Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

RNA Zuivering van Intracellulair Grown doi: 10.3791/54044 Published: June 4, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Intracellulaire bacteriële pathogenen ─ bacteriën die infectieziekten en kunnen groeien en reproduceren in de cellen van menselijke gastheren ─ zijn een belangrijk gezondheidsprobleem wereldwijd 5. Binnen te vallen en te repliceren binnen een zoogdiercel, hebben intracellulaire pathogenen verfijnde virulentie mechanismen en factoren verworven. Hoewel deze zijn essentieel voor het vermogen om een ​​ziekte te veroorzaken, weten we weinig over hun regulatie en dynamiek. Aangezien genexpressieprofielen bacteriën gekweekt in vloeibaar medium niet de werkelijke omgeving binnen gastheercellen weerspiegelen, is er een groeiende behoefte aan transcriptoom analyse bacteriën gekweekt in hun intracellulaire niches. Dergelijke analyses zullen de ontcijfering van specifieke bacteriële aanpassingen naar aanleiding van de gastheer mogelijk te maken en zal helpen om nieuwe targets te identificeren voor therapeutische design. Transcriptoom analyse van intracellulaire bacteriën gekweekt zeer uitdagend omdat zoogdier RNA overtreffen bacterieel RNA met tenminste tienvoudige. In dit manuscript beschrijven we een experimentele methode om bacteriële RNA isoleren van Listeria monocytogenes bacteriën groeien binnen muizen macrofaag cellen. Het geëxtraheerde RNA kan worden gebruikt om intracellulaire aanpassingen en virulentiemechanismen van pathogene bacteriën met verschillende technieken van transcriptie analyse, zoals RT-PCR, RNA-Seq, microarray en andere op hybridisatie gebaseerde technieken bestuderen.

L. monocytogenes is de verwekker van listeriose bij de mens, een ziekte met klinische verschijnselen die vooral op immuungecompromitteerde personen, ouderen en zwangere vrouwen 6. Het een Gram-positieve facultatief intracellulaire pathogeen dat een breed scala aan zoogdiercellen die al tientallen jaren als model gastheer-pathogeen interacties bestudeert 7 binnendringt. Bij invasie, verblijft het eerst in een vacuole of phagosome (bij fagocytische cellen), waaruit moet ontsnappen in tHij gastheercel cytosol om te repliceren. Verscheidene virulentiefactoren is aangetoond dat de ontsnapping proces, voornamelijk de porievormende hemolysine, listeriolysine O (LLO) en twee extra fosfolipasen 8 mediëren. In het cytosol gebruiken de bacteriën de gastheer actine polymerisatie machines zich voortbewegen op actine filamenten in de cel en verspreiding van cel naar cel (figuur 1). Alle belangrijke virulentiefactoren van L. monocytogenes die betrokken zijn bij de invasie, intracellulaire overleving en replicatie, worden geactiveerd door de master virulentie transcriptie regulator, PRFA. 8-10.

