Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

RNA Rening från Intracellulärt Grown doi: 10.3791/54044 Published: June 4, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Intracellulära bakteriella patogener ─ bakterier som orsakar infektionssjukdomar och kan växa och reproducera inuti celler av mänskliga värdar ─ är ett stort hälsoproblem i världen 5. Att invadera och replikerar i en däggdjurscell, har intracellulära patogener förvärvat sofistikerade virulens mekanismer och faktorer. Även om dessa mekanismer är grundläggande för förmåga att orsaka en sjukdom, vi vet lite om deras reglering och dynamik. Eftersom genuttrycksprofilerna av bakterier som odlats i flytande media inte speglar den verkliga miljön i värdceller, det finns ett växande behov av transkriptom analyser av bakterier som odlas i deras intracellulära nischer. Sådana analyser kommer att göra det möjligt att dechiffrera av specifika bakteriella anpassningar utlöses av värden och kommer att bidra till att identifiera nya mål för terapeutisk konstruktion. Transkriptom analys av intracellulärt odlade bakterier är mycket utmanande eftersom däggdjurs RNA fler än bakteriellt RNA med åtminminst tio gånger. I detta manuskript, beskriver vi en experimentell metod för att isolera bakteriellt RNA från Listeria monocytogenes bakterier som växer inuti murina makrofagceller. Det extraherade RNA: t kan användas för att studera intracellulära anpassningar och virulens mekanismer av patogena bakterier genom olika teknikerna för transkriptionsanalys, såsom RT-PCR, RNA-Seq, microarray och andra hybridiseringsmetoder baserad teknik.

L. monocytogenes är orsakande medlet av listerios hos människor, en sjukdom med kliniska manifestationer riktar främst nedsatt immunförsvar, äldre och gravida kvinnor 6. Det är en grampositiva fakultativa intracellulära patogen som invaderar ett brett utbud av däggdjursceller som har använts i årtionden som en modell i värd-patogen interaktioner studerar 7. Vid invasionen, är bosatt den till en början i en vakuol eller ett phagosome (i fallet med fagocytiska celler), från vilken den måste fly in i than värdcell cytosolen för att replikera. Flera virulensfaktorer har visats förmedla escape processen, i första hand det porbildande hemolysin, listeriolysin O (LLO) och två ytterligare fosfolipaser 8. I cytosolen bakterierna använder värd aktin polymerisation maskiner för att driva sig på aktinfilament i cellen och att sprida sig från cell till cell (Figur 1). Alla större virulensfaktorer L. monocytogenes är involverade i invasionen, intracellulär överlevnad och replikering aktiveras av befälhavaren virulens transkriptionsregulator, PrfA. 8-10.

Under det senaste decenniet har flera studier som genomförts av oss och andra har framgångsrikt tillämpat metoder för transkriptom analys av intracellulärt odlade bakterier inuti värdceller 2,11-15. Två huvudsakliga tillvägagångssätt används för att separera bakteriellt RNA från värd-RNA, som är baserade på: 1) Selektiv anrikning av bakteriellt RNA och 2) RNA-isolering genom differential cellys. Den första metoden bygger på subtraktiv hybridisering av total RNA-extrakt till däggdjurs RNA-molekyler (t ex genom användning av kommersiellt tillgängliga kit) eller selektiv fångst av bakteriella transkriberade sekvenser (Scots) 11. Det andra tillvägagångssättet bygger på differentiell lys av bakterier och värdceller, i vilka värdcellerna lyseras medan bakterieceller förblir intakta. Bakterieceller separeras sedan från värdcellen lysatet, vanligen genom centrifugering och RNA extraheras med användning av standardtekniker. Det största problemet med hjälp av denna metod är att tillsammans med de intakta bakterier, är värdceller kärnor isolerades också, vilket RNA-preparaten innehåller fortfarande däggdjur RNA. Ett sätt att lösa detta problem är att separera intakta bakterier från värdceller kärnor med hjälp av differentiell centrifugering, men denna procedur tar vanligtvis tid höja oro över förändringar i genuttryck profil under extraktion. I denna uppsats presenterar vi en förbättrad och snabb bacteria RNA-extraktion protokoll, som är baserad på celldifferential lys strategi. Först, L. monocytogenes infekterade makrofagceller lyseras med kallt vatten. Därefter macrophage kärnor avlägsnas genom en kort centrifugering och intakta bakterier snabbt samlas på filter, varifrån RNA isoleras med hett fenol-SDS extraktion av bakteriella nukleinsyror.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not: Under hela experimentet, är makrofagceller inkuberades vid 37 ° C i en 5% CO 2 forcerad luft inkubator och tas ut ur inkubatorn endast för experimentella manipulationer, som utförs i en klass II biologiskt säkerhetsskåp. Arbeta med L. monocytogenes bakterier är enligt biologisk säkerhetsnivå 2 regler.

