Summary

RNA精製は、細胞内から成長します<em>リステリア菌</em>マクロファージ細胞で

Published: June 04, 2016
doi:

Summary

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Abstract

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

Introduction

細胞内細菌性病原体─感染症とヒト宿主の内部細胞を増殖し、再生することができるの原因となる細菌は─世界の主要な健康問題5です。侵入し、哺乳動物細胞内で複製するには、細胞内病原体は、洗練された病原性のメカニズムと要因を取得しています。これらのメカニズムは、疾患を引き起こす能力の基本であるが、我々は彼らの規制とダイナミクスについて少し知っています。液体培地中で増殖させた細菌の遺伝子発現プロファイルは、宿主細胞内の実際の環境を反映していないので、それらの細胞内ニッチで増殖した細菌のトランスクリプトーム解析の必要性が高まっています。このような分析は、ホストによってトリガーした特定の細菌の適応の解読を可能にし、治療設計のための新しいターゲットを識別するのに役立ちます。哺乳動物のRNAがでによって細菌RNAを上回っているため、細胞内で増殖させた細菌のトランスクリプトーム解析は非常に困難です少なくとも10倍。本稿では、我々は、マウスマクロファージ細胞内で成長しているリステリア菌の細菌から細菌RNAを単離するための実験方法を説明します。抽出されたRNAは、RT-PCR、RNA-のSeq、マイクロアレイおよび他のハイブリダイゼーションに基づく技術のような転写分析の様々な技術によって、病原性細菌の細胞内の適応と毒性メカニズムを研究するために使用することができます。

リステリア菌は、ヒトのリステリア症の原因物質で、主に免疫無防備状態の個体、高齢者や妊娠中の女性6をターゲット臨床症状を伴う疾患です。それ 7を研究する宿主-病原体相互作用でモデルとして何十年も使用されてきた哺乳動物細胞の広い配列に侵入グラム陽性の通性細胞内病原体です。侵略の際に、それはトンにエスケープする必要があり、そこから液胞または(食細胞の場合)ファゴソームに最初に存在します彼は、複製するために細胞質ゾルをホストします。いくつかの病原性因子は、エスケープ処理、主に細孔形成溶血素、リステリオリシンO(LLO)および2つの追加のホスホリパーゼ8を媒介することが示されています。細胞質ゾル中の細菌は細胞内のアクチンフィラメント上で自分自身を推進すると( 図1)細胞から細胞へ拡散するためにホストアクチン重合の機械を使用しています。 L.のすべての主要な病原性因子侵入に関与モノサイトゲネス 、細胞内生存および複製、マスター病原性転写調節因子、PRFAによって活性化される。8-10。

この10年間、私たちと他の人が行ったいくつかの研究は、正常宿主細胞2,11-15内部の細胞内で増殖させた細菌のトランスクリプトーム解析のための方法を適用しています。 diffeによる細菌RNAの1)選択的濃縮および2)RNA単離:二つの主要なアプローチが基づいているホスト-RNAから細菌RNAを分離するために使用されますrential細胞溶解。最初のアプローチは、(市販のキットを用いて、例えば)は、哺乳動物RNA分子または細菌転写配列(SCOTS)11を選択的に捕獲する全RNA抽出物のサブトラクティブハイブリダイゼーションに依存しています。第二のアプローチは、細菌細胞が無傷のままで宿主細胞が溶解された細菌宿主細胞の示差溶解に依存します。バクテリア細胞は、次いで、通常、遠心分離によって、宿主細胞溶解物から分離され、そしてRNAは、標準的な技術を使用して抽出されます。このアプローチを使用して主な問題は、一緒に完全な細菌を、宿主細胞の核は、したがって、RNA調製物はまだ、哺乳類RNAを含んでも単離されていることです。この問題を克服する一つの方法は、この手順は、通常、抽出中の遺伝子発現プロファイルの変化の懸念を高める時間を要するものの、分画遠心法を用いて、宿主細胞の核から無傷の細菌を分離することです。本稿では、改善されたと迅速なBAを提示します細胞差動溶解アプローチに基づいているcteria RNA抽出プロトコル。まず、L.モノサイトゲネス感染マクロファージ細胞を冷水で溶解します。次に、マクロファージ核を短時間の遠心分離によって除去され、無傷の細菌が急速にそのRNAからの細菌の核酸のホットフェノールSDS抽出を使用して単離し、フィルター上に収集されます。

Protocol

注:全実験の間に、マクロファージ細胞を、5%CO 2、強制空気インキュベーター中で37℃でインキュベートされ、唯一のクラスII生物学的安全キャビネット内で実施される実験操作、インキュベーターから取り出し。 L.での作業モノサイトゲネス細菌は生物学的安全性レベル2規則に従っています。 1.細胞の調製および細菌感染(1日目および2) 1日目 30…

Representative Results

モデルシステムは、 図1に示され、L.に感染したマクロファージ細胞を含みますマクロファージ細胞質ゾル中で複製モノサイトゲネス菌 、。 図2は実験スキームを表す。 図3は、WT L.中の病原性遺伝子のようなRT-qPCR分析の典型的な結果を表します豊富な実験室培地BHIの成長と比較して、マクロファージの成長を<…

Discussion

ここで説明するプロトコルは、Lからの細菌RNAの単離のために最適化された方法を表しマクロファージ細胞において細胞内で増殖する細菌をモノサイトゲネス 。このプロトコルは、細胞微分溶解に基づいており、細菌RNAの濃縮のための2つの主要なステップ含んでいる:遠心分離を用いてマクロファージ核沈殿、濾過による細菌の迅速な収集を。これらのステップは、標準のRNA抽?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.

Materials

Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
b-Mercaptoethanol   Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas, EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37°C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30°C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

References

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Cite This Article
Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

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