टीरिया अगले 0.5 घंटे के दौरान भली करेंगे।
    6. अतिरिक्त सेलुलर बैक्टीरिया को मारने के लिए: (50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 1,000 1) 1 घंटा के बाद संक्रमण से कम, जेंटामाइसिन के 30 μl जोड़ें।
    7. एक वैक्यूम आउटलेट बंदरगाह के साथ एक एकत्रित तरल कुप्पी पर एक फिल्टर सिर रखकर फिल्टर तंत्र इकट्ठा करो। फिर एक फिल्टर सिर पर एक फिल्टर (0.45 माइक्रोन), एक सिलेंडर कीप के द्वारा पीछा जगह और एक धातु ग के साथ अलग-अलग हिस्सों को सुरक्षितदीपक। ठंडा RNase मुक्त पानी तैयार करें।
    8. 6 घंटा बाद संक्रमण, फसल बैक्टीरिया से संक्रमित कोशिकाओं से इस प्रकार के रूप में। व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्लेट समझो।
      नोट: आमतौर पर, एल monocytogenes मैक्रोफेज कोशिकाओं में संक्रमण के 6 घंटे के दौरान विकास की 1-लॉग पूरा करती है। अब incubations बैक्टीरियल अतिवृद्धि और मैक्रोफेज की कोशिका मृत्यु हो सकती थी, जबकि कम ऊष्मायन अवधि काफी कम जीवाणु भार में परिणाम सकता है। MOI और संक्रमण का समय इष्टतम स्थितियों तक पहुंचने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
      1. पीबीएस के साथ एक बार संक्रमित कोशिकाओं को धो लें। ठंडा RNase मुक्त पानी की 20 मिलीलीटर मैक्रोफेज कोशिकाओं lyse में जोड़े। एक सेल खुरचनी का उपयोग करना, जल्दी लेकिन ध्यान थाली से दूर कोशिकाओं परिमार्जन।
      2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब lysed कोशिकाओं को ले लीजिए। 30 सेकंड के लिए भंवर। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र।
      3. एक वैक्यूम फिल्टर प्रणाली का उपयोग तंत्र के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला गुजरती हैं। चिमटी का प्रयोग, फिल्टर रोल और जल्दी से एक 15 को हस्तांतरण मिलीलीटर Coniकैलोरी ट्यूब। तरल नाइट्रोजन में फिल्टर के साथ ट्यूब स्नैप फ्रीज।
      4. 1.2.7 में वर्णित के रूप में अगले नमूना के लिए एक नया फिल्टर के साथ निस्पंदन उपकरण इकट्ठे।
      5. अगले दिन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए फिल्टर स्टोर। वैकल्पिक रूप से, न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए सीधे आगे बढ़ना।

2. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण (3 दिन)

नोट: एक धूआं हुड में फिनोल और क्लोरोफॉर्म समाधान के साथ सभी जोड़तोड़ प्रदर्शन।

  1. अम्लीय फिनोल के 1 मिश्रण: क्लोरोफॉर्म, प्रत्येक नमूने के लिए 400 μl एक 1 तैयार करें। अलग नलियों में मिक्स, और उसके बाद आकांक्षा से जिसके परिणामस्वरूप जलीय परत वापस ले लें। 10% एसडीएस के 40 μl जोड़ें।
  2. बर्फ पर फिल्टर युक्त ट्यूबों गला लें उन्हें ठंडा रखने के लिए। प्रत्येक फिल्टर युक्त ट्यूब एसीटेट EDTA (एई) बफर (तालिका 2) के 650 μl जोड़ें।
  3. के रूप में जल्दी संभव के रूप में निम्न चरणों का प्रदर्शन।
    1. सख्ती इतनी फिल्टर युक्त ट्यूब भंवरफिल्टर ट्यूब की परिधि के लिए whisks और बफर पूरी तरह से फिल्टर washes कि। हमेशा बर्फ पर इसे वापस रखकर ट्यूब ठंडा रखें। नोट: इसके अतिरिक्त ट्यूब भंवर पूरी तरह से फिल्टर बंद बैक्टीरिया धोने के लिए उल्टे, जबकि यह आवश्यक हो सकता है।
    2. सभी ट्यूबों के लिए दोहराएँ। यह स्पिन-नीचे करने के लिए शीघ्र ही निलंबन (120 XG पर 1 मिनट) प्रक्रिया के अंत में उपयोगी हो सकता है।
  4. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge एसडीएस और फिनोल / क्लोरोफॉर्म मिश्रण (के रूप में 2.1 में तैयार) युक्त ट्यूब बैक्टीरिया युक्त बफर स्थानांतरण। सभी ट्यूबों के लिए दोहराएँ। यह फिर से फिल्टर युक्त ट्यूबों (120 XG पर 1 मिनट) स्पिन करने के लिए फिल्टर से अवशिष्ट बफर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  5. 10 मिनट के लिए पूरी गति से सब 1.5 मिलीलीटर एक बहु-ट्यूब भंवर डिवाइस में ट्यूब, और भंवर रखें।
  6. 10 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में ट्यूबों को सेते हैं। 5 मिनट के लिए अधिकतम गति (> 14,000 XG) पर अपकेंद्रित्र।
  7. प्रत्येक टी से जलीय परत (लगभग 400 μl) स्थानांतरणउबे एक नया 1.5 मिलीलीटर 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) और 1.0 मिलीलीटर की 100% इथेनॉल के 40 μl युक्त ट्यूब। प्रत्येक ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर।
    नोट: ग्लाइकोजन इस कदम पर जोड़ा जा सकता है उपजी गोली के दृश्य में सुधार करने के लिए।
  8. 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, रातोंरात सी ° -20 में नमूने सेते हैं। फिर, अधिकतम गति (> 14,000 XG) पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  9. ध्यान से प्रत्येक ट्यूब से इथेनॉल (ऊपरी परत) बंद aspirate। प्रत्येक नमूना और भंवर अच्छी तरह से करने के लिए 500 μl ठंड 70% इथेनॉल जोड़ें। अधिकतम गति (> 1 4000 XG) पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र।
  10. ध्यान से प्रत्येक ट्यूब से इथेनॉल बंद aspirate। कोई गर्मी के साथ एक निर्वात बाष्पीकरण का उपयोग कर लगभग 2 मिनट के लिए नमूने सूखी। नहीं नमूने ओवर-सूखी है।
  11. प्रत्येक नमूने के 25 μl RNase मुक्त पानी जोड़ें। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। ध्यान से भंवर और स्पिन नीचे।
  12. टी में शाही सेना एकाग्रता उपायवह एक microvolume यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग नमूने हैं। प्रति प्लेट न्यूक्लिक एसिड की 1 माइक्रोग्राम - लगभग 0.5 निकालने के लिए की अपेक्षा करें।
    नोट: तकनीकी प्रतिकृति के इस स्तर पर जोड़ा जा सकता है।

3. DNase उपचार

  1. एक microfuge ट्यूब में 1 टेबल के अनुसार प्रतिक्रिया सेट करें। 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 450 μl RNase मुक्त पानी और अधिकतम गति (> 14,000 XG) पर 2 मिनट के लिए centrifuging द्वारा phenol के क्लोरोफॉर्म-आई ए ए मिश्रण (तालिका 2), अलग चरणों के 500 μl जोड़ें।
  2. एक नया ट्यूब जलीय परत स्थानांतरण और 500 μl अधिकतम गति (> 14,000 XG) पर 2 मिनट centrifugation द्वारा क्लोरोफॉर्म-आई ए ए मिश्रण (तालिका 2), भंवर और अलग चरणों में जोड़ें।
  3. एक नया ट्यूब जलीय परत स्थानांतरण और इथेनॉल के 1 मिलीलीटर और 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) के 50 μl जोड़ें। भंवर।
    नोट: ग्लाइकोजन इस कदम पर जोड़ा जा सकता है उपजी गोली के दृश्य में सुधार करने के लिए।
  4. ध्यान से प्रत्येक ट्यूब से इथेनॉल बंद aspirate। प्रत्येक नमूना और भंवर अच्छी तरह से करने के लिए 500 μl ठंड 70% इथेनॉल जोड़ें। अधिकतम गति से 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र। ध्यान से प्रत्येक ट्यूब से इथेनॉल बंद aspirate।
  5. कोई गर्मी के साथ एक निर्वात बाष्पीकरण का उपयोग कर लगभग 2 मिनट के लिए नमूने सूखी। नहीं नमूने ओवर-सूखी है।
  6. RNase मुक्त पानी के 12 μl जोड़ें, कमरे के तापमान, भंवर, और स्पिन नीचे पर 2 मिनट के लिए सेते हैं। नमूने शुद्ध शाही सेना में होते हैं, उन्हें बर्फ पर रहते हैं। वैकल्पिक रूप से, 0.1 मिमी EDTA या ते बफर (10 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA) के साथ में शाही सेना को भंग RNase मुक्त एच 2 ओ।
  7. उपाय के एक microvolume यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग शाही सेना सांद्रता। अपेक्षा नमूना प्रति शाही सेना के ~ 100 एनजी (यदि तकनीकी प्रतिकृति संयुक्त रहे हैं)।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए निकाले के लिए उपयुक्त हैकई तकनीकों से आर जीन प्रतिलेखन विश्लेषण। हम आम तौर पर अध्ययन करने के लिए एल आर टी-qPCR विश्लेषण को रोजगार मैक्रोफेज कोशिकाओं 1-4 के संक्रमण के दौरान जीन प्रतिलेखन monocytogenes।

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Representative Results

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मॉडल प्रणाली चित्र 1 में दिखाया गया है और एल से संक्रमित मैक्रोफेज कोशिकाओं को भी शामिल किया जाता है बैक्टीरिया है, जो बृहतभक्षककोशिका cytosol में दोहराने monocytogenes। चित्रा 2 प्रायोगिक योजना का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 3 गुम्मट एल दौरान डाह जीन की ऐसी RT-qPCR विश्लेषण के विशिष्ट परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है अमीर प्रयोगशाला मध्यम BHI में वृद्धि की तुलना में मैक्रोफेज में विकास monocytogenes। परिणाम एल के दो प्रमुख कारकों में से डाह प्रतिलेखन के स्तर को दिखाने monocytogenes; hly Llo विष एन्कोडिंग और एक्टा actin विधानसभा प्रोटीन है, जो मजबूती के साथ मैक्रोफेज के संक्रमण पर प्रेरित कर रहे हैं एन्कोडिंग।

आकृति 1
चित्रा 1: एल के सामान्य अवलोकन एक मैं के रूप में जीवन शैली monocytogenesntracellular पैथोजन। एल monocytogenes करार दिया internalins कि गैर phagocytic कोशिकाओं में सक्रिय internalization प्रेरित है, जबकि phagocytic कोशिकाओं बैक्टीरिया phagocytose विशेष प्रोटीन व्यक्त करके मेजबान कोशिकाओं पर हमला। आक्रमण करने पर, एल monocytogenes शुरू में एक इंडो सोम / फेगोसोम रिक्तिका जिसमें से यह तेजी से मुख्य रूप से listeriolysin हे विष (Llo) का उपयोग कर पलायन के भीतर पाया जाता है। एल cytosol मेजबान कोशिका के भीतर monocytogenes तेजी से प्रतिकृति, और इसके एक्टा प्रोटीन के माध्यम से actin आधारित गतिशीलता का उपयोग करते हुए सेल के लिए सेल से फैलता है। सभी का उल्लेख विषैलापन कारकों मास्टर डाह उत्प्रेरक, PrfA द्वारा विनियमित रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एक प्रवाह आरेख भूत का प्रतिनिधित्वerimental प्रक्रिया। मुख्य कदम संक्रमित कोशिकाओं के सेल, मेजबान कोशिकाओं के नाभिक और बैक्टीरिया की कोशिकाओं और शाही सेना के अलगाव की जुदाई में शामिल हैं। महत्वपूर्ण कदम सचित्र हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एल दौरान डाह जीन का प्रतिलेखन विश्लेषण monocytogenes Intracellular विकास। hly जीन (Llo एन्कोडिंग) का प्रतिलेखन विश्लेषण और एक्टा जीन की एल दौरान 6 घंटे में मैक्रोफेज कोशिकाओं में monocytogenes 10403S intracellular विकास संक्रमण RT-qPCR विश्लेषण का उपयोग BHI माध्यम में तेजी से विकास होने के दौरान उनके स्तर की तुलना में पोस्ट। ट्रांसक्रिप्शन का स्तर रिश्तेदार मात्रा (RQ), रिश्तेदार के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैंBHI में विकास के दौरान प्रतिलेखन के स्तर के लिए। ट्रांसक्रिप्शन का स्तर एक संदर्भ के रूप में जीन -16 rRNA के स्तर पर सामान्यीकृत थे। डेटा 3 स्वतंत्र जैविक दोहराता (एन = 3) का प्रतिनिधि है। त्रुटि सलाखों 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आरएनए अप 2 माइक्रोग्राम करने के लिए (44 μl की अधिकतम मात्रा में)
10x DNase बफर 5 μl
RNase मुक्त पानी 50 μl कुल मात्रा को पूरा
DNase 1 μl (1 यूनिट)

