Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الخلايا الجذعية وبناء الحصانة المهندسة ضد العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية في نموذج إنساني ماوس

Published: July 2, 2016 doi: 10.3791/54048
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

مع التطور السريع في العلاجات الجينية على الخلايا الجذعية ضد فيروس نقص المناعة البشرية، هناك ضغط الحاجة إلى نموذج حيواني لدراسة التمايز للدم وظيفة المناعة من الخلايا المعدلة وراثيا. وأنسنة العظام نخاع / الكبد / الغدة الصعترية (التأجير ونقل الملكية) نموذج الفأر يسمح لإعادة الكاملة لنظام المناعة البشري في محيطها، والتي تشمل خلايا تي، الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية وحيدات. زرع الغدة الصعترية البشري كما يسمح لاختيار الغدة الصعترية من خلايا تي في أنسجة الغدة الصعترية ذاتي. بالإضافة إلى دراسة عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، ونموذج يقف كأداة قوية لدراسة التفاضل والتنمية وظائف الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). نحن هنا الخطوط العريضة لبناء أنسنة غير البدناء السكري (نود) -severe جنبا إلى جنب العوز المناعي (SCID) جاما المشترك: سلسلة خروج المغلوب (ج γ - / -) الفئران العظم نخاع / الكبد / الغدة الصعترية (مجموعة موردي المواد النووية، التأجير ونقل الملكية) مع HSCs transduced مع CD4 مستقبلات المستضد خيالية (CD4CAR)ناقلات الفيروسة البطيئة. وتبين لنا أن CD4CAR HSCs يمكن أن تفرق بنجاح في الأنساب متعددة ولها نشاط مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. الهدف من هذه الدراسة هو للتدليل على استخدام نموذج الفأر مجموعة موردي المواد النووية، التأجير ونقل الملكية لتكون نموذجا في الجسم الحي للحصانة المهندسة ضد فيروس نقص المناعة البشرية. ومن الجدير بالذكر أن، لأنه يتم استخدام الفيروسة البطيئة والأنسجة البشرية، والتجارب والعمليات الجراحية يجب أن يتم تنفيذ في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية في السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) مع احتياطات خاصة (BSL2 +) المرفق.

Introduction

وعلى الرغم من نجاح العلاج المضاد للفيروسات الرجعية مجتمعة، والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية لا يزال المرض مدى الحياة. الاستجابة المناعية الخلوية ضد فيروس نقص المناعة البشرية تلعب دورا مهما للغاية في السيطرة على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية. وقد سمحت التطورات الحديثة في معالجة الخلايا الجذعية للتنمية السريعة من العلاج الجيني النهج لفيروس نقص المناعة البشرية العلاج 1-3. ونتيجة لذلك، فمن المهم أن يكون هناك نموذج حيواني المناسبة التي تسمح في الدراسة المجراة من فعالية العلاجات المستندة إلى الخلايا ضد فيروس نقص المناعة البشرية.

العمل مع فيروس نقص المناعة البشرية في النماذج الحيوانية معقد بسبب حقيقة أن الفيروس يصيب فقط الخلايا البشرية. للتحايل على هذا القيد، لجأ العلماء إلى استخدام نماذج الأمراض مثل فيروس نقص المناعة قردي (SIV) في قرود المكاك القرد 4،5. لسوء الحظ، هناك قيود كبيرة في هذا النموذج بسبب الخلافات المتأصلة بين الأنواع والاختلافات بين SIV وفيروس نقص المناعة البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فقط مرافق متخصصة للغاية هي جapable دعم العمل مع الرئيسيات غير البشرية وكل المكاك يتطلب استثمارات كبيرة. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لنموذج التي تستخدم نظام المناعة البشري، الذي هو عرضة لفيروس نقص المناعة البشرية عدوى / المرضية، وأقل باهظة من الناحية المالية.