1. Cellberedning och bakterieinfektion (dag 1 och 2)

  1. Dag 1
    1. Frö 2,0 x 10 7 benmärgs härledda makrofagceller (BMDM) på en 145 mm skål i 30 ml BMDM + Pen-Strep media (tabell 2). Seed 3 plattor för varje bakteriestam som skall analyseras. Inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO 2 forcerad luftinkubator.
    2. Starta en övernattning bakterieodling av vildtyp (WT) L. monocytogenes stam 10403S i 10 ml hjärna-hjärta-infusion (BHI) medium vid 30 ° C i en standardinkubator. Placera odlingsrör skev utan skakning. Notera:Dessa tillväxtbetingelser uppreglera uttrycket av flagellerna gener, som främjar effektiv infektion.
  2. dag 2
    1. Pre-warm BMDM medium (utan Pen-Strep antibiotika) (tabell 2) och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C.
    2. Tvätta makrofag monolager två gånger med 25 ml förvärmda PBS för att avlägsna antibiotika. Tillsätt 30 ml färsk BMDM medel.
    3. Tvätta 1,5 ml natten bakteriekultur med PBS genom centrifugering bakterier vid> 14.000 xg under 1 minut och kasta supernatanten och återsuspendering bakterier försiktigt i 1,5 ml PBS genom pipettering. Upprepa två gånger.
    4. Infektera varje makrofag platta med 0,5 ml av en tvättad natten kultur av vildtyp L. monocytogenes. Om du använder flera plattor, infektera varje platta 15 minuter isär. Detta tidsintervall gör det möjligt att skörda varje platta individuellt vid slutet av infektionen.
      Obs: multiplicitet av infektion (MOI) analyseras genom plätering serieutspädnings från bakteriekultur användes för infektion på BHI-agarplattor och räkna kolonibildande enheter (CFU) efter 24 timmars inkubation av plattorna vid 37 ° C. Användning av 0,5 ml WT L. monocytogenes stam 10403S resulterar i en MOI av ~ 100 (100 bakterier CFU per makrofag cell). Vid analys av bakteriella mutanter defekta i intracellulär tillväxt, bör en högre MOI övervägas.
    5. Efter 0,5 h inkubation vid 37 ° C, tvätta de infekterade cellerna två gånger med PBS, för att avlägsna obundna bakterier, och tillsätt 30 ml förvärmda BMDM medel. Bifogade bakterier kommer internalisera under nästa 0,5 h.
    6. Efter 1 timme efter infektion, tillsätt 30 pl gentamicin (1: 1000 för att nå en slutlig koncentration av 50 | ig / ml) för att döda extracellulära bakterier.
    7. Montera filteranordning genom att placera ett filterhuvud på en uppsamling av vätska kolv med en vakuumutloppsport. Placera sedan ett filter (0,45 ^ m) på ett filterhuvud, följt av en cylinder tratt och fäst de olika delarna med en metall clampa. Förbereda iskall RNas-fritt vatten.
    8. Vid 6 h efter infektion, skörd bakterier från infekterade celler enligt följande. Behandla varje platta individuellt.
      Obs: Vanligtvis, L. monocytogenes avslutar en-logg över tillväxt under sex timmar av infektion i makrofagceller. Längre inkubationer kan leda till bakteriell överväxt och celldöd av makrofager, medan kortare inkubationsperioder kan leda till betydligt lägre bakterie laster. MOI och tidpunkten för infektion kan modifieras för att uppnå optimala förhållanden.
      1. Tvätta infekterade celler med PBS en gång. Tillsätt 20 ml iskall RNas-fritt vatten för att lysera makrofagceller. Användning av en cellskrapa, skrapa cellerna från plattan snabbt men noggrant.
      2. Samla lyserade celler till en 50 ml koniskt rör. Vortex under 30 sek. Centrifugera vid 800 xg under 3 min vid 4 ° C.
      3. Passera supernatanten genom filterapparat som använder ett vakuumsystem. Med hjälp av pincett, rulla filtret och snabbt överföra den till en 15 ml CONIcal rör. Snap-frysa rören med filtren i flytande kväve.
      4. Montera filtreringsapparaten med ett nytt filter för nästa prov, såsom beskrivs i 1.2.7.
      5. Lagra de frysta filtren vid -80 ° C för nästa dag. Alternativt, gå direkt till nukleinsyra extraktion.