In de afgelopen tien jaar verschillende studies uitgevoerd door ons en anderen hebben met succes toegepast methoden voor de transcriptoom analyse van intracellulaire gegroeid bacteriën in gastheercellen 2,11-15. Twee benaderingen worden gebruikt om bacteriële RNA te scheiden van gastheer-RNA dat is gebaseerd op: 1) Selectieve verrijking van bacteriële RNA en 2) RNA-isolatie door differential cellysis. De eerste benadering is gebaseerd op subtractieve hybridisatie van totaal RNA-extracten van zoogdieren RNA-moleculen (bijvoorbeeld met behulp van commercieel verkrijgbare kits) of selectieve vangen van bacteriële getranscribeerde sequenties (SCOTS) 11. De tweede benadering is gebaseerd op differentiële lysis van bacteriën en gastheercellen, waarbij de gastheercellen worden gelyseerd terwijl bacteriële cellen intact blijven. Bacteriële cellen worden vervolgens gescheiden van de gastheer cellysaat, gewoonlijk door centrifugeren, en het RNA wordt geëxtraheerd onder toepassing van standaardtechnieken. Het grootste probleem met deze benadering is dat samen met de intacte bacteriën gastheercellen kernen zijn ook geïsoleerde, waardoor het RNA preparaten zoogdier RNA bevatten nog steeds. Een manier om dit probleem te overwinnen is intacte bacteriën te scheiden van gastheercellen kernen met behulp van differentiële centrifugatie, maar dit neemt doorgaans tijd die het probleem van veranderingen in genexpressie profiel tijdens extractie. In dit artikel geven we een betere en snelle bacteria RNA-extractie protocol, dat is gebaseerd op differentiële cel lysis benadering. Eerst, L. monocytogenes geïnfecteerde macrofaag-cellen worden gelyseerd met koud water. Vervolgens worden macrofaag kernen verwijderd door een korte centrifugatie en intacte bacteriën snel verzameld op filter, waaruit RNA wordt geïsoleerd met behulp van hete fenol SDS-extractie van bacteriële nucleïnezuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Opmerking: Gedurende het gehele experiment worden macrofaag cellen geïncubeerd bij 37 ° C in een 5% CO 2 geforceerde incubator genomen uit de incubator alleen voor experimentele manipulaties die worden uitgevoerd in een Klasse II biologische veiligheidskast. Werken met L. monocytogenes bacterie is volgens de biologische veiligheid niveau 2 regelgeving.

1. Celbereiding en bacteriële infectie (dag 1 en 2)

  1. Dag 1
    1. Zaad 2,0 x 10 7 beenmerg afgeleide cellen macrofagen (BMDM) op een 145 mm schaal in 30 ml BMDM + Pen-Strep media (tabel 2). Zaad 3 platen voor elke bacteriestam te analyseren. Incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% CO 2 geforceerde lucht incubator.
    2. Start een 's nachts bacteriecultuur van wild-type (WT) L. monocytogenes stam 10403S in 10 ml Brain Heart infusie (BHI) medium bij 30 ° C in een standaard incubator. Plaats cultuur buizen schuin zonder schudden. Notitie:De groeicondities up-reguleren van de expressie van de genen flagella die efficiënte infectie bevordert.
  2. Dag 2
    1. Voorverwarmen BMDM medium (zonder Pen-Strep antibiotica) (Tabel 2) en fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C.
    2. Wassen macrofaag monolaag tweemaal met 25 ml voorverwarmde PBS antibiotica verwijderen. Voeg 30 ml vers BMDM medium.
    3. Was 1,5 ml overnacht bacteriecultuur met PBS door centrifugeren kiemen bij> 14.000 xg gedurende 1 min, gooi de supernatant en hersuspenderen bacteriën voorzichtig in 1,5 ml PBS door pipetteren. Herhaal dit twee keer.
    4. Infect elk macrofaag plaat met 0,5 ml van een gewassen 's nachts cultuur van wild-type L. monocytogenes. Bij gebruik van meerdere platen, besmetten elke plaat 15 min uit elkaar. Dit tijdsinterval zal toelaten oogsten elke plaat afzonderlijk aan het eind van de infectie.
      Opmerking: De multipliciteit van infectie (MOI) wordt bepaald door het uitplaten seriële verdunnings bacteriekweek gebruikt voor infectie op BHI-agarplaten en het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) na 24 uur incubatie van de platen bij 37 ° C. Gebruik 0,5 ml WT L. monocytogenes stam 10403S resulteert in een MOI van ~ 100 (100 CFU bacteriën per macrofaag cel). Bij de analyse van bacteriële mutanten in intracellulaire groei, moet een hogere MOI worden beschouwd.
    5. Na 0,5 uur incubatie bij 37 ° C, was de geïnfecteerde cellen tweemaal met PBS om ongebonden bacteriën te verwijderen en voeg 30 ml voorverwarmd medium BMDM. Bijgevoegde bacteriën internaliseren tijdens de komende 0,5 uur.
    6. Op 1 h na infectie, voeg 30 ul van gentamicine (1: 1000 tot een eindconcentratie van 50 ug / ml bereikt) om extracellulaire bacteriën te doden.
    7. Monteer het filter apparaat door het plaatsen van een filter hoofd op een verzamelen vloeistof kolf met een vacuüm uitlaatpoort. plaats dan een filter (0,45 pm) op een filterkop, gevolgd door een cilinder trechter en zet de verschillende onderdelen met een metalen clamp. Bereid ijskoude RNase-free water.
    8. Op 6 uur na infectie oogst bacteriën uit geïnfecteerde cellen als volgt. Behandel elke plaat afzonderlijk.
      Opmerking: Meestal, L. monocytogenes voltooit 1-log van de groei gedurende 6 uur van de infectie in macrofagen cellen. Langere incubaties kan leiden tot bacteriële overgroei en celdood van macrofagen, terwijl kortere incubatieperiode kan leiden tot aanzienlijk lagere bacteriële belasting. De MOI en het tijdstip van infectie kan worden aangepast om optimale condities te bereiken.
      1. Was geïnfecteerde cellen eenmaal met PBS. Voeg 20 ml van ijskoude RNase-free water om macrofaag lyseren. Met behulp van een cel schraper, schraap de cellen van de plaat snel, maar zorgvuldig.
      2. Verzamel gelyseerde cellen om een ​​50 ml conische buis. Vortex gedurende 30 sec. Centrifugeer bij 800 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
      3. Passeren de bovenstaande vloeistof door het filter waarbij gebruik wordt gemaakt van een vacuümsysteem. Met behulp van een pincet, rol de filter en zo snel mogelijk aan een 15 ml CONIcal buis. Snap-bevriezing van de buizen met de filters in vloeibare stikstof.
      4. Monteer de filterinrichting een nieuw filter voor het volgende monster, zoals beschreven in 1.2.7.
      5. Bewaar de filters bevroren bij -80 ° C voor de volgende dag. U kunt ook direct doorgaan naar nucleïnezuur extractie.

2. nucleïnezuren Extraction (dag 3)

Opmerking: Voer alle manipulaties met fenol en chloroform oplossingen in een zuurkast.

  1. Maak een 1: 1 mengsel van aangezuurde fenol: chloroform, 400 gl van elk monster. Meng in een aparte buizen, en dan trekken de resulterende waterlaag door aspiratie. Voeg 40 ul van 10% SDS.
  2. Ontdooi de filter bevattende buizen op ijs te koud. Aan elk filter bevattende buis voeg 650 ul acetaat-EDTA (AE) buffer (tabel 2).
  3. De volgende stappen zo snel mogelijk.
    1. Krachtig vortex de buis met de filter zodat de filter whisks de omtrek van de buis en de buffer volledig wast de filter. Houd de buis koud door het plaatsen van het weer op het ijs. Opmerking: Het kan nodig zijn om de buis bovendien vortex terwijl omgekeerd om de bacteriën volledig wassen van het filter.
    2. Herhaal dit voor alle buizen. Het kan nuttig zijn om weer op gang langs de suspensie kort (1 min bij 120 xg) aan het einde van het proces.
  4. Breng de bacteriën-bevattende buffer een microcentrifugebuis van 1,5 ml met de SDS en fenol / chloroform mengsel (zoals bereid in 2,1). Herhaal dit voor alle buizen. Het kan nodig zijn om het filter met buizen (1 min bij 120 xg) draaien opnieuw om resterende buffer krijgen van het filter.
  5. Plaats alle 1,5 ml buizen in een multi-tube vortex-apparaat en vortex op volle snelheid gedurende 10 minuten.
  6. Incubeer de buizen in een 65 ° C warmteblok 10 min. Centrifuge bij maximale snelheid (> 14.000 xg) gedurende 5 min.
  7. Breng de waterige fase (ongeveer 400 ui) van elk tUbe een nieuwe 1,5 ml buis met 40 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 1,0 ml 100% ethanol. Vortex elke buis grondig.
    Opmerking: Glycogeen kan in deze stap worden toegevoegd aan visualisatie van het geprecipiteerde pellet verbeteren.
  8. Incubeer de monsters bij -80 ° C gedurende 1 uur. Alternatief incubeer monsters bij -20 ° C overnacht. Vervolgens centrifuge de monsters bij 4 ° C gedurende 20 minuten bij maximale snelheid (> 14.000 xg).
  9. aspireren voorzichtig de ethanol (bovenste laag) van elke buis. Voeg 500 ul koude 70% ethanol aan elk monster en vortex grondig. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten bij maximale snelheid (> 1 4000 xg).
  10. aspireren voorzichtig de ethanol uit elke buis. De monsters worden gedurende ongeveer 2 minuten met behulp van een vacuüm verdamper zonder warmte. Niet over-drogen van de monsters.
  11. Voeg 25 pi RNase-vrij water aan elk monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Voorzichtig vortex en spin-neer.
  12. Meten RNA-concentratie in thij monsters met behulp van een microvolume UV-Vis spectrofotometer. Verwachten tot ongeveer 0,5 te halen - 1 pg van nucleïnezuren per plaat.
    Opmerking: Technische duplo kunnen worden gecombineerd in dit stadium.

3. DNase behandeling

  1. Stel de reactie volgens Tabel 1 in een microfugebuis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Voeg 450 gl RNase-vrij water en 500 ui fenol-chloroform-IAA mix (tabel 2), afzonderlijke fasen door centrifugeren gedurende 2 min bij maximale snelheid (> 14.000 xg).
  2. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 500 ul chloroform-IAA mix (tabel 2), vortex en afzonderlijke fasen door 2 min centrifugeren bij maximale snelheid (> 14.000 xg).
  3. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 1 ml ethanol en 50 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2). Vortex.
    Opmerking: Glycogeen kan in deze stap worden toegevoegd aan visualisatie van het geprecipiteerde pellet verbeteren.
  4. aspireren voorzichtig de ethanol uit elke buis. Voeg 500 ul koude 70% ethanol aan elk monster en vortex grondig. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten bij maximale snelheid. aspireren voorzichtig de ethanol uit elke buis.
  5. De monsters worden gedurende ongeveer 2 minuten met behulp van een vacuüm verdamper zonder warmte. Niet over-drogen van de monsters.
  6. Voeg 12 gl RNase-vrij water, incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, vortex, en gaat draaien. De monsters bevatten gezuiverde RNA, houd ze op ijs. Alternatief los RNA in RNase-vrij H2O met 0,1 mM EDTA of TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
  7. Meet RNA concentraties met behulp van een microvolume UV-Vis spectrofotometer. Verwacht ~ 100 ng RNA per monster (indien technisch replica worden gecombineerd).
    Opmerking: RNA geëxtraheerd volgens dit protocol is geschikt for gentranscriptie analyse van meerdere technieken. We meestal maken gebruik van RT-qPCR analyse om L. te studeren monocytogenes gentranscriptie tijdens infectie van macrofagen cellen 1-4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het modelsysteem is getoond in figuur 1 en omvat macrofaag cellen geïnfecteerd met L. monocytogenes bacteriën, die repliceren in het macrofaag cytoplasma. Figuur 2 geeft het experimentele schema. Figuur 3 toont kenmerkende resultaten van deze RT-qPCR analyse van virulentiegenen tijdens WT L. monocytogenes groei van macrofagen in vergelijking met de groei in rijke laboratoriummedium BHI. De resultaten tonen de transcriptieniveaus van twee belangrijke virulentiefactoren van L. monocytogenes; HLY coderend LLO toxine en ACTA coderend actine assemblage eiwit, dat robuust worden geïnduceerd na infectie van macrofagen.

Figuur 1
Figuur 1: Algemeen overzicht van L. monocytogenes Lifestyle als een Intracellular ziekteverwekker. L. monocytogenes binnenvalt gastheercellen met het uitspreken van gespecialiseerde eiwitten genoemd internalins die actief internalisatie induceren in niet-fagocytische cellen, terwijl fagocyten fagocyteren de bacteriën. Bij invasie, L. monocytogenes is in eerste instantie binnen een endosoom / phagosome vacuole waaruit het snel ontsnapt met behulp van de eerste plaats de listeriolysin O toxine (LLO). In de gastheercel cytosol L. monocytogenes repliceert snel en verspreidt van cel naar cel gebruikt actine gebaseerde motiliteit via de ActA-eiwit. Alle genoemde virulentiefactoren worden gereguleerd door de meester virulentie activator, PRFA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: een stroomschema Vertegenwoordigen van de Experimental Procedure. De belangrijkste stappen omvatten lysis van geïnfecteerde cellen, scheiding van gastheercellen kernen en bacteriecellen en RNA-isolatie. Kritische stappen worden geïllustreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: transcriptie analyse van virulentiegenen tijdens L. monocytogenes Intracellulaire groei. Transcriptie analyse van hly gen (dat codeert LLO) en van de ACTA gen tijdens L. monocytogenes 10403S intracellulaire groei macrofaag cellen bij 6 uur na infectie in vergelijking met het niveau in exponentiële groei in BHI medium via RT-qPCR analyse. Transcriptieniveaus worden weergegeven als relatieve hoeveelheid (RQ), relatievede transcriptie niveaus tijdens de groei in BHI. Transcriptieniveaus werden genormaliseerd op het niveau van 16S rRNA als een referentie-gen. De gegevens zijn representatief voor 3 onafhankelijke biologische herhalingen (N = 3). Error bars vertegenwoordigt 95% betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

RNA tot 2 ug (in maximaal volume van 44 gl)
10x DNase buffer 5 gl
RNase-free water volledigheid 50 ui totaal volume
DNAse 1 jul (1 eenheid)

Tabel 1: Reactie DNase protocol.

1. 500 ml BMDM + Pen-Strep media (Filter gesteriliseerd):
DMEM 235 ml
FBS (geïnactiveerd 30 min bij 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929 geconditioneerd medium) 19 150 ml
glutamine 5 ml
natriumpyruvaat 5 ml
P-Mercaptoethanol 0,5 ml
Penicilline / streptomycine 5 ml
Totaal 500 ml
2. 500 ml BMDM (filter gesteriliseerd):
DMEM 235 ml
FBS (geïnactiveerd 30 min bij 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929 geconditioneerd medium) 19 150 ml
glutamine 5 ml
natriumpyruvaat 5 ml
P-Mercaptoethanol 0,5 ml
Totaal 500 ml
3. AE buffer
NaOAc pH 5,2 50 mM
EDTA 10 mM
RNase-free water
4. fenol-chloroform-IAA
Fenol 25 ml
Chloroform 24 ml
Iso-amylalcohol 1 ml
5. chloroform-IAA
Chloroform 24 ml
Iso-amylalcohol 1 ml

Tabel 2: Recepten van Media en buffers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De hier beschreven protocol vormt een geoptimaliseerde methode voor de isolatie van bacteriële RNA uit L. monocytogenes bacteriën intracellulair groeien in macrofaagcellen. Dit protocol is gebaseerd op differentiële cel lysis en omvat twee belangrijke stappen voor de verrijking van bacteriële RNA: macrophage kernen sedimentatie middels centrifugatie en snelle ophoping van bacteriën door filtratie. Deze stappen worden gevolgd door een standaard RNA-extractieprocedure. Hoewel dit protocol beschrijft zuivering van Listeria RNA, kan gemakkelijk worden gewijzigd om andere bacteriële pathogenen. Hoewel de werkwijze is gericht op de zuivering van RNA voor transcriptionele analyse kan het principe gebruikt om intracellulair groeiende bacteriën zijn gastheer scheiden ook worden toegepast voor de zuivering van andere bacteriële componenten, zoals DNA, eiwitten celwand, Dergelijke genomische en biochemische analyses zou een beter begrip en karakterisering van het intracellulaire pathogeenlevenscyclus tijdens infectie.

De werkwijze geeft ~ 100 ng totaal bacterieel RNA. Hoewel RNA opbrengst relatief laag zijn ze geschikt voor stroomafwaartse analyses van gentranscriptie gebruik van meerdere technieken, zoals RT-qPCR, RNA-Seq en moderne hybridisatie gebaseerde technologieën. RNA opbrengst te verbeteren, is het raadzaam om verse bacteriële inocula, evenals verse fenoloplossing nuclease-vrij water en buffers RNase mogelijke verontreinigingen te voorkomen. Verzamelde bacteriën en geïsoleerde RNA altijd op ijs gehouden tijdens het extractieproces. De infectie kan worden ingesteld afhankelijk van de biologische vraag alsmede de bestudeerde organisme. Om de bedragen van RNA te verhogen, kan het experiment worden opgeschaald naar meer infectie platen per elk monster bevatten.

De grootste zorg bij het uitvoeren van een dergelijk experiment is het risico van het veranderen van de transcriptie profiel van de bacteriën tijdens het oogsten stappen. De meeste bacteria reageren op lage temperaturen door het activeren koudeschok stressrespons, en dus bacteriële oogsten, moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Reagentia en apparatuur moet van tevoren worden voorbereid, en elk monster moet afzonderlijk worden behandeld. De meest kritische stap moet onmiddellijk bevriezen-filter dat bacteriën in vloeibare stikstof. Als u dit niet doet, kan drastisch verminderen van de kwaliteit van het geïsoleerde RNA. Een andere belangrijke stap in dit protocol is het ethanolprecipitatie van de betrekkelijk kleine hoeveelheden van nucleïnezuren. Extra zorg moet worden gehouden met de onzichtbare nucleïnezuren pellet niet te verstoren. Glycogeen kan worden toegevoegd om precipitatie oplossing voor visualisatie van het pellet te verbeteren tijdens deze stappen.

Voor sommige latere aanvragen, bv RT-qPCR, het verwijderen van DNA is van cruciaal belang. Hoewel we niet routinematig controleren van de doeltreffendheid van de DNase behandeling, vermindering van 3-5 maal de totale hoeveelheid nucleïnezuren volgende DNase tehandeling wijst op efficiënte DNase behandeling. Van de nota, alle commercieel beschikbare techniek of kit voor DNA verwijdering uit RNA-monsters geschikt is. Voorts worden volgens controlemonsters kwaliteit, zoals een monster zonder reverse transcriptie uitgevoerd, voordelig in dergelijke toepassingen.

Een belangrijke beperking van de hier beschreven protocol is de relatief lage hoeveelheid geëxtraheerd RNA, dat is ongeveer 100 ng totaal RNA. Aldus is deze techniek niet geschikt voor klassieke hybridisatie technieken zoals Northern-blot-analyse, die microgram RNA vereisen.

De recente technologische vooruitgang in RNA sequentie (deep RNA-seq) maakt de analyse van zowel de bacteriële ziekteverwekker en de zoogdiergastheer transcriptie profielen samen, zonder de noodzaak om hun RNA te scheiden, een methode genaamd "dual RNA-seq" 16-18. Hoewel dubbele RNA-seq analyse ideale bestuderen gastheer-pathogeen interactie is zeer expensive en kan niet vaak worden gebruikt. Omdat bacteriële RNA-gehalte in geïnfecteerde cellen is bijzonder laag, is het bijzonder moeilijk en duur om genoeg bacteriële leest een effectieve genexpressieanalyse, zelfs met de hoge lees diepte door nieuwste sequencing platforms. Een bijkomend nadeel van deze aanpak is het veelvuldig gebruik van een RNA of cDNA amplificatiestap, wat kan leiden tot vertekende resultaten van genexpressie. De hier gepresenteerde methode biedt een compromis tussen verkregen en kosteneffectiviteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
β-Mercaptoethanol Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30 °C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. World Health Organization WHO. http://www.who.int/en/ (2005).
  6. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  7. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  8. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  9. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  10. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  11. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  12. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  13. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  15. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  16. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  17. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
  18. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
  19. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  20. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  21. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
RNA Zuivering van Intracellulair Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofaag-cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).More

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter