Abstract
Com o rápido desenvolvimento de terapias baseadas em genes de células estaminais contra o HIV, não é requisito para pressionar um modelo animal para estudar a diferenciação hematopoiética e a função imunológica das células geneticamente modificadas. A medula humanizado / fígado / timo (BLT) modelo do rato permite a total reconstituição de um sistema imune humano na periferia, que inclui células T, células B, células NK e monócitos. O implante de timo humano também permite a selecção tímica de células T em tecido tímico autólogo. Em adição ao estudo da infecção por HIV, o modelo fica como uma ferramenta poderosa para estudar diferenciação, desenvolvimento e funcionalidade de células derivadas de células estaminais hematopoiéticas (HSCs). Aqui destacamos a construção de humanizada não-obesos diabéticos (NOD) -severe imunodeficientes combinados (SCID) de cadeia knockout gamma -Common (c γ - / -) ratos -Bone de medula / Fígado / Thymus (NSG-BLT) com HSCs transduzidas com o receptor do antigénio quimérico de CD4 (CD4CAR)vetor lentivírus. Nós mostramos que o CD4CAR HSCs podem diferenciar com sucesso em múltiplas linhagens e têm actividade anti-HIV. O objetivo do estudo é demonstrar a utilização do modelo de rato NSG-BLT como um modelo in vivo para a imunidade projetados contra o HIV. Vale a pena notar que, devido lentivírus e tecido humano é usado, as experiências e cirurgias devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica Classe II em um Nível de Biossegurança 2 (BSL2) com precauções especiais (BSL2 +) instalações.
Introduction
Apesar do sucesso da terapia anti-retroviral combinada, a infecção por HIV é ainda uma doença ao longo da vida. A resposta imune celular contra o HIV desempenha um papel muito importante no controlo da replicação do HIV. Os recentes avanços na manipulação de células-tronco tem permitido para o rápido desenvolvimento da terapia genética abordagens para HIV tratamento 1-3. Como resultado, é importante dispor de um modelo animal apropriado que permita estudo in vivo da eficácia de terapias à base de células contra o HIV.
Trabalhando com HIV em modelos animais é complicada pelo facto de o vírus infecta apenas células humanas. Para contornar essa limitação, os cientistas recorreram ao uso de modelos de doenças como o vírus Simian Immunodeficiency (SIV) em macacos Rhesus 4,5. Infelizmente, há grandes limitações neste modelo devido às diferenças inerentes entre as espécies e as diferenças entre SIV e HIV. Além disso, apenas as instalações altamente especializados são capable de apoiar o trabalho com primatas não-humanos e cada macaque requer um grande investimento. Assim, existe uma necessidade premente de um modelo que utiliza o sistema imunitário humano, que seja susceptível a infecção por HIV / patogénese, e é financeiramente menos proibitivo.
O não-obesos diabéticos (NOD) -severe imunodeficientes combinados (SCID) de cadeia knockout gamma -Common (c γ - / -) (ou NSG) Blood / Fígado / Thymus (BLT) modelo de rato humanizado é cada vez mais provado ser uma ferramenta importante para estudar a infecção pelo HIV. Por implantação de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) e timo fetal, os ratinhos são capazes de recapitular o desenvolvimento e um sistema imune humano 1-3. Um tipo de terapia genética baseada em células estaminais envolve 'reorientação das células T periféricas de alvo do VIH através da reprogramação de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) de se diferenciar em células T específicas para o antigénio. Nós temos mostrado previamente que HSCs de engenharia com um clonado anti-HIV re específica molecular das células TCeptor (TCR) contra o epitopo SL9 (aminoácidos 77-85; SLYNTVATL) do HIV-1 Gag pode redireccionar células estaminais em células T maduras formando que suprimem a replicação do HIV no modelo de ratinho humanizado BLT NSG-6. A advertência do uso de um TCR clonado molecular é de que seja limitado a um subtipo específico de antigénio de leucócitos humanos (HLA) que vai limitar a aplicação desta terapia. receptores de antigénios quiméricos (CAR), por outro lado, pode ser universalmente aplicado para todos os subtipos de HLA. Os estudos iniciais foram realizados utilizando um CARRO construído com os domínios extracelular e transmembranar de CD4 humano fundidos com o domínio intracelular de ζ CD3 sinalização (denominado a CD4ζCAR). CD4ζCAR expressa em células T CD8 podem reconhecer do envelope de HIV e desencadear uma resposta de células T citotóxicas que é semelhante à que mediada por um receptor de células T 7. Nós demonstramos recentemente que hsc humanas podem ser modificados com CD4ζCAR, que pode então diferenciam-se em múltiplos Li hematopoiéticasneages, incluindo células T funcionais capazes de suprimir a replicação do HIV no modelo de ratinho humanizado 8. Com o rápido avanço em terapias de receptores de antigénios quiméricos para o cancro 9, e a caracterização permanente de anticorpos neutralizantes amplos 10-12 potentes contra o HIV que permitem a construção de veículos de anticorpo de cadeia simples, é perceptível que muitas novas construções de candidatos, além de CD4ζCAR , irão ser gerados e testados para a terapia genética baseada em células estaminais de doenças do HIV e outras doenças. Além disso, o modelo de rato NSG-BLT humanizado contendo estes carros antígeno-específicas também pode fornecer uma ferramenta útil para examinar de perto as respostas das células T humanas in vivo. Importante, a nossa protocolo difere dos métodos descritos anteriormente para a construção de murganhos humanizado de BLT 13-15 em que a mistura proteica em HSCs gelatinosa é usado em lugar de troncos de fígado fetal 16. Este protocolo descreve: 1) construção de humanicamundongos BLT zed projetados com CD4ζCAR; e 2) a caracterização da diferenciação das células geneticamente modificadas; e 3) a caracterização da funcionalidade das células geneticamente modificadas.
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Protocol
Declaração de Ética: tecido fetal humano foi obtido a partir de avançadas Biosciences Recursos ou a partir Novogenix e foi obtido sem informações de identificação e não requerem aprovação IRB para a sua utilização. A pesquisa animal descrito neste manuscrito foi realizada sob a aprovação por escrito, da Universidade da Califórnia, Los Angeles, e Comité de Investigação (UCLA) Animal (ARC), em conformidade com todas as leis federais, estaduais e diretrizes locais. Especificamente, esses estudos foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Research Council e do BBB e diretrizes da Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AALAC) Internacional sob UCLA ARC Protocolo Número 2010-038-02B. Todas as cirurgias foram realizadas sob cetamina / xilazina e anestesia isoflurano e todos os esforços foram feitos para minimizar a dor dos animais e desconforto.
1. Construção de Mice humanizado Projetado com CD4 quimérico Antigen Receptor
- O processamento e isolamento do timo fetal células CD34 + a partir de fígado fetal HSCs
- Thymus Processing
- Lavar suavemente o timo em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, num tubo de 15 ml. Repita o passo de lavagem 3 - 4 vezes.
- Adicionar 7 ml de meio RPMI + 10% FBS + Pen / Strep. Decantar tudo em uma placa de Petri de 100 milímetros estéril.
- Use bisturis para cortar o timo em pedaços pequenos de cerca de 1 mm 2. Colocar cada peça única timo num único poço de uma placa de 96 poços. Uso fórceps curvo sem corte durante a transferência de peças timo para a placa de 96 poços.
- Adicionar uma pequena quantidade de meios (100 - 200 mL) a todos os poços de modo a que o tecido não seca. Visualize sob o microscópio (thymi têm lobos e deverá ser parecido com sacos de células).
NOTA: Elimine quaisquer peças que se parecem questionáveis de qualquer forma;muitas vezes há tecido conectivo e este não deve ser implantado.
- Adicionar uma pequena quantidade de meios (100 - 200 mL) a todos os poços de modo a que o tecido não seca. Visualize sob o microscópio (thymi têm lobos e deverá ser parecido com sacos de células).
- Retire os pedaços do timo confirmada e colocar todos eles num frasco de cultura de células T25. Adicionar 7 ml meio RPMI suplementado com 10% FBS e 450 ug / ml de piperacilina / tazobactam e anfotericina B. frasco agite levemente para misturar. Culturas durante a noite a temperatura do frasco a 37 ° C / 5% de CO 2.
NOTA: Este passo é necessário para evitar a contaminação bacteriana do tecido. - (Etapa opcional) Congelar o timo para uso futuro. Equilibrar os pedaços com 90% de soro AB humano com 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) durante 10 min. Congelá-los, a uma taxa de 1 ° C / min até -50 ° C, em seguida, arrefecimento rápido a -150 ° C. Quando estiver pronto para descongelar, descongelar rapidamente em um banho de água a 37 ºC e lavar cuidadosamente 3x em RPMI mídia completa sem DMSO.
- Processamento de fígado
- Lavar suavemente o fígado em PBS, num tubo cónico de 50 ml. Repita o passo de lavagem 3 - 4 vezes.
- Adicionar 10 ml (modificado Meios de Dulbecco de Iscove) meios IMDM ao tubo de 50 ml. Decantar tudo em uma 100 milímetros estéril placa de Petri.
- Homogeneizar o tecido do fígado usando dois bisturis. Cortar o fígado em pedaços pequenos de cerca de 3 mm 2. Cortar e descartar qualquer tecido conjuntivo branco.
- Use seringa de 10 ml equipado com uma agulha romba de calibre 16 para levar os pedaços de fígado e meios de comunicação. Em seguida, transferir para um tubo cônico de 50 ml.
- Volte a suspender suavemente a suspensão de mídia e tecidos e expelir mais 5-7 vezes para homogeneizar o tecido completamente.
- Preparar 10 ml de meio IMDM suplementado com enzimas: 500 U / mL de colagenase, 2400 U / ml de hialuronidase, e 300 U / ml de ADNase, bem como 450 ug / ml de piperacilina / tazobactam e anfotericina B. Filtrar os meios de comunicação através de um filtro de 0,22 um, em seguida adicionar os meios de comunicação para a suspensão do fígado.
- Tampe o tubo cônico de 50 ml que contém a suspensão de fígado e selar firmemente com filme de auto-selante, como Parafilm to evitar vazamentos. Rodam num rotador tubo na incubadora a 37 ° C durante 90 min.
- Filtra-se a suspensão de células digerido através de um filtro de células de 100 um para um novo tubo de 50 ml.
NOTA: Adicionar PBS para a suspensão para levar o volume total até 50 ml. Dividir esta em dois tubos de tubos de 50 ml contendo cada um 25 ml de suspensão de células. - Lentamente e suavemente fundamentam células em cada tubo com 10 ml de densidade de meios de centrifugação (por exemplo, Ficoll). Giram a 1.200 g durante 20 min sem freio. Nota: todos de centrifugação mencionados neste protocolo é feito em temperatura ambiente (25 ºC).
- Remova cuidadosamente a interface (ie., Buffy coat) de cada tubo e transferência para duas separadas tubos de 50 ml. Levar o volume de cada tubo de interface de até 50 ml com PBS. Giram a 300 g durante 7-10 min. Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
- Combine as duas pelotas. Lavar três vezes com mais 50 ml de PBS contendo 2% de FBS. Centrifugação a 300 xg durante 7 - 10 mem cada tempo, enquanto cuidadosamente o sobrenadante por aspiração.
- Ressuspender o sedimento em 50 ml de meio RPMI + 10% de FBS. Contagem de células utilizando um hemocitómetro no momento antes de prosseguir para separação de células.
- Ordenar as células CD34 + CD34 imediatamente utilizando Kit de triagem (por ex., CD34 micro-esferas), de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: Como alternativa, as células podem ser cultivadas em meio RPMI + FBS a 10% a 1 milhão / ml durante a noite. - Salvar tanto CD34 + e CD34- fração.
NOTA: Nesta etapa, as células CD34 + e CD34 @ podem ser congelados usando Bambanker meios de congelamento ou de outras mídias de congelamento. Congelar 1 ml de 4 - 6 x 10 células CD34 + por seis tubo e congelar 1 ml de 40 - 60 x 10 6 CD34- células por tubo.
- Thymus Processing
- A transdução de células CD34 +
- Calcular o número de poços necessários transdução de uma placa de 6 poços de cultura de tecidos-. 1 também pode ser utilizado para transduzir até 8 X 10 6 células. ParaBLT cada ratinho, 0,5 x 10 6 células CD34 + irá ser implantado juntamente com células CD34 @ e timo por baixo da cápsula do rim e 0,5 x 10 6 células CD34 + será injectado por via intravenosa. O número de células CD34 + a ser usado é determinada pelo número de ratinhos (1 milhão de células por rato).
- Revestir o número necessário de poços de uma cultura não-tecido tratado placa de 6 poços com 1,25 ml de solução de fibronectina humana recombinante (por exemplo., RetroNectin) (20 ug / ml em PBS) a cada poço. Cobrir a placa e permite-se repousar durante 2 horas à temperatura ambiente numa câmara de biosegurança limpo.
- solução de fibronectina aspirado dos poços e adicionar 1,25 mL de tampão de FACS (PBS com 4% de FBS) a cada poço para bloquear. Permitir que a placa em repouso à temperatura ambiente (25 ° C) durante 30 min.
- Tampão Aspirar FACS e poços de lavagem uma vez com PBS.
- Manter PBS nos poços revestidos até que a placa está pronta para utilização. Armazenar a placa a 4 ° C durante a noite se não for utilizado imediatamente.
- Placa de células CD34 + Na infecção média (2% de albumina do soro humano no soro livre de Célula T de Yssel médio) em poços revestidos com fibronectina solução (~ 2 x 10 6 culas / ml) e incuba-se a 37 ºC durante 1 h.
- Usar uma pipeta para adicionar vector lentiviral para os poços, a uma multiplicidade de infecção (MOI) compreendida entre 2 - 10. Misturar suavemente e incuba-se durante a noite a 37 ºC.
NOTA: O título do vector de lentivírus utilizada deve ser determinada de antemão. - Colher as células na manhã seguinte por raspagem suave das partes inferiores dos poços com um raspador de células. Coletar células e contar com hemocitômetro neste momento.
- Para preparar as células para implante, combinar 0,5 x 10 6 células CD34 + transduzidas com 4,5 x 10 6 CD34- células por rato, alíquota em estéreis de 1,5 ml tubos com tampa de rosca. Girar as células para baixo a 300 xg para sedimentar-los, aspirado sobrenadante. Spin-los novamente a 300 xg e aspirar qualquer sobrenadante remanescente utilizando uma pipeta P10 e aspiração muito carefully. Manter as pelotas secas no gelo durante todo o estudo. Nota: Para certificar-se as células são viáveis, usar as células peletizadas e realizar a cirurgia dentro de 2-3 horas.
- Para preparar as células para injecção, girar 0,5 x 10 6 células CD34 + transduzidas por rato para sedimentar-los, aspirado sobrenadante. Ressuspender as células em 100 mL de mídia RPMI per mouse e manter em gelo.
- Para verificar a eficiência de transdução, alíquota ~ 1 x 10 5 não transduzidas e transduzidas células CD34 + a partir de cada condição e a cultura em 200 meio de citocina ul (meio RPMI com 10% de FBS, suplementado com 100 ng / ml de IL-3 humana, IL-6 , SCF) na placa de 96 poços durante 5 - 7 dias a 37 ° C.
NOTA: As células utilizadas neste passo não é usada para a cirurgia, mas para assegurar que a transdução é bem sucedido e o vector não é tóxico para a sobrevivência de células estaminais e de renovação. Eficiência de transdução pode ser verificado olhando para a expressão do gene do vector (por exemplo., GFP & CD4) e análise por citometria de fluxo.
- Transplantes de tecidos Construir ratos geneticamente modificados
- No mesmo dia, antes da cirurgia realizar a irradiação total do corpo dos ratinhos imunocomprometidos NOD.Cg- Prkdc SCID IL2RG t m1Wjl / SZJ (NSG) com um irradiador de césio-137 e uma dosagem de 2,7 Gy (270Rad).
NOTA: Os ratos NSG estão gravemente imunocomprometidos. Portanto a sua habitação e manutenção devem estar de acordo com o mais alto padrão de saúde e manuseado por pessoal altamente treinado. - Pour peças timo e meio a partir do balão para um prato de 60 mm. Pour PBS para outro prato de 60 mm, que será usado para limpar o trocarte e manter o rim húmido.
- Relaxar dicas deslocamento pipeta positivos, colocando-os abertos de 1,5 ml estéreis tubos com tampa de rosca no gelo. Manter no gelo com as pelotas de células secas e mistura de proteína gelatinosa como Matrigel.
NOTA: É importante para manter a mistura de proteína gelatinosa e quaisquer tubos ou dicas quevai tocá-lo frio em todos os momentos até que a agulha implante é carregado. - Anestesiar os ratos: Pesar ratos individualmente e pesos de registro; orelha perfurar os ratos enumerá-las. Injectar-los por via intraperitoneal com 15 ul de cetamina (2,6 mg / ml em solução salina) / xilazina (100 mg / ml em solução salina) por grama de peso corporal). Coloque os ratos de volta na gaiola e esperar por ele para ser totalmente anestesiado.
NOTA: Verifique o nível de anestesia do mouse, apertando a pata. Se o rato recua reflexivamente, administrar 25-50% da quantidade original de ketamina / xilazina para anestesiar ainda mais o mouse. Espere até que ele não reflexivamente recuar para realizar a cirurgia. - Usando o clipper Oster (máquina de barbear), raspar o lado esquerdo de cada rato do quadril ao ombro entre o centro das costas e no estômago. Injectar por via subcutânea 0,3 ml de o carprofeno diluído (6 mg / kg) no ombro do animal ou triângulo inguinal (perna poço). Usando um cotonete, coloque uma pequena gota de lágrimas artificiaisem cada olho e colocar o mouse em seu lado de volta na gaiola.
Nota: Limite de cirurgia preparativa para uma gaiola (cerca de 4-5 ratos) de cada vez. - Lave a cânula da agulha implante câncer de calibre 16 (trocar) com PBS. Utilizando um par de pinças curvas rombas, colocar um pedaço de timo a partir do prato 60 milímetros para dentro da abertura da cânula do trocarte com o apenas no interior da abertura, em seguida, puxar para trás sobre o trocarte para aspirar o tecido para dentro da cânula.
- Usar uma pipeta de deslocamento positivo e uma ponta refrigerada para colocar 5 ul de mistura de proteína gelatinosa frio para dentro do tubo com um sedimento de células secas (mistura de CD34 + e CD34- para células implantadas) e agitar suavemente para gerar suspensão de células. Não pipeta cima e para baixo. Pipetar a suspensão mistura / célula proteína gelatinoso para dentro da abertura da cânula e, lentamente, puxar para trás sobre o trocarte para carregar a agulha.
NOTA: Recomenda-se a ter um ajudante para carregar a pipeta enquanto se manipula a agulha implante. <li> Swab a área raspada do rato com Iodopovidona e, posteriormente, limpe a área com um algodão embebido em álcool três vezes. Determinar o ponto mais escuro sob a pele. Isto indica a localização do baço. O rim é aproximadamente 5 mm dorsal para o baço. Levante a pele com uma pinça curva e fazer uma incisão longa 15 mm, com uma tesoura cirúrgica na pele paralelamente ao baço. Em seguida, faça um corte semelhante no peritônio camada abaixo. Nos machos, a rim devem ser facilmente visíveis, e pode ser extrudido simplesmente pressionando sobre o abdómen. É possível apoiar o rim com uma pinça hemostática ou um par de fórceps sem corte curvas. Nas fêmeas, os ovários tendem a bloquear o rim de extração fácil. Usando uma pinça hemostática, pegar o ovário e cuidadosamente expor o rim.
- No mesmo dia, antes da cirurgia realizar a irradiação total do corpo dos ratinhos imunocomprometidos NOD.Cg- Prkdc SCID IL2RG t m1Wjl / SZJ (NSG) com um irradiador de césio-137 e uma dosagem de 2,7 Gy (270Rad).
- Use a pinça com ponta de agulha para arrancar um pequeno orifício na extremidade posterior da cápsula renal.
NOTA: Não use essas pinças com ponta de agulha para lidar com materiais de risco biológico. - Deslize o implanteagulha para dentro deste furo e ao longo do rim até à abertura da cânula é completamente coberta pela cápsula renal.
- Suavemente expulsar o tecido sob a cápsula renal, e puxe a agulha para trás para fora. As peças timo pode ser pegajoso então use uma pinça curva para certificar-se da peça timo não sai com a agulha.
- Levante-se o peritônio com a pinça e gentilmente usar a pinça hemostática para empurrar o rim de volta no lugar. Amarre um ponto duplo nó no peritônio usando 4-0 Vicryl suturas absorvíveis. Use duas Autoclips clips ferida para fechar a pele.
- Misturar as células CD34 + transduzidas que foram postos de lado para a injecção e absorção 100 ul (0,5x10 6 células) para uma seringa de insulina. Injetar essas células para o mouse através de injecção na veia retro-orbitária ou outras vias de injecção intravenosa. Usando um cotonete, coloque uma pequena gota de lágrimas artificiais para cada olho e colocar o mouse sobre a sua parte de trás em uma gaiola.
- Uma vez que todos os ratos têm been implantado, confirmar que os animais são recuperar a consciência e deambulando normalmente antes de deixá-los.
- cuidados pós-operatórias: No dia após a cirurgia, por via subcutânea 0,3 ml de injectar carprofeno diluído (6 mg / kg) e 1,2 ml de solução salina estéril em cada ratinho. 2 e 3 dias após a cirurgia, por via subcutânea, injecção de 1,5 ml de solução salina estéril em cada ratinho. Monitorar os ratos e as incisões para 10-14 dias após a cirurgia. Remover o Autoclips e pesar os ratinhos após 10-14 dias. NOTA: Os ratos são lentos após a radiação e injeção de solução salina impede os animais de tornar-se desidratado.
- Depois de 8 - 10 semanas, vá enxerto por sangria dos ratinhos e executar a análise FACS do sangue periférico, coloração para marcadores tais como CD45, CD3, CD4, CD8, e quaisquer genes no vector deve expressar.
2. Caracterização de diferenciação e desenvolvimento de gene modificado Cells
- caracterização deGene modificado Células de Sangue Periférico
- 8 - 10 semanas após o transplante, obter 50 - 100 l de sangue de camundongos a partir de sangria retro-orbital. Colocar em tubos de microcentrífuga contendo 10 uL de EDTA. células centrifugar a 350 xg durante 3 min. Recolha plasma. Congelar a -80 para análise ELISA ou ensaio de carga viral plasmática se o mouse está infectada pelo HIV.
- Adicionar 2 ml de solução de NH 4 Cl (83%) para lisar as células vermelhas do sangue. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (25 ºC). Após a incubação, adicionam-se 10 ml de RPMI 10% FBS para o tubo de enchimento. Girar a 300 xg durante 5 min. Aspire cuidadosamente o sobrenadante. As células estão prontas para coloração imuno-e análise de citometria de fluxo e outros ensaios.
NOTA: Marcadores para várias linhagens hematopoéticas celulares, ativação e marcadores fenotípicos para células naïve ou de memória pode ser medido a cada 2 semanas antes e após a infecção pelo HIV por citometria de fluxo. Portões são criados por coloração das células com os controlos de isotipo. Recomenda-se a manchar healthy PBMC humanos e usar isso como controlo positivo. Alternativamente, o rato pode ser sacrificados e até 1 ml de sangue periférico pode ser obtido a partir de punção cardíaca que irá fornecer células suficientes para vários painéis de análise de fluxo de 17.
- Caracterização do gene modificado a partir de células do baço, timo e medula óssea
- Colheita baço, timo e medula óssea de camundongos humanizado BLT
- Eutanásia ratos utilizando uma sobredosagem de isoflurano. Confirmar a eutanásia com deslocamento cervical secundário. Pulverizar a superfície da carcaça, com 70% de etanol para manter a pele do que adere a tecidos. Fixar para baixo os membros em uma bandeja de cera dissecção.
- Use tesouras cirúrgicas, cortar abrir a pele, e depois cortar através da camada peritoneal para expor a cavidade do corpo.
- Remover do baço utilizando um fórceps. Remover o implante tímico no rim utilizando fórceps e tesouras. Coloque o implante do timo e do baço no rotulada Conta tubosining 5 ml de PBS.
- Desde meados de abdômen cortar e remover a pele da parte distal do mouse cobrindo os membros inferiores.
- Cortar os músculos dos membros inferiores usando uma tesoura e deslocar cuidadosamente o acetábulo da articulação do quadril. Remover o fêmur ea tíbia e colocá-los em um tubo contendo 5 ml de PBS.
- Isolamento de esplenócitos
- Coloque um filtro de células de 100 um sobre um tubo cónico de 50 ml. Molhar o filtro com 3 ml de meio RPMI suplementado com FBS a 10% e pen / estrep (meio RPMI completo).
- Colocar o baço para o filtro de células. Usando o êmbolo de borracha de uma seringa de 10 mL, misturar o baço para dissociar-lo através do filtro para dentro do tubo de 50 ml.
- Lavar o filtro de células com 5 ml RPMI mídia completas 4 a 5 vezes.
- Girar as células a 300 xg durante 10 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Incubar a tempera quartotura durante 10 minutos. Adicionar 20 ml RPMI meio completo e centrifugação a 300 xg durante 7 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de meio RPMI completo e Filtra-se novamente através de um filtro de 100 um da célula. Contar as células usando hemocitômetro.
NOTA: As células podem ser utilizadas para ensaios ex vivo, análise de fluxo e podem ser congeladas de modo viável para uso posterior. Antes de contagem de células, azul de tripano pode ser usado para determinar o número de células viáveis.
- Isolamento de timócitos humanos de Implante
- Colocar o timo em 5 ml de PBS num poço de uma placa de 6 poços. Utilizando uma pinça e tesouras sem corte limpo cortar o timo em pedaços pequenos.
- Colocar um quadrado de malha de aço inoxidável esterilizado para dentro do poço. Usando o êmbolo de borracha de uma seringa de 10 mL, misturar as peças timo sobre a malha de aço inoxidável para separar o timo.
- Ressuspender as células bem e filtre através de um filtro de 100 um celular. Girar as células a 300 xg durante 10 min.Suspender as células em 10 ml de meio RPMI completo. Se aglomerados são visíveis, passar as células novamente suspensas através de um filtro de células novamente.
- Contar as células usando hemocitômetro.
NOTA: As células podem ser usadas para a análise de fluxo e de forma viável congeladas para uso posterior.
- Isolamento de Células de Medula Óssea
- Limpar e esterilizar almofariz e pilão com etanol 70%. Coloque o fêmur ea tíbia em argamassa. Adicionar 5 ml de PBS frio. Use pilão para esmagar os ossos até que o PBS transforma rosa claro e nublado.
- Pipeta-se o líquido da argamassa e filtrar através de um filtro de células 50 mM colocado em um tubo de 50 ml. Lave argamassa com 5 ml PBS e repetir cinco vezes até PBS se torna claro.
- Girar-se células a 300 xg durante 7 minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de meio RPMI completo.
- Contar as células usando hemocitômetro.
NOTA: As células podem ser utilizadas para ensaios ex vivo, análise de fluxo e pode ser congelada F viávelou mais tarde usar.
- Colheita baço, timo e medula óssea de camundongos humanizado BLT
3. Caracterização funcional do gene modificado Cells
- Infecção por HIV e de Fiscalização do Viral replicação ao longo do tempo
- Após a confirmação da reconstituição do sistema imunitário humano, injectar quantidade desejada do vírus HIV através de injecção na veia retro-orbital utilizando uma seringa de insulina. Após a infecção de HIV, recolher 100 uL de sangue periférico através de sangramento retro-orbital a cada 2 semanas.
- Colheita plasma seguindo os passos em parte 2.1.1 - 2.1.2. Para o ensaio de carga viral de VIH, extrair RNA viral utilizando o kit de extracção de ARN de acordo com as instruções do fabricante e medir a carga viral por tempo real de RT-PCR com conjuntos de iniciadores e de sondas apropriadas para o vírus do HIV utilizada 4,8,18,19.
- Para medir a célula associada RNA do HIV e identificar células que estão ativamente infectadas pelo HIV, primeiro realizar RBC lise seguindo os passos 2.1.2
- suspensão de células ressuspender em 1; Ml PBS, dividir igualmente em dois tubos. Girar a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante.
- Para medir o ARN celular associada, extrair RNA usando o kit de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante e realizar em tempo real de RT-PCR utilizando conjuntos de iniciadores e de sondas apropriadas.
NOTA: É importante que o iniciador / sonda não reconhece o lentivírus modificadas usadas para as células-tronco - Para medir o HIV células infectadas por fluxo, Ressuspender as células em outro tubo em 50 ul de tampão de FACS e executar mancha de superfície com o anticorpo desejada, tal como anti-CD45, anti-CD4 e anti-CD3. Depois de mancha de superfície, corrigir e permeabilizar as células e coloração intracelular para a expressão da mordaça utilizando anticorpo anti-Gag (clone KC57). Realizar citometria de fluxo.
- Ensaio ex vivo de citocinas do gene modificado de células Os esplenócitos
- esplenócitos colheita de ratos, conforme descrito no ponto 2.2.2.
- Preparar células alvo. Para testar a funcionaldade de células T modificadas do receptor de antigénio quimérico CD4, utilizar as células infectadas pelo HIV T1 como células alvo. Infectar as células com HIV T1 3 dias antes do ensaio de citocinas, confirmar a infecção por VIH através da coloração das células intracelularmente com anticorpo anti-HIV gag (clone KC57). Use células T1 não infectados como células alvo de controlo.
- Co-incubar os esplenócitos com as células alvo de controlo ou na proporção de 1: 1 durante a noite. Para um melhor resultado, realizar uma titulação (1: 1, 1: 3, 1: 9) de effector (esplenócitos) versus células-alvo (T1s infectados). Por exemplo, ressuspender 0,9 milhões de esplenócitos em 0,25 ml RPMI mídia completo, adicionar 0,9, 0,3 ou 0,1 milhões de T1 infectados ou não infectados T1s ressuspensas em 0,25 ml RPMI mídia completo.
- Na manhã seguinte, adicionar inibidor do transporte de proteínas durante 6 horas para inibir o transporte de proteínas e realização da coloração para marcadores extracelulares e a expressão intracelular de citocinas, tal como descrito anteriormente em 8.
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Representative Results
A Figura 1 mostra um esboço da construção de ratinhos humanizados BLT com células estaminais modificado. 10 semanas após a cirurgia de implante, os ratinhos foram sacrificados para avaliar a diferenciação e desenvolvimento de células do gene modificado. Como mostrado na Figura 2, vários tecidos linfóides (sangue, baço, timo e medula óssea) foram colhidas a partir de um rato que foi modificado com CD4ζCAR. O CD4ζCAR utilizados no presente protocolo contém receptor de antigénio quimérico CD4 e GFP que pode ser detectada por um anticorpo anti-CD4 e a expressão de GFP 8. As células foram isoladas e coradas com anticorpo contra o CD45 humano, assim como anticorpos anti-CD4 e analisadas por citometria de fluxo. GFP e as células duplamente positivas CD4 foi detectada, indicando a presença de células CD4CAR + em vários tecidos linfóides.
Para investigar a diferenciação das células do gene modificado, os esplenócitos foram corados com anticorpos contra CD45 humano (linfócitos), CD3 (células T), CD19 (células B), CD14 (monócitos e macrófagos) e CD337 (células NK). Como mostrado na Figura 3, as células estaminais hematopoiéticas CD4ζCAR diferenciar em linhagens múltiplas.
Para investigar se as células CD4CAR modificados são funcionais, nós coincubated esplenócitos com células-alvo que as células CD4CAR reconheceria (células T1 infectada pelo HIV ou células T1 não infectados como controle). As células foram co-incubadas durante a noite e o inibidor de transporte de proteína adicionou-se durante um adicional de 6 horas. Em seguida, as células foram fixadas e permeabilizadas para corar para a expressão intracelular de citocinas, tais como IFNy e TNFa. Como mostrado na Figura 4, as células que expressam CAR produziu maior quantidade de IFNy e TNFa com células infectadas T1.
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Figura 1: Esquema de construção de camundongos humanizados BLT com células-tronco modificadas FT:. Timo fetal. FL:. Fígado fetal Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Células modificadas do receptor de antigénio quimérico de CD4 pode ser detectado em vários tecidos linfóides do rato com CD4CAR modificado HSCs foram sacrificados 10 semanas após a cirurgia e vários tecidos linfóides foram colhidos e as células foram coradas com anticorpos CD4 CD45 anti-humano e anti-humanos e analisadas por citometria de fluxo. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:.. Células modificadas do receptor antígeno quimérico CD4 podem se diferenciar em várias linhagens esplenócitos de ratinhos CD4CAR modificado foram colhidas e coradas com anticorpos contra CD45 humana, CD3, CD19, CD14 e CD337 e analisadas por citometria de fluxo Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.
Figura 4:. Ex ensaio in vivo de citocinas de células CD4 + T CAR esplenócitos de HIV camundongos infectados CD4CAR foram estimuladas com HIV células T1 infectado ou não infectado e sua produção intracelular de citocinas é mostrado. Por favor clique aqui para viewa versão maior desta figura.
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Discussion
Com CAR e baseado em HSC ganhando impulso imunidade projetado para os estudos clínicos, é importante ter um modelo animal adequado para examinar de perto a diferenciação e função destas células manipuladas. Neste protocolo, descrevemos os métodos para a construção e teste de camundongos humanizados com células-tronco geneticamente modificados projetados contra o HIV. É importante ter a transdução eficiente de células estaminais, antes do transplante. No entanto, devido à capacidade de células T a proliferar no reconhecimento de células alvo, os baixos níveis de modificação de células-tronco eram suficientes para gerar uma resposta robusta contra a replicação do HIV 8.
No entanto, para alcançar alto nível de modificação de células-tronco, recomendamos a utilização de células CD34 + transduzidas na mistura de proteína gelatinosa com timo autólogo, em vez de fígado e pedaços timo para a cirurgia de ratos que tinham sido descritos em outros lugares 13-15. mistura proteica gelatinosa é um solubilizEd membrana basal do tecido rico em proteínas da matriz extracelular. Sob condições fisiológicas normais, a mistura gelatinosa polimerizar proteína para produzir uma matriz reconstituído, biologicamente activa e estável, que iria permitir a ligação eficaz e diferenciação das células estaminais 20. reconstituição célula humana pode ser verificada por sangramento retro-orbital e citometria de fluxo 6 - 8 semanas pós-cirurgia. Para assegurar que o vector não é tóxico para a sobrevivência de células-tronco e a renovação, é recomendado para titular o vector em células CD34 + antes da experiência, conforme descrito em 1.2.6.
A capacidade do modelo de ratinho NSG-BLT para suportar a infecção das mucosas, viremia consistente e respostas imunes celulares a torna um modelo muito útil para estudar a patologia imunológica HIV e terapias baseadas em células para o tratamento de uma infecção por HIV. Mais importante ainda, as células T geradas a partir dos ratinhos NSG-BLT são seleccionados no tecido tímico autólogo, permitindo que o investigador para estudar o destinodo gene modificado células estaminais após a selecção tímica 8,21. Com o método descrito, temos sido capazes de obter 40% -90% de reconstituição imune celular humana de forma consistente. Os baixos níveis de reconstituição de células humanas pode resultar de vários fatores, incluindo as habilidades da pessoa que executa a cirurgia e a qualidade dos tecidos para transplante. Para atingir um alto nível de reconstituição de células humanas, é importante assegurar os transplantes estão correctamente colocados por baixo da cápsula do rim. Além disso, é altamente recomendável para examinar cada implante timo preparado para a cirurgia em microscópio de luz e descartar quaisquer peças questionáveis.
Embora o modelo humanizado rato BLT é uma ferramenta promissora para o estudo da imunidade projetados contra o HIV (revisto em 1,15,22), que tem suas próprias limitações. Ou seja, este modelo não imitam perfeitamente um sistema imunológico periférico humano. Estudos têm demonstrado desenvolvimento prejudicado de hiper-mutante, comutação de classe IgG Antibody 1,23. Além disso, utilizando camundongos imuno-deficientes é tecnicamente desafiador e mantendo estes ratos saudável requer recursos consideráveis e treinamento. infecções oportunistas sutis podem se manifestar como diferenças significativas entre as amostras e, potencialmente, ter consequências negativas para a experimentação. Por isso, é importante ter instalações bem preparadas e pessoal devidamente treinado para manter a integridade do futuro 1,24 dados. Com estas limitações em mente, o modelo do rato NSG-BLT humanizado ainda fornece uma ferramenta importante para o estudo da imunidade engenharia baseada em células-tronco, como é demonstrado por estes exemplos 4,8.
Com a tendência de desenvolvimento de receptores de antigénios quiméricos baseados em HIV ampla anticorpos 10 e modificação do domínio de sinalização para o carro mais eficiente neutralização 25, este modelo e do protocolo pode ser utilizado para caracterizar e investigar a funcionalidade do gene CEL modificadols com uma nova geração de carros. Além disso, este modelo pode potencialmente acomodar estudos sobre a terapia com base imune (tal como o bloqueio do receptor inibitório) em conjunto com a imunidade de engenharia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 microbead kit | Miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | For freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| Piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| Sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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