2. Acids Extraction (Dag 3)

Obs: Utför alla manipulationer med fenol och kloroform lösningar i ett dragskåp.

  1. Förbered en 1: 1 blandning av surgjord fenol: kloroform, 400 l för varje prov. Blanda i separata rör, och sedan dra tillbaka den resulterande vattenskiktet genom aspiration. Tillsätt 40 | il av 10% SDS.
  2. Tina filterinnehållande rören på is för att hålla dem kalla. Till varje filter-innehållande röret till 650 | il acetat-EDTA (AE) buffert (Tabell 2).
  3. Utför följande steg så snabbt som möjligt.
    1. Kraftigt Vortexa röret innehållande filtret såatt filtret vispar till periferin av röret och bufferten tvättar fullt filtret. alltid hålla röret kallt genom att placera den tillbaka på is. Obs: Det kan vara nödvändigt att ytterligare virvel röret medan inverterad till fullo tvätta bakterier av filtret.
    2. Upprepa för alla rör. Det kan vara lämpligt att knoppa ned suspensionen strax (1 min vid 120 xg) i slutet av processen.
  4. Överföra bakterierna-innehållande buffert till en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande SDS och fenol / kloroform-blandning (såsom framställd i 2,1). Upprepa för alla rör. Det kan vara nödvändigt att snurra filter innehållande rör (1 min vid 120 xg) igen för att få kvarvarande buffert från filtret.
  5. Placera alla 1,5 ml rör i en flerrörsvirvelanordningen, och virvel i full hastighet under 10 minuter.
  6. Inkubera rören i en 65 ° C värmeblock under 10 min. Centrifugera vid maximal hastighet (> 14.000 xg) under 5 minuter.
  7. Överför vattenskiktet (ca 400 | j, l) från varje tUbe till ett nytt 1,5 ml rör innehållande 40 pl 3 M natriumacetat (pH 5,2) och 1,0 ml 100% etanol. Vortex varje rör noggrant.
    Notera: Glykogen kan tillsättas vid detta steg för att förbättra visualiseringen av det utfällda pelleten.
  8. Inkubera proverna vid -80 ° C under 1 timme. Alternativt inkubera proverna vid -20 ° C över natten. Därefter centrifugera proverna vid 4 ° C under 20 min vid maximal hastighet (> 14.000 xg).
  9. Försiktigt aspirera av etanol (övre skiktet) från varje rör. Tillsätt 500 | il kall 70% etanol till varje prov och vortexa grundligt. Centrifugera vid 4 ° C under 20 min vid maximal hastighet (> 1 4000 xg).
  10. Försiktigt aspirera bort etanolen från varje rör. Torka proven under ca 2 min med användning av en vakuumindunstare utan någon värme. Inte över torka proverna.
  11. Lägga 25 ul RNas-fritt vatten till varje prov. Inkubera vid rumstemperatur i 20 min. Noggrant virvel och spin-down.
  12. Mät RNA-koncentration i than prov med hjälp av en microvolume UV-Vis spektrofotometer. Räkna med att utvinna omkring 0,5-1 pg av nukleinsyror per platta.
    Obs: Tekniska replikat kan kombineras på detta stadium.

3. DNas Behandling

  1. Ställ upp reaktionen enligt Tabell 1 i ett mikrofugrör. Inkubera vid 37 ° C under 45 min. Lägg 450 | j, l RNas-fritt vatten och 500 fil fenol-kloroform-IAA blandning (tabell 2), separata faser genom centrifugering under 2 min vid maximal hastighet (> 14.000 xg).
  2. Överför vattenskiktet till ett nytt rör och tillsätt 500 pl kloroform-IAA mix (tabell 2), virvel och separata faser med 2 min centrifugering vid maximal hastighet (> 14.000 xg).
  3. Överför vattenskiktet till ett nytt rör och tillsätt 1 ml etanol och 50 | il 3 M natriumacetat (pH 5,2). Virvel.
    Notera: Glykogen kan tillsättas vid detta steg för att förbättra visualiseringen av det utfällda pelleten.
  4. Försiktigt aspirera bort etanolen från varje rör. Tillsätt 500 | il kall 70% etanol till varje prov och vortexa grundligt. Centrifugera vid 4 ° C under 20 minuter vid maximal hastighet. Försiktigt aspirera bort etanolen från varje rör.
  5. Torka proven under ca 2 min med användning av en vakuumindunstare utan någon värme. Inte över torka proverna.
  6. Tillsätt 12 ul av RNas-fritt vatten, inkubera under 2 min vid rumstemperatur, virvel, och spin-down. Proven innehåller renat RNA, hålla dem på is. Alternativt, lös RNA i RNas-fri H2O med 0,1 mM EDTA eller TE-buffert (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
  7. Mät RNA koncentrationer med hjälp av en microvolume UV-Vis spektrofotometer. Räkna med ~ 100 ng av RNA per prov (om tekniska replikat kombineras).
    Obs: RNA extraherat enligt detta protokoll är lämplig for gentranskription analys av flera tekniker. Vi använder vanligtvis RT-qPCR analys för att studera L. monocytogenes gentranskription under infektion av makrofagceller 1-4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Modellsystemet visas i figur 1 och inkluderar makrofag-celler infekterade med L. monocytogenes bakterier, som replikerar i makrofager cytosolen. Figur 2 visar den experimentella system. Figur 3 representerar typiska resultat av sådana RT-qPCR analys av virulensgener under WT L. monocytogenes tillväxten i makrofager i jämförelse med tillväxten i rika laboratoriemedium BHI. Resultaten visar de transkriptionsnivåer av två större virulensfaktorer av L. monocytogenes; hly kodar LLO toxin och actA kodar aktinsammansättning protein, vilket kraftigt induceras vid infektion av makrofager.

Figur 1
Figur 1: Allmän översikt över L. monocytogenes livsstil som jagntracellular Pathogen. L. monocytogenes invaderar värdceller genom att uttrycka specialiserade proteiner benämnda internalins som inducerar aktiv interna till icke-fagocytiska celler, medan fagocytiska celler fagocyterar bakterierna. Vid invasion, L. monocytogenes initialt inom en endosomen / phagosome vakuolen från vilken den snabbt försvinner med hjälp av främst listeriolysin O toxin (LLO). Inuti värdcellen cytosolen L. monocytogenes replikerar snabbt, och sprider sig från cell till cell med hjälp av aktin baserad motilitet via sin ActA protein. Alla nämnda virulensfaktorer regleras av befälhavaren virulens aktivator, PrfA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: ett flödesdiagram, som representerar den Experimental ordningen. De viktigaste stegen innefattar lys av infekterade celler, separation av värdceller kärnor och bakterieceller och RNA isolering. Kritiska steg illustreras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Transkription Analys av virulensgener under L. Transkription analys av hly-genen (som kodar för LLO) monocytogenes Intracellulär tillväxt. och Acta-genen under L. monocytogenes 10403S intracellulär tillväxt i makrofagceller vid 6 timmar efter infektion i jämförelse med sina nivåer under exponentiell tillväxt i BHI-medium med användning av RT-qPCR analys. Transkriptionsnivåer är representerade som relativ kvantitet (RQ), i förhållandetill transkriptionsnivåer under tillväxt i BHI. Transkriptionsnivåer normaliserades till nivåerna av 16S rRNA som en referens gen. Data är representativa för 3 oberoende biologiska upprepningar (n = 3). Felstaplar representerar 95% konfidensintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

RNA upp till 2 mikrogram (i max volym av 44 pl)
10x DNas-buffert 5 pl
RNas-fritt vatten komplett till 50 ^ total volym
DNAs 1 pl (1 enhet)

Tabell 1: DNase Reaction protokoll.

1. 500 ml BMDM + Pen-Strep media (filtersteriliserad):
DMEM 235 ml
FBS (inaktiverat 30 min vid 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929-konditionerat medium) 19 150 ml
glutamin 5 ml
natriumpyruvat 5 ml
p-merkaptoetanol 0,5 ml
Penicillin / streptomycin 5 ml
Total 500 ml
2. 500 ml BMDM (Filter steriliserad):
DMEM 235 ml
FBS (inaktiverat 30 min vid 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929-konditionerat medium) 19 150 ml
glutamin 5 ml
natriumpyruvat 5 ml
p-merkaptoetanol 0,5 ml
Total 500 ml
3. AE-buffert
NaOAc pH 5,2 50 mM
EDTA 10 mM
RNas-fritt vatten
4. fenol-kloroform-IAA
Fenol 25 ml
Kloroform 24 ml
Iso-amylalkohol 1 ml
5. kloroform-IAA
Kloroform 24 ml
Iso-amylalkohol 1 ml

Tabell 2: Recept för Media och buffertar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet som beskrivs här representerar en optimerad metod för isolering av bakteriell RNA från L. monocytogenes bakterier växer intracellulärt i makrofagceller. Detta protokoll är baserad på celldifferential lys och omfattar två viktiga steg för anrikning av bakteriell RNA: makrofag kärnor sedimente använder centrifugering och en snabb samling av bakterier genom filtrering. Dessa steg följs av en standard-RNA-extraktionsförfarande. Även om detta protokoll beskriver rening av listerial RNA, kan den lätt modifieras för andra bakteriella patogener. Även om metoden är inriktad på rening av RNA för transkriptionsanalys, kan principen som används för att separera intracellulärt växande bakterier från sin värd också användas för rening av andra bakteriella komponenter, såsom DNA, proteiner, cellväggen, etc. Sådana iskt och biokemiska analyser skulle ge en bättre förståelse och karakterisering av den intracellulära patogenenlivscykel under loppet av infektion.

De förfarande resulterar i ~ 100 ng av totalt bakteriellt RNA. Även RNA avkastningen är relativt låga, de är lämpliga för nedströms analys av gentranskription med hjälp av flera tekniker, såsom RT-qPCR, RNA-Seq och moderna hybridiserings baserad teknik. För att förbättra RNA avkastningen, är det rekommenderat att använda färska bakteriella ympar, samt färsk fenollösning nukleasfritt vatten och buffertar för att undvika eventuella RNas föroreningar. Skördade bakterier och isolerade RNA bör alltid hållas på is under utvinningsprocessen. Infektionen tid kan justeras beroende på den biologiska frågan och organismen studeras. För att öka mängden RNA, kan experimentet skalas upp till att omfatta fler infektions plattor per varje prov.

Det största problemet när man utför ett sådant experiment är risken för att förändra transkriptionen profil av bakterierna under skördestegen. mest bacteria svara på kyla genom att aktivera köldchock stressreaktioner och därmed bakterie skörd bör utföras så snabbt som möjligt. Reagens och utrustning bör förberedas i förväg, och varje prov bör behandlas separat. Det mest kritiska steget är att omedelbart frysa filterinnehållande bakterier i flytande kväve. Om du inte gör det kan dramatiskt försämra kvaliteten på den isolerade RNA. Ett annat kritiskt steg i detta protokoll är etanolutfällning av de relativt små mängder av nukleinsyror. Extra försiktighet bör iakttas för att inte störa den osynliga nukleinsyror pellet. Glykogen kan sättas till fällningslösningen för att förbättra visualiseringen av pelleten under dessa steg.

För vissa efterföljande ansökningar, t.ex. RT-qPCR, är kritisk avlägsna DNA. Även om vi inte rutinmässigt övervaka effektiviteten av DNas-behandling, en minskning med 3-5 gånger i den totala mängden av nukleinsyror efter DNas treatment är indikativ för effektiv DNas-behandling. Notera är någon kommersiellt tillgänglig teknik eller kit för DNA-avlägsnande från RNA-prover lämpliga. Dessutom, med användning av kvalitetskontrollprover, såsom ett prov utan någon omvänd transkription utförs, är fördelaktig i sådana tillämpningar.

En viktig begränsning av det protokoll som beskrivs här är den relativt låga mängden RNA extraherades, vilket är ca 100 ng av totalt RNA. Således är denna teknik inte lämplig för klassiska hybridiseringstekniker, såsom Northern blot-analys, som kräver mikrogram RNA.

Den senaste tidens tekniska framsteg i RNA-sekvensering (djup RNA-punkter) möjliggör analys av både bakteriell patogen och däggdjursvärdtranskriptionsprofiler tillsammans, utan att behöva separera sina RNA, en metod som heter "dubbel-RNA-artiklar" 16-18. Även dubbla RNA-seq analys är idealisk för att studera värdpatogen interaktion, är det mycket expensive och kan inte användas ofta. Eftersom bakteriellt RNA-halt i infekterade celler är särskilt låg, är det extremt svårt och dyrt att få tillräckligt med bakteriell läser för en effektiv genexpression analys, även med den höga avläsningsdjupet tillhandahålls efter senast sekvense plattformar. En ytterligare nackdel med detta tillvägagångssätt är den frekventa användningen av ett RNA eller cDNA amplifieringssteg, vilket kan leda till snedvridna resultat av genuttryck. Den metod som presenteras här erbjuder en kompromiss mellan information som erhållits och kostnadseffektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
β-Mercaptoethanol Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30 °C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. World Health Organization WHO. http://www.who.int/en/ (2005).
  6. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  7. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  8. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  9. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  10. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  11. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  12. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  13. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  15. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  16. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  17. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
  18. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
  19. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  20. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  21. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
RNA Rening från Intracellulärt Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).More

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter