Abstract
Con il rapido sviluppo di terapie geniche a base di cellule staminali contro l'HIV, non vi è necessità di premere un modello animale per studiare la differenziazione ematopoietiche e la funzione immunitaria delle cellule geneticamente modificate. Il umanizzato midollo osseo / Fegato / Thymus (BLT) topo modello consente la piena ricostituzione di un sistema immunitario umano in periferia, che comprende le cellule T, cellule B, cellule NK e monociti. L'impianto del timo umano consente anche per la selezione timica delle cellule T nel tessuto del timo autologo. Oltre allo studio dell'infezione da HIV, il modello rappresenta un potente strumento per studiare la differenziazione, lo sviluppo e la funzionalità delle cellule derivate da cellule staminali ematopoietiche (CSE). Qui descriviamo la costruzione di umanizzato diabetici non obesi (NOD) -Grave combinato immunodeficienti (SCID) -Comune gamma catena knockout (c γ - / -) topo Hong osseo osseo / Fegato / Thymus (NSG-BLT) con CSE trasdotte con CD4 recettore per l'antigene chimerico (CD4CAR)vettore lentivirus. Abbiamo dimostrato che il CD4CAR CSE può differenziarsi con successo in molteplici linee e hanno attività anti-HIV. L'obiettivo dello studio è quello di dimostrare l'uso del modello di topo NSG-BLT come un modello in vivo per l'immunità ingegnerizzato contro l'HIV. Vale la pena notare che, poiché viene utilizzato lentivirus e tessuti umani, esperimenti e interventi chirurgici devono essere eseguiti in una classe II armadio biosicurezza in un livello di biosicurezza 2 (BSL2) con particolari precauzioni (BSL2 +) struttura.
Introduction
Nonostante il successo del combinato terapia anti-retrovirale, l'infezione da HIV è ancora una malattia per tutta la vita. La risposta immunitaria cellulare contro l'HIV gioca un ruolo molto importante nel controllo della replicazione di HIV. I recenti progressi nella manipolazione di cellule staminali ha permesso per il rapido sviluppo di approcci di terapia genica per l'HIV trattamento 1-3. Di conseguenza, è importante avere un modello animale adeguato che permette studio in vivo dell'efficacia di terapie cellulari contro l'HIV.
Utilizzo di HIV in modelli animali è complicata dal fatto che il virus infetta soltanto cellule umane. Per aggirare questa limitazione, gli scienziati hanno fatto ricorso all'utilizzo di modelli di malattia come il virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) in Rhesus macachi 4,5. Purtroppo, ci sono importanti limitazioni in questo modello a causa delle differenze intrinseche tra le specie e le differenze tra SIV e HIV. Inoltre, solo i servizi altamente specializzati sono capable di sostenere il lavoro con i primati non umani e ogni macaco richiede un grande investimento. Pertanto, vi è una necessità urgente di un modello che utilizza il sistema immunitario umano, che è suscettibile di infezione HIV / patogenesi, ed è meno proibitivo finanziariamente.
Il diabetici non obesi (NOD) -Grave combinato immunodeficienti (SCID) -Comune gamma catena knockout (c γ - / -) (o NSG) Sangue / Fegato / Thymus (BLT) modello di topo umanizzato è sempre dimostrato di essere uno strumento importante per studiare l'infezione da HIV. Impiantando cellule staminali ematopoietiche (CSE) e del timo fetale, i topi sono in grado di sviluppare e riepilogare un sistema immunitario umano 1-3. Un tipo di terapia genica basata sulle cellule staminali coinvolge 'reindirizzamento' cellule T periferiche di indirizzare l'HIV riprogrammando cellule staminali ematopoietiche (CSE) di differenziarsi in cellule T antigene specifico. Abbiamo dimostrato in precedenza che HSC ingegneria con un molecolare clonato anti-HIV specifica re delle cellule Trecettore (TCR) contro l'epitopo SL9 (aminoacido 77-85; SLYNTVATL) del virus HIV-1 gag può reindirizzare le cellule staminali in formazione di linfociti T maturi che sopprimono la replicazione di HIV nel umanizzato NSG-BLT modello di topo 6. L'avvertimento di utilizzare un TCR clonato molecolare è che è limitato ad uno specifico sottotipo antigene leucocitario umano (HLA) che limitare l'applicazione di questa terapia. recettori chimerici antigene (CAR), d'altro canto, possono essere universalmente applicati a tutti i sottotipi HLA. Gli studi iniziali sono stati eseguiti utilizzando un CAR costruito con i domini extracellulari e transmembrana di CD4 umana fusa alla ζ segnalazione intracellulare dominio di CD3 (definito il CD4ζCAR). CD4ζCAR espresso sulle cellule T CD8 può riconoscere busta HIV e scatenare una risposta delle cellule T citotossiche che è simile a quella mediata da un recettore delle cellule T 7. Abbiamo recentemente dimostrato che cellule staminali emopoietiche umane possono essere modificati con CD4ζCAR, che possono poi differenziarsi in molteplici ematopoietiche Lineages, comprese le cellule T funzionali in grado di sopprimere la replicazione dell'HIV nel modello umanizzato del mouse 8. Con il rapido avanzamento in chimerici terapie recettore antigene per il cancro 9, e la caratterizzazione continuo di potenti ampie anticorpi neutralizzanti 10-12 contro l'HIV che permettono la costruzione di un'unica catena CAR anticorpi, è percepibile che molti nuovi costrutti candidati, in aggiunta a CD4ζCAR , sarà generato e testato per la terapia genica a base di cellule staminali di malattie HIV e altre malattie. Inoltre, il modello di topo NSG-BLT umanizzato contenente queste vetture antigene-specifiche può anche fornire un utile strumento per esaminare attentamente le risposte delle cellule T umane in vivo. È importante sottolineare che il nostro protocollo differisce dai metodi descritti precedenti per la costruzione di umanizzato di topi BLT 13-15 dal fatto che la CSE in miscela proteica gelatinosa viene utilizzato al posto di tronchi fegato fetale 16. Questo protocollo descrive: 1) costruzione di Humanitopi BLT zed ingegnerizzati con CD4ζCAR; e 2) caratterizzazione del differenziamento delle cellule geneticamente modificate; e 3) caratterizzazione della funzionalità delle cellule geneticamente modificate.
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Protocol
Dichiarazione etica: tessuto fetale umano è stato ottenuto da avanzate Biosciences risorse o da Novogenix ed è stato ottenuto senza informazioni di identificazione e non richiedono l'approvazione IRB per il suo utilizzo. La ricerca sugli animali descritti in questo manoscritto è stato eseguito sotto l'approvazione scritta della University of California, Los Angeles, e comitato per la ricerca (UCLA) animali (ARC) in conformità a tutte le leggi federali, statali, e le linee guida locali. In particolare, questi studi sono stati condotti in stretta conformità alle istruzioni riportate nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delle Ricerche e l'accreditamento e le linee guida dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care (AALAC) Internazionale sotto UCLA ARC protocollo Numero 2010-038-02B. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in ketamina / xylazina e isoflurano anestesia e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il dolore e il disagio degli animali.
1. Costruzione di topi umanizzato Progettato con CD4 chimerico Antigen Receptor
- Lavorazione fetale timo e isolamento CD34 + cellule staminali emopoietiche da fegato fetale
- Thymus Processing
- Lavare delicatamente il timo in tampone fosfato salino (PBS), pH 7,4, in un tubo da 15 ml. fase di lavaggio ripetere 3 - 4 volte.
- Aggiungere 7 ml di mezzi RPMI + 10% FBS + pen / strep. Decantare il tutto in una sterile 100 millimetri piastra di Petri.
- Utilizzare bisturi per tagliare il timo in piccoli pezzi di circa 1 mm 2. Posizionare ogni singolo pezzo del timo in un unico bene su una piastra da 96 pozzetti. Usa curvo forcipe smussato durante il trasferimento di pezzi timo alla piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere una piccola quantità di supporto (100 - 200 pl) per tutti i pozzetti in modo che il tessuto non si asciuga. Visualizza al microscopio (thymi hanno lobi e dovrebbe apparire come sacchi di cellule).
NOTA: Eliminare tutti i pezzi che sembrano discutibili in alcun modo;vi è spesso tessuto connettivo e questo non deve essere impiantato.
- Aggiungere una piccola quantità di supporto (100 - 200 pl) per tutti i pozzetti in modo che il tessuto non si asciuga. Visualizza al microscopio (thymi hanno lobi e dovrebbe apparire come sacchi di cellule).
- Togliere i pezzi confermato-timo e mettere tutti in un pallone di coltura cellulare T25. Aggiungere 7 ml di mezzi RPMI supplementato con 10% FBS e 450 ug / ml di piperacillina / tazobactam e amfotericina B. pallone delicatamente roccia per mescolare. Cultura durante la notte pallone a 37 ° C / 5% di CO 2.
NOTA: Questa procedura è richiesta per prevenire la contaminazione batterica dei tessuti. - (Passo opzionale) Congelare il timo per un utilizzo futuro. Equilibrare i pezzi a 90% AB Human Serum con 10% dimetilsolfossido (DMSO) per 10 min. congelarli a una velocità di 1 ° C / min a -50 ° C, quindi un rapido raffreddamento a -150 ° C. Quando si è pronti a sciogliersi, scongelare rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C e lavare delicatamente 3x in RPMI completo media senza DMSO.
- Lavorazione del fegato
- Lavare delicatamente il fegato in PBS in un tubo conico da 50 ml. fase di lavaggio ripetere 3 - 4 volte.
- Aggiungere 10 ml (Modified Dulbecco media di Iscove) supporti IMDM al tubo conico da 50 ml. Decantare il tutto in una sterile 100 millimetri piastra di Petri.
- Omogeneizzare il tessuto del fegato utilizzando due bisturi. Tagliare il fegato in piccoli pezzi di circa 3 mm 2. Tagliare e scartare qualsiasi tessuto connettivo bianco.
- Utilizzare 10 ml siringa con ago senza punta calibro 16 a prendere i pezzi di fegato e dei media. Poi il trasferimento ad un tubo conico da 50 ml.
- Risospendere delicatamente la media e tessuti sospensioni ed espellere 5-7 volte di più per omogeneizzare completamente il tessuto.
- Preparare 10 ml supporti IMDM integrate con enzimi: 500 U / ml, collagenasi 2.400 U / ml ialuronoglucosaminidasi, e 300 U / ml DNasi e 450 mg / ml piperacillina / tazobactam e amfotericina B. Filtrare il mezzo attraverso un filtro di 0,22 micron poi aggiungere il supporto alla sospensione fegato.
- Tappare il tubo conico da 50 ml contenente la sospensione del fegato e sigillare ermeticamente con la pellicola autosigillante come Parafilm to evitare perdite. Ruotare in un rotatore tubo in incubatrice a 37 ° C per 90 min.
- Filtrare la sospensione cellulare digerito attraverso un filtro cellulare 100 micron in una nuova provetta 50 ml.
NOTA: Aggiungere PBS alla sospensione per portare il volume totale di 50 ml. Dividere questo in due provette da 50 ml tubetti contenenti ciascuno 25 ml di sospensione cellulare. - Lentamente e delicatamente come sfondo delle celle in ciascuna provetta con 10 ml supporti densità centrifugazione (ad esempio, Ficoll). Spin a 1.200 xg per 20 minuti senza freno. Nota: tutti i centrifugazione di cui al presente protocollo avviene a temperatura ambiente (25 ° C).
- Rimuovere con attenzione l'interfaccia (ad es., Buffy coat) da ciascuna provetta e trasferimento in due distinte provette da 50 ml. Portare il volume di ciascun tubo di interfaccia fino a 50 ml con PBS. Spin a 300 xg per 7-10 min. Aspirare il surnatante con cura.
- Unire le due palline. Lavare tre volte con 50 ml di PBS contenente 2% FBS. Spin a 300 xg per 7-10 min ogni tempo, mentre con attenzione aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 50 ml mezzi RPMI + 10% FBS. Contare le cellule utilizzando emocitometro in questo momento, prima di procedere alla separazione delle cellule.
- Ordina cellule CD34 + CD34 immediatamente utilizzando l'ordinamento Kit (ad es., CD34 micro-perline), secondo il protocollo del produttore.
NOTA: In alternativa, le cellule possono essere coltivate in RPMI mezzi + 10% FBS a 1 milione / ml durante la notte. - Save sia CD34 + e CD34- frazione.
NOTA: A questo punto, le cellule CD34 + e CD34- possono essere congelati utilizzando Bambanker mezzi di congelamento o di altri supporti di congelamento. Congelare 1 ml di 4-6 x 10 6 CD34 + cellule per tubo e congelare 1 ml di 40 - 60 x 10 6 CD34- cellule per provetta.
- Thymus Processing
- Trasduzione di cellule CD34 +
- Calcolare il numero di pozzi di trasduzione richieste di un piatto 6 ben-tessuto-cultura. 1 e può essere utilizzato per trasdurre fino a 8 x 10 6 cellule. Perogni mouse BLT, 0,5 x 10 6 CD34 + sarà impiantato con le cellule CD34- e timo sotto capsula renale e le cellule 0,5 x 10 6 CD34 + sarà iniettato per via endovenosa. Il numero di cellule CD34 + da usare è determinata dal numero di topi (1 milione di cellule per topo).
- Rivestire il numero necessario di pozzetti di una cultura non-tessuto trattato 6 pozzetti con 1,25 ml di soluzione ricombinante fibronectina umana (ad es., Retronectin) (20 mg / ml in PBS) in tutti i pozzetti. Coprire la piastra e lasciare riposare per 2 ore a temperatura ambiente in un armadio biosicurezza pulito.
- soluzione fibronectina Aspirare da pozzi e aggiungere 1,25 ml di FACS tampone (PBS con il 4% FBS) in ciascun pozzetto per il blocco. Lasciare la piastra a riposare a temperatura ambiente (25 ° C) per 30 minuti.
- Aspirare FACS tampone e pozzi di lavaggio una volta con PBS.
- Mantenere PBS nei pozzetti rivestiti finché la piastra è pronto all'uso. Conservare la piastra a 4 ° C durante la notte se non utilizzato immediatamente.
- CD34 + cellule lamiere in Infection Media (2% Human Serum albumina nel Yssel di T-Cell siero-Free Media) in fibronectina pozzi soluzione rivestite (~ 2 x 10 6 cellule / ml) e incubare a 37 ° C per 1 ora.
- Utilizzare una pipetta per aggiungere vettori lentivirali per i pozzi ad una molteplicità di infezione (MOI) tra 2 - 10. Mescolare delicatamente e incubare una notte a 37 ° C.
NOTA: Il titolo del vettore lentivirus utilizzato deve essere determinata in anticipo. - Raccogliere le cellule del mattino seguente raschiando delicatamente fondo dei pozzetti con un raschietto cellulare. Raccogliere le cellule e contare con emocitometro in questo momento.
- Per preparare le cellule per impianto, combinare 0,5 x 10 6 cellule CD34 + trasdotte con 4,5 x 10 6 CD34- cellule per il mouse, aliquota in provette sterili da 1,5 ml con tappo a vite. Spin le cellule giù a 300 xg per far sedimentare loro, aspirare il surnatante. Spin di nuovo a 300 xg ed aspirare qualsiasi surnatante rimanente con una pipetta P10 ed aspirando molto carefully. Mantenere i pellet secco sul ghiaccio durante lo studio. Nota: Per assicurarsi che le cellule sono vitali, utilizzare le cellule pellet ed eseguire l'intervento nel giro di 2-3 ore.
- Per preparare le cellule per l'iniezione, girare 0,5 x 10 6 cellule CD34 + trasdotte per il mouse per far sedimentare loro, aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 ml RPMI supporto per mouse e tenere in ghiaccio.
- Per controllare l'efficienza di trasduzione, aliquota ~ 1 x 10 5 non trasdotte e trasdotte cellule CD34 + da ogni condizione e cultura a 200 di media citochine microlitri (i media RPMI con 10% FBS, integrato con 100 ng / ml di IL-3 umana, IL-6 , SCF) in 96 pozzetti per 5 - 7 giorni a 37 ° C.
NOTA: Le cellule utilizzate in questa fase non viene utilizzato per un intervento chirurgico, ma per garantire che la trasduzione è successo e il vettore non è tossico per la sopravvivenza delle cellule staminali e di rinnovamento. Efficienza di trasduzione può essere controllato con la ricerca di espressione genica del vettore (ad es., GFP e CD4) e analizzare in citometria a flusso.
- Trapianti di tessuti per la costruzione di topi geneticamente ingegnerizzati
- Lo stesso giorno prima dell'intervento eseguire irradiazione corporea totale dei topi immunocompromessi NOD.Cg- Prkdc SCID IL2RG t m1Wjl / SZJ (NSG), con un Cesio-137 irradiatore e un dosaggio di 2,7 Gy (270Rad).
NOTA: I topi NSG severamente immunocompromessi. Quindi la loro custodia e la manutenzione devono essere conformi ai più alti standard di salute e gestito da personale altamente qualificato. - Versare pezzi timo e medie dal pallone in un piatto 60 millimetri. Versare PBS in un altro piatto 60 mm, che sarà utilizzato per pulire il trocar e mantenere il rene bagnato.
- Raffreddare punte per pipette spostamento positivi mettendoli in provette da 1,5 ml con tappo a vite sterili aperte sul ghiaccio. Tenere su ghiaccio con il pellet di cellule secche e miscela proteica gelatinosa, come Matrigel.
NOTA: E 'importante mantenere la miscela proteica gelatinosa ed eventuali tubi o suggerimenti chetoccherà freddo in ogni momento fino a quando viene caricato l'ago dell'impianto. - Anestetizzare i topi: Pesare topi individualmente e pesi da record; orecchio pugno i topi a contarle. li Iniettare per via intraperitoneale con 15 ml di ketamina (2,6 mg / ml in soluzione salina) / xylazina (100 mg / ml in soluzione salina) per grammo di peso corporeo). Mettere i topi di nuovo nella gabbia e attendere che sia completamente anestetizzata.
NOTA: Controllare il livello di anestesia del mouse comprimendo una zampa. Se il mouse sussulta di riflesso, di amministrare il 25-50% dell'importo originario di ketamina / xylazina per anestetizzare ulteriormente il mouse. Attendere fino a quando esso non si tira indietro di riflesso per eseguire l'intervento. - Utilizzando il clipper Oster (rasoio), radere il lato sinistro di ogni mouse da anca a spalla tra il centro della schiena e lo stomaco. Sottocutanea iniettare 0,3 ml del Carprofen diluito (6 mg / kg) nella spalla dell'animale o triangolo inguinale (pit gamba). Utilizzando un tampone di cotone, mettere una piccola goccia di lacrime artificialisu ciascun occhio e porre il mouse sul lato posteriore nella gabbia.
NOTA: Limit chirurgia prep una gabbia (circa 4 - 5 topi) alla volta. - Lavare la cannula dell'ago dell'impianto cancro 16 gauge (trequarti) con PBS. Utilizzando un paio di pinze curve smussate, inserire un pezzo di timo dalla piastre da 60 mm nella apertura della cannula con il trocar appena dentro l'apertura, poi tirare indietro sulla trequarti per aspirare il tessuto nella cannula.
- Utilizzare una pipetta di spostamento positivo e una punta refrigerati mettere 5 ul di miscela di proteine gelatinosa fredda nel tubo con un pellet di cellule essiccate (CD34 + e CD34- miscela per cellule impiantate) e mescolare delicatamente per generare sospensione cellulare. Non pipettare su e giù. Pipettare la proteina sospensione miscela / cellulare gelatinosa nell'apertura della cannula e lentamente tirare indietro sulla trequarti per caricare l'ago.
NOTA: Si raccomanda di avere un aiuto per caricare la pipetta mentre si manipola l'ago dell'impianto. <li> tampone zona rasata del mouse con iodopovidone e successivamente pulire la zona con un batuffolo imbevuto di alcool tre volte. Determinare il punto più buio sotto la pelle. Questo indica la posizione della milza. Il rene è circa 5 mm dorsale alla milza. Sollevare la pelle con pinze curve e fare una incisione lungo 15 millimetri con le forbici chirurgiche nella pelle parallelamente alla milza. Poi fare un taglio simile nel peritoneo strato sottostante. Nei maschi, rene dovrebbe essere facilmente visibile, e può essere estruso semplicemente premendo sull'addome. È possibile sostenere il rene con un emostatico o un paio di pinze smussate curve. Nelle femmine, le ovaie tendono a bloccare il rene da una facile estrazione. Utilizzando un emostatico, raccogliere l'ovaio e con attenzione esporre il rene.
- Lo stesso giorno prima dell'intervento eseguire irradiazione corporea totale dei topi immunocompromessi NOD.Cg- Prkdc SCID IL2RG t m1Wjl / SZJ (NSG), con un Cesio-137 irradiatore e un dosaggio di 2,7 Gy (270Rad).
- Utilizzare le pinze ad ago con punta a cogliere un piccolo foro alla fine posteriore della capsula renale.
NOTA: non utilizzare queste pinze ad ago con punta a gestire materiali a rischio biologico. - Far scorrere l'impiantol'ago in questo foro e lungo il rene fino all'apertura della cannula è completamente coperto dalla capsula renale.
- estrudere delicatamente il tessuto sotto la capsula renale, e tirare l'ago indietro. I pezzi timo possono essere appiccicoso in modo da utilizzare una pinza curva per assicurarsi che il pezzo di timo non esce con l'ago.
- Sollevare il peritoneo con le pinze e usare delicatamente la pinza emostatica per spingere il rene al suo posto. Tie un punto doppio nodo nel peritoneo usando 4-0 Vicryl suture assorbibili. Utilizzare due Autoclips clip ferita per chiudere la pelle.
- Mescolare le cellule CD34 + trasdotte che sono state messe da parte per l'iniezione e assorbimento 100 ml (0,5x10 6 cellule) in una siringa da insulina. Iniettare queste cellule nel topo mediante iniezione vena retroorbital o altre vie di iniezione endovenosa. Utilizzando un tampone di cotone, mettere una piccola goccia di lacrime artificiali su ciascun occhio e gettare il mouse sul lato posteriore in una gabbia.
- Una volta che tutti i topi hanno been impiantato, confermano che gli animali sono ripreso conoscenza e deambulazione normalmente prima di lasciarli.
- cure post-operativa: Il giorno dopo l'intervento chirurgico, per via sottocutanea iniettare 0,3 ml di diluito Carprofen (6 mg / kg) e 1,2 ml di soluzione fisiologica sterile in ogni mouse. 2 e 3 giorni dopo l'intervento chirurgico, per via sottocutanea iniettare 1,5 ml di soluzione fisiologica sterile in ciascun topo. Monitorare i topi e le incisioni per 10-14 giorni dopo l'intervento. Rimuovere il Autoclips e pesare i topi dopo 10-14 giorni. NOTA: I topi sono pigro dopo la radiazione e l'iniezione di soluzione salina impedire agli animali di diventare disidratati.
- Dopo 8 - 10 settimane, verificare l'attecchimento da sanguinamento topi e l'esecuzione di analisi FACS sul sangue periferico, la colorazione per i marcatori quali CD45, CD3, CD4, CD8, e le eventuali geni il vettore dovrebbe esprimere.
2. Caratterizzazione di differenziazione e lo sviluppo di gene modificato cellule
- CaratterizzazioneGene modificato cellule da sangue periferico
- 8 - 10 settimane dopo il trapianto, ottenere 50 - 100 ml di sangue mouse dal retro-orbitale di spurgo. Mettere in provette da microcentrifuga contenente 10 ml di EDTA. cellule centrifugare a 350 xg per 3 min. Raccogliere il plasma. Congelare a -80 per l'analisi ELISA o saggio di carica virale nel plasma se il mouse è infetto da HIV.
- Aggiungere la soluzione 2 ml di NH 4 Cl (83%) per lisare i globuli rossi. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (25 ° C). Dopo l'incubazione, aggiungere 10 ml di RPMI 10% FBS per riempire il tubo. Spin a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante con cura. Le cellule sono pronte per immuno-colorazione e citometria a flusso di analisi e altri test.
NOTA: Marcatori per varie linee ematopoietiche cellule, l'attivazione, e marcatori fenotipici per celle ingenui o di memoria può essere misurata ogni 2 settimane prima e dopo l'infezione da HIV mediante citometria di flusso. Gates sono creati da colorazione delle cellule con i controlli isotipo. Si raccomanda di macchiare HealtHY PBMC umani e l'uso che il controllo positivo. In alternativa, il mouse può essere eutanasia e fino a 1 ml di sangue periferico può essere ottenuto da puntura cardiaca che fornirà abbastanza cellule per più pannelli di analisi del flusso 17.
- Caratterizzazione del gene modificato cellule di milza, timo e del midollo osseo
- Harvest milza, timo e il midollo osseo dei topi BLT umanizzato
- Euthanize topi utilizzando sovradosaggio di isoflurano. Confermare l'eutanasia con dislocazione cervicale secondario. Spruzzare la superficie della carcassa con il 70% di etanolo per mantenere pelliccia di attaccarsi ai tessuti. Pin le arti su un vassoio di cera dissezione.
- Utilizzare forbici chirurgiche, tagliare aprire la pelle, e poi tagliare attraverso lo strato peritoneale per esporre la cavità del corpo.
- Rimuovere la milza con pinze. Rimuovere l'impianto timica sul rene con pinze e forbici. Mettere l'impianto del timo e la milza in tubi etichettati contavorazio 5 ml di PBS.
- Da metà addome tagliato e rimuovere la pelle dalla parte distale del mouse copre gli arti inferiori.
- Tagliare i muscoli delle estremità inferiori con le forbici e dislocare con attenzione il dell'acetabolo dal dell'anca. Rimuovere il femore e tibia e metterli in una provetta contenente 5 ml di PBS.
- Isolamento di splenociti
- Inserire un colino cella 100μm su una provetta da 50 ml. Bagnare il filtro con 3 ml di media RPMI supplementato con 10% FBS e pen / strep (RPMI completo dei media).
- Posizionare la milza sul colino cella. Utilizzando lo stantuffo di gomma di una siringa da 10 ml, schiacciare la milza di dissociare attraverso il filtro nel tubo 50 ml.
- Risciacquare il filtro cella con 5 ml di RPMI mezzi completi da 4 a 5 volte.
- Spin cellule a 300 xg per 10 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 5 ml di sangue rosso tampone di lisi delle cellule. Incubare a temperature per 10 min. Aggiungere 20 ml RPMI mezzi completi e far girare a 300 xg per 7 minuti.
- Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di RPMI mezzi completi e filtrare di nuovo attraverso un colino 100 micron delle cellule. Contare le cellule utilizzando emocitometro.
NOTA: Le celle possono essere utilizzati per le analisi ex vivo, il flusso di analisi e possono essere economicamente sostenibile congelati per un uso successivo. Prima conteggio delle cellule, Trypan blu può essere utilizzata per determinare il numero di cellule vitali.
- L'isolamento dei timociti umani da Implant
- Posizionare il timo in 5 ml di PBS in un pozzetto di una piastra 6 bene. Uso pulite pinze Blunt e forbici tagliare il timo in piccoli pezzi.
- Inserire un quadrato maglia di acciaio inossidabile sterilizzato nel pozzo. Utilizzando lo stantuffo di gomma di una siringa da 10 ml, schiacciare i pezzi timo sulla maglia di acciaio inossidabile di spezzare il timo.
- Risospendere le cellule bene e filtrare attraverso un filtro 100 micron delle cellule. Spin cellule a 300 xg per 10 min.Sospendere cellule in 10 ml RPMI mezzi completi. Se grumi sono visibili, passare le cellule risospese attraverso un colino cella di nuovo.
- Contare le cellule utilizzando emocitometro.
NOTA: Le celle possono essere utilizzati per l'analisi dei flussi e economicamente sostenibile congelati per un uso successivo.
- Isolamento di cellule dal midollo osseo
- Pulire e sterilizzare mortaio e pestello con il 70% di etanolo. Posizionare il femore e tibia in malta. Aggiungere 5 ml di PBS freddo. Utilizzare pestello per schiacciare le ossa fino a quando la PBS diventa rosa chiaro e nuvoloso.
- Pipettare il fluido dalla malta e filtrare attraverso un colino cella 50 pM posto su un tubo conico 50 ml. Lavare mortaio con 5 ml di PBS e ripetere cinque volte fino a PBS diventa chiaro.
- Spin le cellule giù a 300 xg per 7 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere in 10 ml di RPMI mezzi completi.
- Contare le cellule utilizzando emocitometro.
NOTA: Le celle possono essere utilizzati per ex vivo saggi, flusso analisi e può essere f maniera economicamente sostenibile congelatio un uso successivo.
- Harvest milza, timo e il midollo osseo dei topi BLT umanizzato
3. Caratterizzazione funzionale del gene modificato cellule
- L'infezione da HIV e monitoraggio del virale di replica nel tempo
- Dopo la conferma della ricostituzione del sistema immunitario umano, iniettare quantità desiderata di virus HIV tramite retro-orbitale iniezione vena con una siringa da insulina. Dopo l'infezione da HIV, raccogliere 100 ml di sangue periferico attraverso retro-orbitale sanguinamento ogni 2 settimane.
- plasma raccolto seguendo i passaggi nella parte 2.1.1 - 2.1.2. Per test della carica virale HIV, estrarre l'RNA virale utilizzando il kit di estrazione di RNA secondo le istruzioni del produttore e misurare la carica virale mediante real time RT-PCR con appositi set di primer e sonde per il virus HIV utilizzato 4,8,18,19.
- Per misurare cella associata RNA HIV e identificare le cellule che sono attivamente infettati da HIV, prima di eseguire RBC lisi seguendo i punti 2.1.2
- sospensione cellulare Risospendere in 1; Ml di PBS, dividere equamente in due tubi. Spin a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante.
- Per misurare cellule RNA associati, estrarre l'RNA utilizzando il kit di estrazione di RNA secondo le istruzioni del produttore ed eseguire real-time RT-PCR utilizzando appositi set di primer e sonde.
NOTA: È importante che il primer / sonda non riconosce il lentivirus utilizzato per modificate le cellule staminali - Per misurare l'HIV cellule infette di flusso, risospendere le cellule in altro tubo in 50 microlitri FACS tampone ed eseguire macchia di superficie con l'anticorpo desiderato come anti-CD45, anti-CD4 e anti-CD3. Dopo macchia di superficie, fissare e permeabilize celle e macchia intracellulare di espressione gag con anticorpo anti-Gag (clone KC57). Eseguire citometria a flusso.
- Ex Vivo citochine test del gene modificato le cellule da splenociti
- splenociti Harvest da topi come descritto nel paragrafo 2.2.2.
- Preparare cellule bersaglio. Per testare funzionalelità di cellule T modificate recettore per l'antigene chimerico CD4, le cellule utilizzare T1 con infezione da HIV come cellule bersaglio. Infettare le cellule T1 con HIV 3 giorni prima del test di citochine, confermare l'infezione da HIV colorando le cellule intracellulare con anticorpi anti-HIV gag (clone KC57). Utilizzare le cellule non infette T1 come cellule bersaglio di controllo.
- Co-incubare splenociti con cellule bersaglio o di controllo in rapporto 1: 1 durante la notte. Per ottenere risultati ottimali, effettuare una titolazione (1: 1, 1: 3, 1: 9) di effettore (splenociti) contro cellule bersaglio (T1 infetti). Ad esempio, risospendere 0,9 milioni di splenociti a 0,25 ml RPMI completo dei media, aggiungere 0,9, 0,3 o 0,1 milioni di T1 infetti o non infetti T1 risospeso in 0,25 ml RPMI completo dei media.
- La mattina seguente, aggiungere inibitore della proteina di trasporto per 6 ore per inibire il trasporto di proteine e di eseguire la colorazione per i marcatori extracellulari e l'espressione intracellulare di citochine, come descritto in precedenza in 8.
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Representative Results
La figura 1 mostra uno schema di costruzione di topi BLT umanizzati con cellule staminali modificato. 10 settimane dopo la chirurgia implantare, i topi sono stati sacrificati per valutare la differenziazione e sviluppo di cellule geneticamente modificate. Come mostrato in figura 2, molteplici tessuti linfoidi (sangue, milza, timo e midollo osseo) sono state raccolte da un topo che è stato modificato con CD4ζCAR. Il CD4ζCAR utilizzato in questo protocollo contiene CD4 recettore per l'antigene chimerico e GFP che può essere rilevato da anticorpi anti-CD4 e l'espressione della GFP 8. Le cellule sono state isolate e colorati con anticorpo anti CD45 umana e anticorpo anti-CD4 e analizzate mediante citometria di flusso. GFP e CD4 doppie cellule positive sono state rilevate, indicando la presenza di cellule CD4CAR + in diversi tessuti linfoidi.
Per studiare la differenziazione delle cellule geneticamente modificate, splenociti sono state colorate con anticorpi contro CD45 umano (linfociti), CD3 (cellule T), CD19 (cellule B), CD14 (monociti e macrofagi) e CD337 (cellule NK). Come mostrato in figura 3, le cellule staminali ematopoietiche CD4ζCAR differenziarsi in molteplici linee.
Per indagare se le cellule CD4CAR modificate sono funzionali, abbiamo coincubated splenociti con cellule bersaglio che le cellule CD4CAR sarebbero riconoscere (cellule infette da HIV T1 o cellule non infette T1 come controllo). Le cellule sono state co-incubate durante la notte e l'inibitore della proteina di trasporto è stato aggiunto per ulteriori 6 ore. In seguito, le cellule sono state fissate e permeabilizzate a macchia per l'espressione intracellulare di citochine come IFNΓ e TNF-alfa. Come mostrato in figura 4, le cellule che esprimono CAR prodotte maggiore quantità di IFNΓ e TNFa con cellule infette T1.
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Figura 1: Schema di costruzione di topi BLT umanizzati con le cellule staminali modificate FT:. Timo fetale. FL:. Fegato fetale Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Cellule modificate CD4 recettore per l'antigene chimerico possono essere rilevati in diversi tessuti linfoidi Mouse con CD4CAR modificato le CSE sono stati sacrificati 10 settimane dopo l'intervento chirurgico e molteplici tessuti linfoidi sono state raccolte e le cellule sono state colorate con CD45 anti-uomo e anti-umane anticorpi CD4 e analizzate mediante citometria di flusso. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:.. Cellule modificate CD4 recettore per l'antigene chimerico possono differenziarsi in molteplici linee splenociti di topi CD4CAR modificate sono state raccolte e colorati con anticorpi contro CD45 umano, CD3, CD19, CD14 e CD337 e analizzata mediante citometria di flusso Clicca qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.
Figura 4:. Ex vivo saggio di citochine delle cellule T CD4 + CAR splenociti da HIV infetta i topi CD4CAR sono stati stimolati sia con cellule T1 infetti o non infetti da HIV e la loro produzione intracellulare di citochine è indicata. Cliccate qui per viewa più grande versione di questa figura.
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Discussion
Con l'automobile e HSC-based immunità ingegnerizzato acquistando slancio verso gli studi clinici, è importante avere un modello animale adeguato per esaminare da vicino la differenziazione e la funzione di queste cellule ingegnerizzate. In questo protocollo abbiamo descritto i metodi per costruire e testare i topi umanizzati con cellule staminali geneticamente modificate ingegnerizzate contro l'HIV. E 'importante avere efficiente trasduzione di cellule staminali prima del trapianto. Tuttavia, a causa della capacità di cellule T a proliferare previo riconoscimento delle cellule bersaglio, bassi livelli di modificazione di cellule staminali sono sufficienti a generare una risposta forte contro la replicazione dell'HIV 8.
Tuttavia, per raggiungere alto livello di modificazione delle cellule staminali, si consiglia di utilizzare CD34 + trasdotte cellule in miscela proteica gelatinosa con timo autologo, invece di fegato e timo pezzi per la chirurgia topi che erano stati descritti altrove 13-15. miscela proteica gelatinosa è un solubiliztessuti ed membrana basale ricco di proteine della matrice extracellulare. In condizioni fisiologiche normali, miscela proteica gelatinosa polimerizzare per produrre una matrice ricostituito, biologicamente attivo e stabile che consenta fissaggio efficace e la differenziazione delle cellule staminali 20. la ricostituzione delle cellule umane può essere controllato da emorragia retro-orbitale e citometria a flusso 6 - 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. Per garantire che il vettore non è tossico per la sopravvivenza delle cellule staminali e rinnovo, si raccomanda di poi titolare il vettore in cellule CD34 + prima dell'esperimento come descritto in 1.2.6.
La capacità del modello di topo NSG-BLT per supportare l'infezione della mucosa, viremia coerente e risposte immunitarie cellulari lo rende un modello molto utile per studiare l'HIV patologia immunitaria e le terapie a base di cellule per il trattamento dell'infezione da HIV 1. Ancora più importante, le cellule T generate dai topi NSG-BLT sono selezionati nel tessuto del timo autologo, consentendo al ricercatore di studiare il destinodi cellule staminali gene modificato dopo la selezione del timo 8,21. Con il metodo descritto, siamo stati in grado di ottenere il 40% -90% la ricostituzione delle cellule immunitarie umane in modo coerente. Bassi livelli di ricostituzione cellulare umana possono derivare da molteplici fattori, tra cui le competenze della persona che effettua l'intervento chirurgico e la qualità dei tessuti per il trapianto. Per ottenere un'elevata ricostituzione cellula umana, è importante garantire i trapianti siano posizionate saldamente sotto la capsula renale. Inoltre, si raccomanda di esaminare ogni impianto timica preparato per un intervento chirurgico sotto microscopio ottico ed eliminare eventuali pezzi discutibili.
Anche se il modello umanizzato BLT mouse è uno strumento promettente per studiare l'immunità ingegnerizzato contro l'HIV (rivisto in 1,15,22), ha i suoi limiti. Vale a dire, questo modello non perfettamente imitare un sistema immunitario periferico umano. Gli studi hanno dimostrato lo sviluppo alterato del, Antibo IgG di classe a commutazione di iper-mutatody 1,23. Inoltre, utilizzando topi immuno-deficienti è tecnicamente impegnativo e mantenere questi topi sani richiede notevoli risorse e formazione. infezioni opportunistiche sottili possono manifestarsi differenze significative tra i campioni e potenzialmente avere conseguenze negative sulla sperimentazione. Pertanto, è importante avere strutture ben preparati e personale adeguatamente formato per mantenere l'integrità del futuro 1,24 dati. Con queste limitazioni in mente, il modello di topo NSG-BLT umanizzato fornisce ancora un importante strumento per lo studio della immunità ingegnerizzato basato sulle cellule staminali, come dimostrano questi esempi 4,8.
Con la tendenza di sviluppare recettori chimerici antigene basato su HIV ampia anticorpi neutralizzanti 10 e la modifica del dominio di segnalazione per più efficiente CAR 25, questo modello e protocollo possono essere utilizzati per caratterizzare e studiare la funzionalità del gene modificato celLS con una nuova generazione di automobili. Inoltre, questo modello può potenzialmente ospitare studi sulla terapia a base immunitaria (come inibitorio blocco dei recettori), in combinato disposto con l'immunità Engineered.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 microbead kit | Miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | For freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| Piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| Sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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