तालिका 1: DNase रिएक्शन प्रोटोकॉल।

1. 500 मिलीलीटर बीएमडीएम + कलम strep मीडिया (फिल्टर निष्फल):
DMEM 235 मिलीलीटर
FBS (निष्क्रिय 30 54 डिग्री सेल्सियस पर मिनट) 100 मिलीलीटर
एम-सीएसएफ (एल 929 वातानुकूलित माध्यम) 19 150 मिलीलीटर
glutamine 5 मिलीलीटर
सोडियम पाइरूवेट 5 मिलीलीटर
बीटा Mercaptoethanol 0.5 मिलीलीटर
पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 मिलीलीटर
कुल 500 मिलीलीटर
2. 500 मिलीलीटर BMDM (फिल्टर निष्फल):
DMEM 235 मिलीलीटर
FBS (निष्क्रिय 30 54 डिग्री सेल्सियस पर मिनट) 100 मिलीलीटर
एम-सीएसएफ (एल 929 वातानुकूलित माध्यम) 19 150 मिलीलीटर
glutamine 5 मिलीलीटर
सोडियम पाइरूवेट 5 मिलीलीटर
बीटा Mercaptoethanol 0.5 मिलीलीटर
कुल 500 मिलीलीटर
3. एई बफर
NaOAc पीएच 5.2 50 मिमी
EDTA 10 मिमी
RNase मुक्त पानी
4. फिनोल के क्लोरोफॉर्म-आईएए
फिनोल 25 मिलीलीटर
क्लोरोफार्म 24 मिलीलीटर
आईएसओ amyl शराब 1 मिलीलीटर
5. क्लोरोफॉर्म-आईएए
क्लोरोफार्म 24 मिलीलीटर
आईएसओ amyl शराब 1 मिलीलीटर

तालिका 2: मीडिया और बफ़र व्यंजनों।

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Discussion

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यहां वर्णित प्रोटोकॉल एल से बैक्टीरियल शाही सेना के अलगाव के लिए एक अनुकूलित विधि का प्रतिनिधित्व करता है मैक्रोफेज कोशिकाओं में intracellularly बढ़ रही बैक्टीरिया monocytogenes। इस प्रोटोकॉल सेल अंतर सेल पर आधारित है और बैक्टीरियल शाही सेना के संवर्धन के लिए दो प्रमुख कदम शामिल हैं: centrifugation और छानने का काम से बैक्टीरिया की एक तेजी से संग्रह का उपयोग कर बृहतभक्षककोशिका नाभिक अवसादन। ये कदम एक मानक आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया से पालन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल listerial शाही सेना की शुद्धि का वर्णन करता है, यह आसानी से अन्य बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के लिए संशोधित किया जा सकता है। हालांकि विधि ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए शाही सेना की शुद्धि पर केंद्रित है, अपने मेजबान से intracellularly बढ़ रही बैक्टीरिया अलग करने के लिए इस्तेमाल किया सिद्धांत भी इस तरह के डीएनए, प्रोटीन, सेल दीवार, आदि ऐसे जीनोमिक और अन्य जीवाणु घटकों, की शुद्धि के लिए लागू किया जा सकता जैव रासायनिक विश्लेषण एक बेहतर समझ और intracellular रोगज़नक़ के लक्षण वर्णन प्रदान करेगासंक्रमण के दौरान जीवन चक्र।

में कुल बैक्टीरियल शाही सेना के ~ 100 एनजी प्रक्रिया का परिणाम है। हालांकि आरएनए पैदावार अपेक्षाकृत कम कर रहे हैं, वे इस तरह RT-qPCR, शाही सेना Seq और आधुनिक संकरण आधारित प्रौद्योगिकियों के रूप में कई तकनीकों का उपयोग करते हुए जीन प्रतिलेखन के बहाव के विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। आरएनए पैदावार में सुधार करने के लिए, यह ताजा बैक्टीरियल inoculums, साथ ही नए सिरे से फिनोल समाधान nuclease मुक्त पानी और buffers का उपयोग करना संभव RNase संदूषण से बचने के लिए सिफारिश की है। काटा बैक्टीरिया और पृथक शाही सेना हमेशा निकालने की प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए। संक्रमण का समय जैविक सवाल के आधार पर समायोजित किया जा सकता है और जीव का अध्ययन किया। शाही सेना की मात्रा बढ़ाने के लिए, प्रयोग प्रत्येक नमूना प्रति अधिक संक्रमण प्लेटों में शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

मुख्य चिंता का विषय है, जब इस तरह के एक प्रयोग प्रदर्शन कटाई चरणों के दौरान बैक्टीरिया का प्रतिलेखन प्रोफ़ाइल को बदलने का खतरा है। अधिकांश Bacterआइए ठंड के झटके तनाव प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने से ठंडे तापमान का जवाब है, और इस तरह बैक्टीरियल कटाई संभव के रूप में जल्दी से किया जाना चाहिए। अभिकर्मकों और उपकरणों समय से आगे तैयार किया जाना चाहिए, और प्रत्येक नमूना अलग से इलाज किया जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण कदम तुरंत तरल नाइट्रोजन में फिल्टर युक्त बैक्टीरिया फ्रीज करने के लिए है। ऐसा न होने नाटकीय रूप से पृथक शाही सेना की गुणवत्ता को कम कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम न्यूक्लिक एसिड की अपेक्षाकृत कम मात्रा की इथेनॉल है। अतिरिक्त देखभाल अदृश्य न्यूक्लिक एसिड गोली बाधित करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। ग्लाइकोजन इन चरणों के दौरान गोली के दृश्य में सुधार करने के लिए वर्षा समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है।

कुछ बाद अनुप्रयोगों के लिए, उदाहरण के लिए, RT-qPCR, हटाने डीएनए महत्वपूर्ण है। DNase टी निम्नलिखित न्यूक्लिक एसिड की कुल राशि में 5 गुना - यद्यपि हम नियमित DNase उपचार की दक्षता, 3 की कमी की निगरानी नहीं हैreatment कुशल DNase उपचार का संकेत है। ध्यान से, शाही सेना के नमूने से किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तकनीक या डीएनए को हटाने के लिए किट उपयुक्त है। इसके अलावा, इस तरह के प्रदर्शन के लिए कोई रिवर्स प्रतिलेखन के साथ एक नमूना के रूप में गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने, का उपयोग करते हुए, इस तरह के अनुप्रयोगों में लाभकारी है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक प्रमुख सीमा शाही सेना की अपेक्षाकृत कम राशि निकाली गई है, जो कुल शाही सेना के बारे में 100 एनजी है। इस प्रकार, इस तकनीक को इस तरह के उत्तरी धब्बा विश्लेषण के रूप में शास्त्रीय संकरण तकनीक, जो शाही सेना के माइक्रोग्राम की आवश्यकता के लिए उपयुक्त नहीं है।

आरएनए अनुक्रमण (गहरी आरएनए-सेक) में हाल ही में तकनीकी प्रगति दोनों जीवाणु रोगज़नक़ और एक साथ स्तनधारी मेजबान प्रतिलेखन प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है, एक विधि नामित 'दोहरे शाही सेना seq' 16-18 उनकी RNAs अलग करने की जरूरत है, बिना। हालांकि दोहरी शाही सेना seq विश्लेषण मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन में आदर्श है, यह बहुत expensiv हैई और अक्सर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। क्योंकि संक्रमित कोशिकाओं में बैक्टीरिया आरएनए सामग्री विशेष रूप से कम है, यह काफी जीवाणु एक प्रभावी जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए पढ़ता है, यहां तक ​​कि नवीनतम अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा प्रदान की उच्च पढ़ें गहराई के साथ पाने के लिए बेहद मुश्किल और महंगा है। इस दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त दोष यह एक शाही सेना या सीडीएनए प्रवर्धन कदम है, जो जीन अभिव्यक्ति की पक्षपातपूर्ण परिणामों को जन्म दे सकती के लगातार इस्तेमाल होता है। यहाँ प्रस्तुत विधि प्राप्त जानकारी और लागत प्रभावशीलता के बीच एक समझौता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
β-Mercaptoethanol Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30 °C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

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Intracellularly से शाही सेना शोधन बढ़ी<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em&gt; बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं में
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Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).More

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

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