Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.
Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.
Intracellulära bakteriella patogener ─ bakterier som orsakar infektionssjukdomar och kan växa och reproducera inuti celler av mänskliga värdar ─ är ett stort hälsoproblem i världen 5. Att invadera och replikerar i en däggdjurscell, har intracellulära patogener förvärvat sofistikerade virulens mekanismer och faktorer. Även om dessa mekanismer är grundläggande för förmåga att orsaka en sjukdom, vi vet lite om deras reglering och dynamik. Eftersom genuttrycksprofilerna av bakterier som odlats i flytande media inte speglar den verkliga miljön i värdceller, det finns ett växande behov av transkriptom analyser av bakterier som odlas i deras intracellulära nischer. Sådana analyser kommer att göra det möjligt att dechiffrera av specifika bakteriella anpassningar utlöses av värden och kommer att bidra till att identifiera nya mål för terapeutisk konstruktion. Transkriptom analys av intracellulärt odlade bakterier är mycket utmanande eftersom däggdjurs RNA fler än bakteriellt RNA med åtminminst tio gånger. I detta manuskript, beskriver vi en experimentell metod för att isolera bakteriellt RNA från Listeria monocytogenes bakterier som växer inuti murina makrofagceller. Det extraherade RNA: t kan användas för att studera intracellulära anpassningar och virulens mekanismer av patogena bakterier genom olika teknikerna för transkriptionsanalys, såsom RT-PCR, RNA-Seq, microarray och andra hybridiseringsmetoder baserad teknik.
L. monocytogenes är orsakande medlet av listerios hos människor, en sjukdom med kliniska manifestationer riktar främst nedsatt immunförsvar, äldre och gravida kvinnor 6. Det är en grampositiva fakultativa intracellulära patogen som invaderar ett brett utbud av däggdjursceller som har använts i årtionden som en modell i värd-patogen interaktioner studerar 7. Vid invasionen, är bosatt den till en början i en vakuol eller ett phagosome (i fallet med fagocytiska celler), från vilken den måste fly in i than värdcell cytosolen för att replikera. Flera virulensfaktorer har visats förmedla escape processen, i första hand det porbildande hemolysin, listeriolysin O (LLO) och två ytterligare fosfolipaser 8. I cytosolen bakterierna använder värd aktin polymerisation maskiner för att driva sig på aktinfilament i cellen och att sprida sig från cell till cell (Figur 1). Alla större virulensfaktorer L. monocytogenes är involverade i invasionen, intracellulär överlevnad och replikering aktiveras av befälhavaren virulens transkriptionsregulator, PrfA. 8-10.
Under det senaste decenniet har flera studier som genomförts av oss och andra har framgångsrikt tillämpat metoder för transkriptom analys av intracellulärt odlade bakterier inuti värdceller 2,11-15. Två huvudsakliga tillvägagångssätt används för att separera bakteriellt RNA från värd-RNA, som är baserade på: 1) Selektiv anrikning av bakteriellt RNA och 2) RNA-isolering genom differential cellys. Den första metoden bygger på subtraktiv hybridisering av total RNA-extrakt till däggdjurs RNA-molekyler (t ex genom användning av kommersiellt tillgängliga kit) eller selektiv fångst av bakteriella transkriberade sekvenser (Scots) 11. Det andra tillvägagångssättet bygger på differentiell lys av bakterier och värdceller, i vilka värdcellerna lyseras medan bakterieceller förblir intakta. Bakterieceller separeras sedan från värdcellen lysatet, vanligen genom centrifugering och RNA extraheras med användning av standardtekniker. Det största problemet med hjälp av denna metod är att tillsammans med de intakta bakterier, är värdceller kärnor isolerades också, vilket RNA-preparaten innehåller fortfarande däggdjur RNA. Ett sätt att lösa detta problem är att separera intakta bakterier från värdceller kärnor med hjälp av differentiell centrifugering, men denna procedur tar vanligtvis tid höja oro över förändringar i genuttryck profil under extraktion. I denna uppsats presenterar vi en förbättrad och snabb bacteria RNA-extraktion protokoll, som är baserad på celldifferential lys strategi. Först, L. monocytogenes infekterade makrofagceller lyseras med kallt vatten. Därefter macrophage kärnor avlägsnas genom en kort centrifugering och intakta bakterier snabbt samlas på filter, varifrån RNA isoleras med hett fenol-SDS extraktion av bakteriella nukleinsyror.
Protokollet som beskrivs här representerar en optimerad metod för isolering av bakteriell RNA från L. monocytogenes bakterier växer intracellulärt i makrofagceller. Detta protokoll är baserad på celldifferential lys och omfattar två viktiga steg för anrikning av bakteriell RNA: makrofag kärnor sedimente använder centrifugering och en snabb samling av bakterier genom filtrering. Dessa steg följs av en standard-RNA-extraktionsförfarande. Även om detta protokoll beskriver rening av listerial RNA, kan…
The authors have nothing to disclose.
The research in the Herskovits lab is supported by 335400 ERC and R01A/109048 NIH grants.
Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
DMEM | Gibco | 41965039 | |
Glutamine | Gibco | 25030081 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
b-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
DNaseI | Fermentas, | EN0521 | |
SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
37°C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
NanoDrop | Thermo Scientific | ||
145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
30°C incubator | Thermo Scientific | ||
65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
Liquid nitrogen |