غير البدناء السكري (نود) -severe جنبا إلى جنب العوز المناعي (SCID) جاما المشترك: سلسلة خروج المغلوب (ج γ - / -) (أو مجموعة موردي المواد النووية) الدم / الكبد / الغدة الصعترية (التأجير ونقل الملكية) ثبت الفأر نموذج إنساني على نحو متزايد أن يكون أداة هامة لدراسة عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. من خلال زرع الخلايا المكونة للدم الجذعية (HSCs) والغدة الصعترية الجنين، والفئران قادرة على تطوير وتلخيص نظام المناعة البشري 1-3. نوع واحد من العلاج الجيني على الخلايا الجذعية ينطوي على "إعادة توجيه" خلايا T الطرفية لاستهداف فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق إعادة برمجة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) على التمايز إلى مستضد خلايا T معينة. لقد أظهرنا سابقا أن HSCs الهندسة الجزيئية مع المستنسخة مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية محددة إعادة الخلايا التائيةمتقبل (TCR) ضد حاتمة SL9 (الأحماض الأمينية 77-85. SLYNTVATL) من HIV-1 الكمامة يمكن توجيه الخلايا الجذعية إلى تشكيل خلايا ناضجة تي أن قمع تكرار فيروس نقص المناعة البشرية في أنسنة مجموعة موردي المواد النووية-BLT نموذج الفأر 6. التحذير من استخدام TCR المستنسخة الجزيئي هو أنه يقتصر على سلالة معينة مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) من شأنها أن تحد من تطبيق هذا العلاج. مستقبلات المستضد خيالية (CAR)، من ناحية أخرى، يمكن تطبيقها عالميا لجميع أنواع فرعية HLA. أجريت الدراسات الأولية باستخدام سيارة شيدت مع مجالات خارج الخلية والغشاء من CD4 البشري تنصهر إلى ζ داخل الخلايا مما يشير مجال CD3 (يدعى CD4ζCAR). وأعرب CD4ζCAR على الخلايا التائية CD8 يمكن التعرف على المغلف فيروس نقص المناعة البشرية، وإثارة السامة للخلايا تي استجابة الخلية التي هي مماثلة لتلك بوساطة مستقبلات الخلايا التائية 7. لقد أثبتت مؤخرا أن HSCs الإنسان يمكن تعديلها مع CD4ζCAR، والتي يمكن بعد ذلك تفرق في لى المكونة للدم متعددةneages، بما في ذلك الخلايا T الوظيفية اللازمة للحد من تكرار فيروس نقص المناعة البشرية في نموذج الفأر أنسنة 8. مع التقدم السريع في خيالية العلاجات مستضد مستقبلات لسرطان 9، وتوصيف المستمر قوية الأجسام المضادة تحييد واسعة 10-12 ضد فيروس نقص المناعة البشرية التي تسمح ببناء سيارات الأجسام المضادة سلسلة واحدة، فإنه يمكن إدراكه أن العديد من بنيات مرشح جديدة، بالإضافة إلى CD4ζCAR ، سيتم إنشاء واختبار الخلايا الجذعية العلاج الجيني المعتمد من أمراض نقص المناعة البشرية والأمراض الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للنموذج الفأر مجموعة موردي المواد النووية-BLT أنسنة تحتوي على هذه السيارات مستضد معين توفر أيضا أداة مفيدة لدراسة عن كثب ردود الخلايا التائية البشرية في الجسم الحي. الأهم من ذلك، يختلف بروتوكول لدينا من الأساليب المذكورة السابقة لبناء أنسنة من الفئران BLT 13-15 في أن HSCs في خليط من البروتين هلامي يستخدم بدلا من جذوع الكبد الجنين 16. يصف هذا البروتوكول: 1) بناء حومانيالفئران BLT زيد هندسيا مع CD4ζCAR. و2) توصيف تمايز الخلايا المعدلة وراثيا. و3) توصيف وظائف الخلايا المعدلة وراثيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان أخلاقيات: الأنسجة الجنينية البشرية تم الحصول عليها من العلوم البيولوجية المتقدمة الموارد أو من Novogenix وتم الحصول عليها من دون تحديد المعلومات ولا تتطلب موافقة IRB لاستخدامها. تم إجراء البحوث الحيوانية وصفها في هذه المخطوطة بموجب موافقة خطية من جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس، ولجنة البحوث (جامعة كاليفورنيا) الحيوان (ARC) وفقا لكل دولة اتحادية، والمبادئ التوجيهية المحلية. على وجه التحديد، وأجريت هذه الدراسات في إطار يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمجلس الوطني للبحوث والاعتماد والمبادئ التوجيهية للجمعية لتقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوان (AALAC) الدولية تحت UCLA ARC بروتوكول عدد 2010-038-02B. تم تنفيذ جميع العمليات الجراحية تحت الكيتامين / زيلازين والتخدير الأيزوفلورين وقدمت كل الجهود للحد من الألم وعدم الراحة الحيوان.

1. بناء الفئران أنسنة المهندسة مع CD4 همي مستضد مستقبلات

  1. معالجة الجنين الغدة الصعترية وعزل CD34 + HSCs من كبد الجنين
    1. معالجة الغدة الصعترية
      1. غسل بلطف الغدة الصعترية في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4، في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. كرر غسل خطوة 3-4 مرات.
      2. إضافة 7 مل وسائل الاعلام RPMI + 10٪ FBS + القلم / بكتيريا. صب كل شيء في العقيمة 100 ملم طبق بيتري.
      3. استخدام المشارط لقطع الغدة الصعترية إلى قطع صغيرة حوالي 1 مم 2. وضع كل قطعة الغدة الصعترية واحد في بئر واحدة على لوحة 96-جيدا. استخدام ملقط منحنية حادة عند نقل قطع الصعترية لوحة 96-جيدا.
        1. إضافة كمية صغيرة من وسائل الاعلام (100-200 ميكرولتر) إلى كل من الآبار بحيث لا الأنسجة يست جافة. تصور تحت المجهر (السعتر يكون فصوص ويجب أن تبدو أكياس من الخلايا).
          ملاحظة: تخلصي من أي القطع التي تبدو موضع شك في أي شكل من الأشكال.هناك كثير من الأحيان النسيج الضام، وهذا لا ينبغي أن يكون مزروع.
      4. إزالة القطع أكدت-الغدة الصعترية ووضع كل منها في قارورة T25 ثقافة الخلية. إضافة 7 مل وسائل الاعلام RPMI تستكمل مع FBS 10٪ و 450 ميكروغرام / مل من بيبراسيللين / تازوباكتام وأمفوتيريسين ب قارورة صخرة بلطف لمزج. الثقافة بين عشية وضحاها قارورة في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
        ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لمنع التلوث الجرثومي من الأنسجة.
      5. (خطوة اختيارية) تجميد الغدة الصعترية لاستخدامها في المستقبل. تتوازن قطع في 90٪ AB الإنسان المصل مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمدة 10 دقيقة. تجميدها بمعدل 1 درجة مئوية / دقيقة إلى -50 درجة مئوية، ثم التبريد السريع إلى -150 درجة مئوية. عندما تصبح جاهزة لذوبان الجليد، ذوبان الجليد بسرعة في حمام الماء 37 درجة مئوية وغسل بلطف 3X في RPMI وسائل الإعلام كاملة دون [دمس].
    2. معالجة الكبد
      1. غسل بلطف الكبد في برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي 50 مل. كرر غسل خطوة 3-4 مرات.
      2. إضافة 10 مل (Iscove في التعديل Dulbecco وسائل الإعلام) وسائل الاعلام IMDM إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. صب كل شيء في 100 مم العقيمة طبق بيتري.
      3. التجانس أنسجة الكبد باستخدام اثنين من المشارط. قطع الكبد إلى قطع صغيرة من حوالي 3 مم 2. قطع ونبذ أي نوع من الأنسجة الضامة البيضاء.
      4. استخدام 10 مل حقنة مزودة قياس 16 إبرة حادة لتولي قطع الكبد وسائل الإعلام. ثم نقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
      5. resuspend بلطف وسائل الإعلام والأنسجة تعليق وطرد 5-7 مرات أكثر لتجانس الأنسجة تماما.
      6. استعد 10 مل سائل الإعلام IMDM تستكمل مع الانزيمات: 500 U / كولاجيناز مل، 2400 U / مل هيالورونيداز، و 300 U / الدناز مل فضلا عن 450 ميكروغرام / مل بيبراسيللين / تازوباكتام وأمفوتيريسين B. تصفية وسائل الإعلام عبر مرشح 0.22 ميكرون ثم إضافة وسائل الإعلام إلى تعليق الكبد.
      7. سقف ال 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي على تعليق الكبد وختم بإحكام مع الختم الذاتي فيلم مثل بارافيلم رس منع تسرب المياه. تدوير في محور دوار أنبوب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
      8. تصفية تعليق الخلية هضمها من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر في أنبوب 50 مل الطازجة.
        ملاحظة: إضافة برنامج تلفزيوني للتعليق، ليصبح إجمالي حجم ما يصل الى 50 مل. هذا الانقسام إلى أنبوبين من 50 مل أنابيب تحتوي كل منها على 25 مل من تعليق خلية.
      9. ببطء وبلطف الأساس الذي تقوم الخلايا في كل أنبوب مع 10 مل سائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي (على سبيل المثال، Ficoll). تدور في 1200 x ج لمدة 20 دقيقة دون فرامل. ملاحظة: يتم كل الطرد المركزي المذكورة في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
      10. إزالة بعناية واجهة (أي، الشهباء معطف) من كل أنبوب ونقل إلى منفصلين 50 مل أنابيب. تبرزي حجم كل أنبوب من واجهة ما يصل إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني. تدور في 300 x ج لمدة 7-10 دقائق. نضح طاف بعناية.
      11. الجمع بين الكريات اثنين. يغسل ثلاث مرات مع 50 مل برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FBS. تدور في 300 x ج لمدة 7 - 10 مفي كل مرة في حين الشفط بعناية طاف.
      12. Resuspend وبيليه في 50 مل سائل الإعلام RPMI + 10٪ FBS. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات في هذا الوقت قبل الشروع في فرز الخلايا.
      13. نوع CD34 + الخلايا باستخدام فورا CD34 فرز كيت (على سبيل المثال، CD34-حبات صغيرة)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
        ملاحظة: بدلا من ذلك، فإن الخلايا يمكن تربيتها في RPMI وسائل الاعلام + 10٪ FBS في 1000000 / مل بين عشية وضحاها.
      14. حفظ كل CD34 + وجزء CD34-.
        ملاحظة: في هذه الخطوة، والخلايا CD34 + وCD34- يمكن تجميد استخدام Bambanker سائل الإعلام تجميد أو غيرها من وسائط الإعلام التجميد. تجميد 1 مل من 4-6 × 10 6 CD34 + الخلايا في الأنبوب وتجميد 1 مل من 40 - 60 × 10 6 CD34- خلايا في أنبوب.
  2. تنبيغ CD34 + الخلايا
    1. حساب عدد من الآبار التنبيغ المطلوب من لوحة 6 جيدا الأنسجة الثقافة. 1 كذلك يمكن استخدامها لتنبيغ ما يصل إلى 8 × 10 6 خلايا. إلىوكل BLT الماوس، سيتم زرعها 0.5 × 10 6 CD34 + جنبا إلى جنب مع خلايا CD34- والغدة الصعترية تحت كبسولة الكلى و 0.5 × 10 6 CD34 + الخلايا يتم حقنه عن طريق الوريد. يتم تحديد عدد من CD34 + الخلايا لاستخدامها من قبل عدد من الفئران (1 مليون خلية في الماوس).
    2. معطف العدد المطلوب من الآبار ثقافة غير الأنسجة تعامل وحة 6 جيدا مع 1.25 مل من المؤتلف حل فبرونيكتين الإنسان (على سبيل المثال، Retronectin) (20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) في كل بئر. تغطية لوحة والسماح لها الوقوف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في خزانة السلامة البيولوجية نظيفة.
    3. نضح الحل فبرونيكتين من الآبار وإضافة 1.25 مل من FACS العازلة (PBS مع 4٪ FBS) إلى كل بئر حظر. السماح لوحة على الوقوف في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
    4. نضح FACS العازلة والآبار يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    5. حافظ على برنامج تلفزيوني في الآبار المغلفة حتى لوحة جاهزة للاستخدام. تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية خلال الليل اذا لم تستخدم على الفور.
    6. لوحة CD34 + الخلايا في العدوى المتوسطة (2٪ الإنسان مصل الزلال في Yssel في المصل خالية المتوسطة تي سيل) في الفيبرونكتين الآبار المغلفة حل (~ 2 × 10 6 خلية / مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. استخدام ماصة لإضافة ناقلات lentiviral إلى الآبار في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) بين 2 - 10. بلطف خلط واحتضان ليلا 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: عيار متجه الفيروسة البطيئة المستخدمة يجب أن تحدد مسبقا.
    8. حصاد الخلايا في صباح اليوم التالي عن طريق كشط بلطف قيعان الآبار مع مكشطة الخلية. جمع الخلايا والعد مع عدادة الكريات في هذا الوقت.
    9. لإعداد الخلايا للزرع، والجمع بين 0.5 × 10 6 CD34 + الخلايا transduced مع 4.5 × 10 6 CD34- الخلايا في الماوس، قسامة في العقيمة 1.5 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى. تدور الخلايا في أسفل 300 x ج لتكوير لهم، نضح طاف. تدور من جديد في 300 x ج ونضح أي طاف المتبقية باستخدام ماصة P10 والشفط كاليفورنيا جداrefully. الحفاظ على الكريات الجافة على الجليد طوال فترة الدراسة. ملاحظة: للتأكد من أن الخلايا هي قابلة للحياة، واستخدام الخلايا مكعبات وتنفيذ العملية في غضون 2-3 ساعة.
    10. لإعداد الخلايا لحقن، وتدور 0.5 × 10 6 transduced CD34 + الخلايا في الماوس لتكوير لهم، نضح طاف. و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر RPMI وسائل الإعلام في الماوس والحفاظ على الجليد.
    11. للتحقق كفاءة ترنسدوكأيشن، قسامة ~ 1 × 10 5 غير transduced وtransduced CD34 + الخلايا من كل حالة والثقافة في 200 متوسطة خلوى ميكرولتر (RPMI وسائل الاعلام مع FBS 10٪، على أن تستكمل مع 100 نانوغرام / مل IL-3 البشري، IL-6 ، SCF) في لوحة 96-جيدا ل5-7 أيام في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الخلايا المستخدمة في هذه الخطوة لا يستخدم لإجراء عملية جراحية ولكن للتأكد من أن التنبيغ ناجحة ومتجه ليست سامة للبقاء الخلايا الجذعية والتجديد. كفاءة تنبيغ يمكن التحقق من خلال البحث عن التعبير الجيني للناقلات (على سبيل المثال، GFP وCD4) وتحليل التدفق الخلوي.
  3. زرع الأنسجة لبناء الفئران المهندسة وراثيا
    1. في نفس اليوم قبل الجراحة أداء الكلي إشعاع الجسم من NOD.Cg- Prkdc SCID Il2rg ر m1Wjl / SzJ (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران المناعية للخطر مع Irradiator السيزيوم 137 وجرعة من 2.7 غراي (270Rad).
      ملاحظة: الفئران مجموعة موردي المواد النووية هي المناعة بشدة. لذلك مساكنهم والصيانة يجب أن تتفق مع أعلى معايير الصحة والتعامل معها من قبل الموظفين المدربين تدريبا عاليا.
    2. صب قطع الصعترية والمتوسطة من القارورة في صحن 60 ملم. صب برنامج تلفزيوني في طبق آخر 60 ملم، والتي سيتم استخدامها لتنظيف trochar والحفاظ على الكلى الرطب.
    3. هدئ إيجابية نصائح النزوح ماصة عن طريق وضعها في 1.5 مل فتح أنابيب معقمة المسمار الحد الأقصى على الجليد. الحفاظ على الجليد مع الكريات خلية المجففة وهلامي خليط من البروتين مثل Matrigel.
      ملاحظة: من المهم للحفاظ على خليط من البروتين هلامي وأي أنابيب أو النصائح التيسوف أتطرق إليها البرد في جميع الأوقات حتى يتم تحميل إبرة الزرع.
    4. تخدير الفئران: وزن الفئران بشكل فردي وأوزان قياسية؛ الأذن لكمة على الفئران لعدد منهم. ضخها داخل الصفاق مع 15 ميكرولتر من الكيتامين (2.6 ملغ / مل في المياه المالحة) / زيلازين (100 ملغ / مل في المياه المالحة) في كل غرام من وزن الجسم). وضع الفئران مرة أخرى في قفص وانتظر حتى يتم تخدير كامل.
      ملاحظة: تحقق من مستوى التخدير من الفأرة من خلال الضغط على مخلب. إذا كان الماوس flinches بالغريزة، إدارة 25-50٪ من المبلغ الأصلي من الكيتامين / زيلازين لتخدير الماوس أبعد من ذلك. الانتظار حتى أنها لا تتوانى بالغريزة لإجراء الجراحة.
    5. باستخدام المقص اوستر (ماكينة حلاقة)، ​​حلق الجانب الأيسر من كل فأر من الورك إلى تحمل بين وسط الظهر والمعدة. حقن تحت الجلد 0.3 مل من كاربروفين المخفف (6 ملغ / كغ) في الكتف الحيوان أو مثلث الإربي (الساق حفرة). باستخدام قطعة من القطن، ووضع قطرة صغيرة من الدموع الاصطناعيةعلى كل عين ووضع الماوس على جانبها مرة أخرى في قفص.
      ملاحظة: الحد جراحة الإعدادية إلى قفص واحد (حوالي 4-5 الفئران) في وقت واحد.
    6. تدفق قنية من قياس 16 السرطان زرع إبرة (مبزل) مع برنامج تلفزيوني. باستخدام زوج من ملقط منحنية حادة، ضع قطعة من الغدة الصعترية من الطبق 60 ملم في افتتاح قنية مع مبزل فقط داخل فتح، ثم سحب على مبزل لنضح الأنسجة في قنية.
    7. استخدام ماصة الإزاحة الإيجابية وتلميح المبردة لوضع 5 ميكرولتر من البرد خليط من البروتين هلامي في أنبوب مع خلية بيليه المجففة (CD34 + وCD34- الخليط لمدة الخلايا المزروعة) وبلطف اثارة لتوليد تعليق خلية. لا ماصة صعودا وهبوطا. ماصة هلامي البروتين تعليق / خليط الخلية في افتتاح قنية وسحب ببطء مرة أخرى على مبزل لتحميل الإبرة.
      ملاحظة: من المستحسن أن يكون نصيرا لتحميل ماصة في حين تعالج واحدة إبرة الزرع.
      8. <لى> مسحة حلق المنطقة من الفأرة مع بوفيدون اليود وبعد ذلك يمسح أسفل المنطقة مع الكحول يمسح ثلاث مرات. تحديد أحلك بقعة تحت الجلد. وهذا يدل على مكان وجود الطحال. الكلى ما يقرب من 5 ملم ظهري إلى الطحال. رفع الجلد بالملقط المنحنية وجعل شق طويل 15 ملم مع مقص جراحي في موازاة الجلد إلى الطحال. ثم اجراء خفض مماثل في الصفاق طبقة أدناه. في الذكور، وينبغي أن تكون الكلى مرئية بسهولة، ويمكن مقذوف ببساطة عن طريق الضغط على البطن. يمكنك دعم الكلى مع مرقئ أو زوج من الملقط حادة منحنية. في الإناث، والمبايض تميل لمنع الكلى من السهل الاستخراج. باستخدام مرقئ، والتقاط المبيض وبعناية فضح خارج الكلية.
    8. استخدام الملقط ذات الرؤوس إبرة لسحب ثقب صغير في نهاية الخلفي من الكبسولة الكلى.
      ملاحظة: لا تستخدم هذه الملقط ذات الرؤوس إبرة للتعامل مع المواد اقية.
    9. حرك زرعإبرة في هذه الحفرة وعلى طول الكلى حتى يتم تغطيتها بالكامل افتتاح قنية من كبسولة الكلى.
    10. قذف بلطف الأنسجة تحت كبسولة الكلى، وسحب الإبرة مرة أخرى للخروج. قطع الغدة الصعترية يمكن أن يكون لزجة وذلك باستخدام ملقط المنحنية للتأكد من أن قطعة الغدة الصعترية لا يخرج مع الإبرة.
    11. رفع الصفاق مع ملقط واستخدام بلطف مرقئ لدفع الكلى يعود إلى مكانه. ربط غرزة معقود مزدوج واحد في الصفاق باستخدام 4-0 vicryl الغرز للامتصاص. استخدام اثنين من Autoclips مقاطع الجرح لإغلاق الجلد.
    12. خلط transduced CD34 + الخلايا التي تم وضعها جانبا للحقن وامتصاص 100 ميكرولتر (0.5x10 6 خلايا) في حقنة الأنسولين. حقن هذه الخلايا في الماوس عن طريق حقن الوريد retroorbital أو غيرها من طرق الحقن في الوريد. باستخدام قطعة من القطن، ووضع قطرة صغيرة من الدموع الاصطناعية على كل عين ووضع الماوس على جانبها مرة أخرى في قفص.
    13. بمجرد ب كل الفئرانالتابعين مزروع، تأكد من أن الحيوانات لا يستعيد وعيه والتجول عادة قبل تركهم.
    14. الرعاية بعد العملية: في اليوم التالي للجراحة، حقن تحت الجلد 0.3 مل من المخفف كاربروفين (6 ملغ / كغ) و 1.2 مل من محلول ملحي في كل فأر. 2 و 3 أيام بعد الجراحة، تحت الجلد حقن 1.5 مل من محلول ملحي في كل فأر. مراقبة الفئران وشقوق لمدة 10-14 أيام بعد الجراحة. إزالة Autoclips وتزن الفئران بعد 10-14 يوما. ملاحظة: الفئران هي تباطؤ بعد الإشعاع وحقن المياه المالحة يمنع الحيوانات من أن تصبح المجففة.
    15. بعد 8-10 أسابيع، تحقق engraftment النزيف الفئران وإجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية في الدم المحيطي، تلطيخ لعلامات مثل CD45، CD3، CD4، CD8، وأي الجينات متجه يجب التعبير عنه.

2. توصيف التفاضل وتطوير خلايا الجينات المعدلة

  1. توصيفالجينات المعدلة خلايا من الدم المحيطي
    1. 8 - بعد 10 أسابيع زرع، يجب الحصول 50-100 ميكرولتر من الدم الماوس من الاستنزاف الرجعية المدارية. ضع في أنابيب microcentrifuge تحتوي على 10 ميكرولتر من EDTA. خلايا الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 3 دقائق. جمع البلازما. تجميد في -80 لتحليل ELISA أو البلازما الحمل الفيروسي فحص ما إذا كان الماوس مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية.
    2. إضافة 2 مل NH 4 الكلورين (83٪) حل لليز خلايا الدم الحمراء. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). بعد الحضانة، إضافة 10 مل RPMI FBS 10٪ لملء الأنبوب. تدور في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف بعناية. الخلايا جاهزة للالمناعية تلطيخ وتحليل التدفق الخلوي والمقايسات الأخرى.
      ملاحظة: علامات لمختلف الأنساب hematopoetic الخلية، التنشيط، وعلامات المظهرية للخلايا ساذجة أو الذاكرة يمكن أن تقاس قبل كل 2 أسابيع وبعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق التدفق الخلوي. يتم إنشاء البوابات من قبل تلطيخ الخلايا مع الضوابط نمط إسوي. فمن المستحسن أن وصمة عار صحيهاتش واى PBMCs الإنسان والاستخدام التي تحكم إيجابية. بدلا من ذلك، الماوس يمكن أن يتم التخلص ويمكن الحصول على ما يصل إلى 1 مل من الدم المحيطي من ثقب في القلب والتي سوف توفر ما يكفي من الخلايا لوحات متعددة من تحليل تدفق 17.
  2. توصيف الجينات المعدلة خلايا من الطحال والغدة الصعترية ونخاع العظم
    1. حصاد الطحال والغدة الصعترية ونخاع العظام من الفئران انساني التأجير ونقل الملكية
      1. الموت ببطء الفئران باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلورين. تأكيد القتل الرحيم مع خلع عنق الرحم الثانوي. رش سطح الذبيحة مع الايثانول 70٪ للحفاظ على الفرو من الالتصاق إلى الأنسجة. أحدد أطرافه على صينية الشمع تشريح.
      2. استخدام مقص جراحي، وقطع فتح الجلد، ومن ثم قطع طريق طبقة البريتوني لفضح تجويف الجسم.
      3. إزالة الطحال باستخدام ملقط. إزالة زرع الغدة الصعترية في الكلى باستخدام ملقط ومقص. وضع زرع الغدة الصعترية والطحال في المسمى أنابيب المآخذ الكهربائيةining 5 مل من برنامج تلفزيوني.
      4. من قطع منتصف البطن وإزالة الجلد من الجزء الأعلى من الفأرة التي تغطي الأطراف السفلية.
      5. قطع العضلات من الأطراف السفلية باستخدام مقص وخلخل بعناية acetabulum من مفصل الورك. إزالة عظم الفخذ والساق ووضعها في أنبوب يحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. عزل Splenocytes
      1. وضع مصفاة الخلية 100μm في أنبوب مخروطي 50 مل. الرطب مصفاة مع 3 مل من وسائل الاعلام RPMI تستكمل مع 10٪ FBS والقلم / بكتيريا (RPMI وسائل الإعلام كاملة).
      2. وضع الطحال على مصفاة الخلية. باستخدام المكبس المطاط من حقنة 10 مل، الهريس والطحال إلى فصل من خلال مصفاة في أنبوب 50 مل.
      3. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل RPMI وسائل الإعلام كاملة 4-5 مرات.
      4. تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
      5. نضح وطاف بيليه resuspend في 5 مل الدم الحمراء عازلة خلية تحلل. يحضن في درجة حرارة الغرفةتلح لمدة 10 دقيقة. إضافة 20 مل RPMI وسائل الإعلام كاملة وتدور في 300 x ج لمدة 7 دقائق.
      6. نضح وطاف بيليه resuspend في 10 مل RPMI وسائل الإعلام كاملة وتصفية مرة أخرى من خلال مصفاة 100 ميكرون الخلية. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
        ملاحظة: الخلايا يمكن استخدامها لخارج الجسم الحي المقايسات، وتدفق تحليل ويمكن تجميد ناجع لاستخدامها لاحقا. قبل عد الخلايا، التريبان الأزرق يمكن أن تستخدم لتحديد عدد خلايا قابلة للحياة.
    3. عزل Thymocytes الإنسان من زراعة
      1. ضع الغدة الصعترية في 5 مل من برنامج تلفزيوني في بئر من لوحة 6 جيدا. قطع باستخدام ملقط ومقص حادة نظيفة الغدة الصعترية إلى قطع صغيرة.
      2. وضع تعقيمها الفولاذ المقاوم للصدأ مربع شبكة في البئر. باستخدام المكبس المطاط من حقنة 10 مل، الهريس القطع الصعترية على شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ لتحطيم الغدة الصعترية.
      3. و resuspend الخلايا بشكل جيد وسلالة من خلال مصفاة 100 ميكرون الخلية. تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.تعليق الخلايا في 10 مل RPMI وسائل الإعلام كاملة. إذا كتل واضحة، لتمرير الخلايا معلق من خلال مصفاة الخلية مرة أخرى.
      4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
        ملاحظة: الخلايا يمكن استخدامها لتحليل تدفق وتجميد ناجع لاستخدامها لاحقا.
    4. عزل الخلايا من نخاع العظم
      1. نظيفة وتعقيم هاون ومدقة مع 70٪ من الإيثانول. وضع عظم الفخذ والساق إلى هاون. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. استخدام مدقة لسحق العظام حتى يتحول إلى برنامج تلفزيوني وردي فاتح وغائم.
      2. ماصة صعودا السائل من هاون ومرشح من خلال مصفاة الخلية 50 ميكرومتر وضعت على 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. غسل هاون مع 5 مل برنامج تلفزيوني، وكرر خمس مرات حتى يصبح برنامج تلفزيوني واضح.
      3. تدور الخلايا في أسفل 300 x ج لمدة 7 دقائق. طاف نضح و resuspend في 10 مل RPMI وسائل الإعلام كاملة.
      4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
        ملاحظة: الخلايا يمكن استخدامها لفحوصات خارج الحي، وتدفق التحليل ويمكن أن يكون المجمدة بشكل ناجع وأو في وقت لاحق استخدام.

3. توصيف الوظيفي للخلايا الجينات المعدلة

  1. عدوى فيروس نقص المناعة البشرية ورصد الفيروسية النسخ المتماثل على مر الزمن
    1. بعد التأكد من إعادة نظام المناعة البشرية، وضخ المبلغ المطلوب من فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق حقن الوريد الرجعية المدارية باستخدام حقنة الأنسولين. بعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، وجمع 100 ميكرولتر الدم المحيطي عبر الرجعية المدارية نزيف كل 2 أسابيع.
    2. حصاد البلازما عن طريق اتباع الخطوات الموجودة في الجزء 2.1.1 - 2.1.2. لفيروس نقص المناعة البشرية الحمل الفيروسي الفحص، استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وقياس العبء الفيروسي من قبل في الوقت الحقيقي RT-PCR مع التمهيدي والتحقيق المناسبة مجموعات لفيروس نقص المناعة البشرية المستخدمة 4،8،18،19.
    3. لقياس الخلية المرتبطة RNA فيروس نقص المناعة البشرية وتحديد الخلايا التي يصاب بنشاط بفيروس نقص المناعة البشرية، أولا إجراء RBC تحلل الخطوات التالية 2.1.2
    4. تعليق خلية resuspend في 1، مل برنامج تلفزيوني، وتقسيم بالتساوي إلى أنبوبين. تدور في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف.
    5. لقياس خلايا الحمض النووي الريبي المرتبطة بها، استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طقم استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وأداء في الوقت الحقيقي RT-PCR باستخدام التمهيدي والتحقيق مجموعات المناسبة.
      ملاحظة: من المهم أن التمهيدي / مسبار لا تعترف الفيروسة البطيئة تستخدم لتعديل الخلايا الجذعية
    6. لقياس فيروس نقص المناعة البشرية الخلايا المصابة عن طريق التدفق، وخلايا resuspend في أنبوب آخر في 50 ميكرولتر FACS العازلة وأداء وصمة عار السطح مع الأجسام المضادة المطلوبة مثل مكافحة CD45، ومكافحة CD4 ومكافحة CD3. بعد صمة عار السطح، إصلاح وpermeabilize الخلايا وصمة عار داخل الخلية للتعبير عن هفوة استخدام الألغام المضادة للالكمامة الأجسام المضادة (استنساخ KC57). أداء التدفق الخلوي.
  2. فيفو السابقين خلوى الفحص من الجينات المعدلة خلايا من Splenocytes
    1. splenocytes الحصاد من الفئران كما وصفها في القسم 2.2.2.
    2. إعداد الخلايا المستهدفة. لاختبار وظيفيإيتي من CD4 خيالية مستضد مستقبلات الخلايا التائية المعدلة، استخدام خلايا T1 المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية كما الخلايا المستهدفة. إصابة الخلايا T1 مع فيروس نقص المناعة البشرية قبل 3 أيام لفحص خلوى، تأكيد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق تلطيخ الخلايا داخل الخلية مع لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية الأجسام المضادة هفوة (استنساخ KC57). استخدام الخلايا غير المصابة T1 كما الخلايا السيطرة المستهدفة.
    3. شارك في احتضان splenocytes مع الخلايا المستهدفة أو السيطرة على نسبة 1: 1 بين عشية وضحاها. للحصول على أفضل نتيجة، إجراء المعايرة (1: 1، 1: 3، 1: 9) من المستجيب (splenocytes) مقابل الخلايا المستهدفة (المصابة T1s). على سبيل المثال، و resuspend 0.9 مليون splenocytes في 0.25 مل RPMI وسائل الإعلام كاملة، إضافة 0.9، 0.3 أو 0.1 مليون T1 مصاب أو غير مصاب T1s معلق في 0.25 مل RPMI وسائل الإعلام كاملة.
    4. في صباح اليوم التالي، إضافة المانع نقل البروتين لمدة 6 ساعات لكبح النقل البروتين وأداء تلطيخ لعلامات خارج الخلية والتعبير داخل الخلايا السيتوكينات كما هو موضح سابقا في 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 مخطط لبناء الفئران BLT أنسنة مع الخلايا الجذعية المعدلة. بعد 10 أسابيع من جراحة زرع، تم التضحية الفئران لتقييم التمايز وتطوير خلايا الجينات المعدلة. كما هو مبين في الشكل 2، تم حصاد متعددة الأنسجة اللمفاوية (الدم والطحال والغدة الصعترية ونخاع العظام) من ماوس التي تم تعديلها مع CD4ζCAR. وCD4ζCAR المستخدمة في هذا البروتوكول يتضمن CD4 خيالية مستقبلات المستضد وGFP التي يمكن الكشف عنها من قبل مكافحة CD4 الأجسام المضادة والتعبير عن GFP 8. تم عزل الخلايا وملطخة الأجسام المضادة ضد CD45 الإنسان وكذلك مكافحة CD4 الأجسام المضادة وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. تم الكشف عن GFP وCD4 خلايا إيجابية مزدوجة، تشير إلى وجود CD4CAR + الخلايا في الأنسجة اللمفاوية متعددة.

للتحقيق في تمايز الخلايا الجينية المعدلة، كانت ملطخة splenocytes مع الأجسام المضادة ضد CD45 البشري (اللمفاويات)، CD3 (خلايا تي)، CD19 (الخلايا البائية)، CD14 (الوحيدات والضامة) وCD337 (الخلايا القاتلة الطبيعية). كما هو مبين في الشكل (3)، CD4ζCAR الخلايا الجذعية المكونة للدم تفرق في الأنساب متعددة.

للتحقيق إذا كانت الخلايا CD4CAR المعدلة وظيفية، ونحن coincubated splenocytes مع الخلايا المستهدفة أن الخلايا CD4CAR ستعترف (خلايا T1 المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية أو الخلايا غير المصابة T1 عن السيطرة). خلايا اشتركت فى حضنت بين عشية وضحاها وأضاف المانع نقل البروتين لمدة 6 ساعات إضافية. بعد ذلك، تم إصلاح الخلايا وpermeabilized وصمة عار للتعبير الخلايا من السيتوكينات مثل IFNΓ وTNFα. كما هو مبين في الشكل (4)، أنتجت خلايا CAR معربا عن مبلغ أعلى من IFNΓ وTNFα مع خلايا T1 المصابة.

تحميل / 54048 / 54048fig1.jpg "/>
الشكل 1: مخطط البناء من الفئران BLT أنسنة مع الخلايا الجذعية المعدلة FT: الغدة الصعترية الجنين. فلوريدا: الكبد الجنين الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: يمكن الكشف عن خلايا معدلة CD4 مستضد خيالية مستقبلات في الأنسجة اللمفاوية متعددة الفأرة مع CD4CAR تعديل HSCs تم التضحية 10 أسابيع بعد الجراحة والأنسجة اللمفاوية متعددة تم حصادها وكانت ملطخة الخلايا مع CD45 مكافحة الإنسان ومكافحة الإنسان الأجسام المضادة CD4 وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في الصفحة = "1"> الشكل (3)
الرقم 3: الخلايا المعدلة CD4 مستضد خيالية مستقبلات يمكن أن تفرق في الأنساب متعددة Splenocytes من CD4CAR تعديل الفئران تم حصاد وملطخة أجسام مضادة ضد CD45 الإنسان، CD3، CD19، CD14 وCD337 وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: خارج الحي خلوى فحص خلايا CD4 + T CAR Splenocytes من فيروس نقص المناعة البشرية المصابة وحفز الفئران CD4CAR مع أي من فيروس نقص المناعة البشرية الخلايا المصابة أو غير مصاب T1 وإنتاج الخلايا التي من خلوى هو مبين. الرجاء انقر هنا للتنافسوا نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مع سيارة، وبناء على شهادة الثانوية العامة حصانة المهندسة تكتسب زخما نحو الدراسات السريرية، فمن المهم أن يكون هناك نموذج حيواني المناسبة لدراسة عن كثب التمايز وظيفة هذه الخلايا المهندسة. في هذا البروتوكول وصفنا طرق لبناء واختبار الفئران أنسنة مع المعدلة وراثيا الخلايا الجذعية من المهندسة ضد فيروس نقص المناعة البشرية. من المهم أن يكون التنبيغ كفاءة الخلايا الجذعية قبل الزرع. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى قدرة الخلايا التائية على التكاثر عند التحقق من الخلايا المستهدفة، وكانت مستويات منخفضة من تعديل الخلايا الجذعية كافية لتوليد استجابة قوية ضد تكرار فيروس نقص المناعة البشرية (8).

ومع ذلك، من أجل تحقيق مستوى عال من تعديل الخلايا الجذعية، ونحن نوصي باستخدام CD34 + transduced الخلايا في خليط من البروتين هلامي مع الغدة الصعترية ذاتي بدلا من الكبد والغدة الصعترية قطع لعملية جراحية الفئران التي تم وصفها في أماكن أخرى 13-15. هلامي خليط من البروتين هو solubilizالأنسجة إد الطابق السفلي غشاء غني في البروتينات المصفوفة خارج الخلية. في ظل ظروف طبيعية فسيولوجية، هلامي خليط من البروتين تتبلمر لإنتاج أعيد مصفوفة، النشطة بيولوجيا ومستقرة تسمح مرفق فعال وتمايز الخلايا الجذعية 20. إعادة الخلية البشرية ويمكن التحقق من نزيف الرجعية المدارية والتدفق الخلوي 6-8 أسابيع بعد الجراحة. للتأكد من أن ناقلات ليست سامة للبقاء الخلايا الجذعية والتجديد، فمن المستحسن أن عيار ناقلات في CD34 + الخلايا قبل التجربة كما هو موضح في 1.2.6.

قدرة نموذج الفأر مجموعة موردي المواد النووية، التأجير ونقل الملكية لدعم إصابة الغشاء المخاطي، فيروسية الدم ثابت والاستجابات المناعية الخلوية يجعلها نموذجا مفيدا للغاية لدراسة أمراض المناعة فيروس نقص المناعة البشرية والعلاج القائم على الخلايا لعلاج العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية 1. الأهم من ذلك، يتم تحديد خلايا T ولدت من الفئران مجموعة موردي المواد النووية-BLT في أنسجة الغدة الصعترية ذاتي، مما يتيح للباحث لدراسة مصيرمن الجينات المعدلة الخلايا الجذعية بعد اختيار الغدة الصعترية 8،21. مع طريقة وصفها، وتمكنت من الحصول على 40٪ -90٪ الإنسان إعادة الخلايا المناعية باستمرار. مستويات منخفضة من إعادة الخلايا البشرية يمكن أن تنجم عن عوامل متعددة، بما في ذلك مهارات الشخص الذي يقوم الجراحة ونوعية أنسجة للزرع. لتحقيق مستوى عال من إعادة الخلية البشرية، فمن المهم التأكد من وضعها بشكل آمن تحت كبسولة الكلى وزرع. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه ينصح بشدة لدراسة كل زرع الغدة الصعترية التي أعدت لعملية جراحية تحت المجهر الضوئي وتجاهل أي قطعة مشكوك فيها.

على الرغم من أن نموذج التأجير ونقل الملكية الماوس أنسنة هو أداة واعدة لدراسة الحصانة المهندسة ضد فيروس نقص المناعة البشرية (إعادة النظر في 1،15،22)، ولها حدودها الخاصة. وهي، وهذا النموذج لا تحاكي تماما نظام المناعة المحيطي البشري. وقد أظهرت دراسات النمو المعوق من-تحور المفرط، مفتش antibo تبديل الطبقةدى 1،23. بالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام الفئران المناعة ناقصة يمثل تحديا تقنيا والحفاظ على هذه الفئران صحية يتطلب قدرا كبيرا من الموارد والتدريب. يمكن العدوى الانتهازية خفية يعبر عن اختلافات كبيرة كما عبر العينات ويحتمل أن تكون لها عواقب سلبية على التجريب. ولذلك فمن المهم أن يكون مرافق جيدة الإعداد وموظفين مدربين بشكل مناسب للحفاظ على سلامة 1،24 البيانات في المستقبل. مع هذه القيود في الاعتبار، ومجموعة موردي المواد النووية-BLT نموذج الفأر أنسنة لا يزال يوفر أداة هامة لدراسة الحصانة هندسة الخلايا الجذعية مقرها، كما يتضح من هذه الأمثلة 4،8.

مع اتجاه تطوير مستقبلات المستضد خيالية تقوم على فيروس نقص المناعة البشرية واسع تحييد الأجسام المضادة 10 وتعديل نطاق الإشارات لأكثر كفاءة CAR 25، وهذا النموذج وبروتوكول يمكن أن تستخدم لتوصيف والتحقيق في وظائف سل الجينات المعدلةليرة سورية مع جيل جديد من السيارات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا النموذج على استيعاب الدراسات حول العلاج استنادا المناعة (مثل الحصار مستقبلات المثبطة) بالتزامن مع الحصانة هندسيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD34 microbead kit Miltenyi 130-046-702 For sorting human CD34+ progenitor cells
Bambanker Wako 302-14681 For freezing cells
QIAamp Viral RNA kit  Qiagen 52904 For measuring viral load in the serum
MACSQuant Flow Cytometer Miltenyi For flow analysis
BD LSRFortessa™ BD biosciences For flow analysis
Hyaluronidase Sigma H6254-500MG  For tissue digestion
Deoxyribonuclease I       Worthington LS002006  for tissue digestion
Collagenase Life technology 17104-019  for tissue digestion
CFX Real time PCR detection system Biorad For measuring viral load and gene expression
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) Thermo Fisher Scientific 10378016 For culturing cells
Piperacillin/tazobactam Pfizer Zosyn Anti-fungal
Amphotericin B (Fungizone antimycotic) Thermo Fisher Scientific 15290-018 Anti-fungal
Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units Becton Dickinson 427631  For surgery
Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case       Medline DYNJP2707  For surgery
Sutures, 4-0, vicryl           Owens and Minor 23000J304H   For surgery
Alcohol prep pads           Owens and Minor 3583006818 For surgery
Gloves, surgical, 6 1/2 Owens and Minor 4075711102 For surgery
Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium Gemini Bio-products 400-102 For CD34+ cell transduction
Human Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9511 For CD34+ cell transduction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  2. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
  3. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  4. Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
  5. Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
  6. Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
  7. Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
  8. Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  9. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
  10. Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
  11. Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
  12. West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
  13. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  14. Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  15. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  16. Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
  17. De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
  18. Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  19. Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  20. Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
  21. Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
  22. Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
  23. Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
  24. McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
  25. Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).

Tags

الطب، العدد 113، انساني التأجير ونقل الملكية الماوس، خيالية مستقبلات المستضد، فيروس نقص المناعة البشرية، السكري غير البدناء، مستضد الكريات البيض البشرية، والخلايا الجذعية المكونة للدم
الخلايا الجذعية وبناء الحصانة المهندسة ضد العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية في نموذج إنساني ماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, A., Rezek, V., Youn, C., Rick, … More

Zhen, A., Rezek, V., Youn, C., Rick, J., Lam, B., Chang, N., Zack, J., Kamata, M., Kitchen, S. Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (113), e54048, doi:10.3791/54048 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter