Abstract
HIV에 대한 줄기 세포 기반 유전자 요법의 급속한 발전으로, 유전자 변형 세포의 조혈 및 분화 면역 기능을 연구하기위한 동물 모델에 대한 요구 사항을 가압있다. 인간화 뼈 골수 / 간장 / 흉선 (BLT) 마우스 모델은 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하는 주변의 인간 면역 시스템의 전체 재구성을 허용한다. 인간의 흉선 이식은자가 흉선 조직에서 T 세포의 흉선 선택할 수 있습니다. HIV 감염의 연구 이외에도, 모델은 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)에서 유래 된 세포의 분화, 발달 및 기능을 연구하기위한 강력한 도구로 나타낸다. 형질 도입 조혈 모세포와 -Bone 골수 / 간 / 흉선 (NSG-BLT) 마우스 여기에 우리가 결합 된 면역 결핍 (SCID) -common 감마 체인 녹아웃 (- - / C γ)를 -severe 인간화 비 비만 당뇨병 (NOD)의 건설 개요 CD4 키메라 항원 수용체와 (CD4CAR)렌티 바이러스 벡터입니다. 우리는 CD4CAR 조혈 성공적 다중 계통으로 분화, 항 HIV 활성을 가질 수 있다는 것을 보여준다. 이 연구의 목적은 HIV에 대한 면역 설계에 대한 생체 내 모델로서 NSG-BLT 마우스 모델의 사용을 설명한다. 그것은 렌티 바이러스와 인체 조직이 사용되기 때문에, 실험과 수술이 특별한주의 (BSL2의 +) 설비와 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2)에 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야하는 것이 주목할 가치가있다.
Introduction
조합 된 항 - 레트로 바이러스 요법의 성공에도 불구하고 HIV 감염은 여전히 평생 질환이다. HIV에 대하여 세포 성 면역 반응은 HIV 복제를 조절하는데 매우 중요한 역할을한다. 줄기 세포 조작에서의 최근 발전은 HIV 치료 1-3 유전자 치료 접근의 급속한 발전을 허용했다. 그 결과, HIV에 대한 세포 - 기반 치료법의 효능의 생체 내 연구에 있도록 적절한 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다.
동물 모델에서 작업하는 HIV 바이러스는 인간 세포를 감염한다는 사실에 의해 복잡하게된다. 이러한 제한을 피하기 위해, 과학자들은 붉은 털 원숭이에서 4,5- 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)과 같은 질병 모델을 사용하는 것에 의존하고있다. 불행하게도 인해 종에 걸쳐 고유 차이와 SIV와 HIV 사이의 차이점이 모델의 주요 제한 사항이 있습니다. 또한, 단지 고도로 전문화 된 시설은 C는인간이 아닌 영장류 각각의 원숭이와 함께 작업을 지원 apable 큰 투자를 필요로한다. 따라서, HIV 감염 / 발병되기 쉽다 인간의 면역 시스템을 이용하여, 적은 경제적 금지하는 모델에 대한 가압이 필요하다.
(또는 NSG) 혈액 / 간 / 흉선 (BLT) 인간화 된 마우스 모델은 점점 입증하는 중요한 도구 비 비만 당뇨병 (NOD)가 결합 된 면역 결핍 (SCID) -common 감마 체인 녹아웃 (- - / C γ)를 -severe HIV 감염을 연구합니다. 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 태아 흉선을 주입함으로써, 마우스 개발 인간 면역계 1-3 요점을 되풀이 할 수있다. 줄기 세포 기반 유전자 치료제의 한 종류는 항원 특이 T 세포로 분화하는 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)를 재 프로그래밍함으로써 HIV를 타겟팅 말초 T 세포를 '재지'포함한다. 우리는 이전에 도시했는지 분자 클로닝 된 항 HIV 특이 T 세포와 재 설계 조혈SL9 에피토프 (아미노산 77-85; SLYNTVATL) 대 ceptor (TCR) HIV-1 개그는 인간화 NSG-BLT 마우스 모델 6에서 HIV 복제를 억제하는 성숙한 T 세포 형성에 줄기 세포를 리다이렉트 할 수있다. 분자 클로닝 TCR 사용의 경고는이 치료의 적용을 제한하는 특정 인간 백혈구 항원 (HLA) 서브 타입으로 제한된다는 것이다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 반면, 보편적 모두 HLA 서브 타입에 적용될 수있다. 초기 연구는 CD3의 도메인 신호 세포 내 ζ에 융합 된 인간 CD4의 세포 외 및 횡단 도메인으로 구성된 자동차를 이용하여 수행 하였다합니다 (CD4ζCAR 불린다). CD4ζCAR는 HIV 엔벨로프를 인정하고, T 세포 수용체 (7)에 의해 매개되는 것과 유사한 세포 독성 T 세포 반응을 유발할 수 CD8 T 세포에서 발현. 우리는 최근 인간의 조혈 모세포가 다음 여러 조혈 리로 분화 할 수 CD4ζCAR으로 수정 될 수 있음을 증명하고있다인간형 마우스 모델 8에서 HIV 복제를 억제 할 수있는 작용 성 T 세포를 포함 neages. 암 9 키메라 항원 수용체 치료의 급속한 발전, 그리고 강력한 광범위 중화 항체 단일 사슬 항체 자동차의 건설을 허용 HIV에 대한 10-12의 지속적인 특성, 그것은인지 CD4ζCAR 외에도 많은 새로운 후보의 구조이며, 생성 및 HIV 질환 및 기타 질환의 줄기 세포 기반 유전자 치료에 대해 시험한다. 또한, 이러한 항원 특이 차량을 포함하는 인간화 NSG-BLT 마우스 모델은 밀접하게 생체 내에서 인간 T 세포 반응을 조사하기 위해 유용한 도구를 제공 할 수있다. 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 BLT 마우스 그 조혈 모세포는 젤라틴 단백질 혼합물에서 태아 간 트렁크 (16) 대신에 사용됩니다에서 13-15의 인간화의 건설 이전에 기술 된 방법과 다릅니다. 이 프로토콜은 설명 humani 1) 건설CD4ζCAR으로 설계 평탄화 BLT 마우스; 2) 유전자 변형 세포의 분화의 특성화; 유 전적으로 변형 된 세포 기능, 3) 특성화.
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Protocol
윤리 정책 : 인간 태아 조직은 고급 생명 과학 자료 또는 Novogenix로부터 얻은 정보를 확인하고 그 사용을위한 IRB 승인을 필요로하지 않고 얻었다. 이 논문에 기술 된 동물 연구는 모든 연방, 주에 따라, 지역 가이드 라인에있는 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 및 (UCLA) 동물 연구위원회 (ARC)의 서면 승인하에 수행 하였다. 특히,이 연구는 국제 케어 및 국립 연구위원회의 실험 동물의 사용 및 인정 및 실험 동물 관리의 평가 및 인증 (AALAC) 협회의 가이드 라인에 대한 안내서의 지침을 엄격히 준수하에 수행 하였다 UCLA ARC 프로토콜 번호 2010-038-02B에서. 모든 수술은 케타민 / 자일 라진 및 이소 플루 란 마취 하에서 수행 하였다 모든 노력이 동물의 통증과 불편 함을 최소화하기 위해 만들어졌다.
CD4 키메라 항원 수용체으로 설계된 인간화 된 마우스의 1. 건설
- 태아 흉선를 처리하고 태아 간에서 CD34 + 조혈 모세포 격리를
- 흉선 처리
- 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브에 인산염 완충 식염수 (PBS), pH를 7.4에서 흉선을 씻는다. 반복 세척 단계 3-4 번.
- 7 ml의 RPMI 미디어 + 10 % FBS + 펜 / 연쇄상 구균을 추가합니다. 멸균 100mm 배양 접시에 모든 것을 가만히 따르다.
- 약 1mm 2의 작은 조각으로 흉선을 잘라 메스를 사용합니다. 96 웰 플레이트에 하나의 잘 하나 하나 흉선 조각을 놓습니다. 96 웰 플레이트에 흉선 조각을 전송할 때 사용 무딘 집게를 곡선.
- 티슈가 건조되지 않도록 웰의 모든 - (200 μL, 100)의 미디어를 소량 추가한다. 현미경으로 시각화 (thymi는 로브를 가지고 세포의 자루처럼 보일 것입니다).
참고 : 어떤 식 으로든 의심 보면 어떤 부분을 폐기;이 결합 조직은 종종 이것은 이식 할 수 없습니다.
- 티슈가 건조되지 않도록 웰의 모든 - (200 μL, 100)의 미디어를 소량 추가한다. 현미경으로 시각화 (thymi는 로브를 가지고 세포의 자루처럼 보일 것입니다).
- 확정-흉선 조각을 제거하고 T25 세포 배양 플라스크에 모두 배치. 10 % FBS와 보충 7 ml의 RPMI 매체와 혼합하는 피 페라 실린 / 타조 박탐 및 암포 테리 신 B를 조심스럽게 바위 플라스크에 450 ㎍ / ㎖의 추가. 문화 37 ºC / 5 % CO 2에서 플라스크의 하룻밤.
주의 :이 단계는 조직의 세균 오염을 방지 할 필요가있다. - (선택 단계) 나중에 사용할 수 있도록 흉선을 고정. 10 분 동안 10 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO) 90 % 인간 AB 혈청에서의 청크 평형. -50 ºC 1 ºC / 분의 속도로, -150 ºC로 급냉 그들을 고정. 해동 할 준비가되면 신속하게 37 ºC 물을 욕조에 녹여 부드럽게 DMSO없이 RPMI 완료 매체에서 배를 씻는다.
- 간 처리
- 조심스럽게 50 ML 원뿔 튜브에 PBS에서 간을 씻는다. 반복 세척 단계 3-4 번.
- 10 ml의 50 ML 원뿔 튜브 (Iscove의 수정 된 둘 베코의 미디어) IMDM 미디어를 추가합니다. 100mm의 멸균 페트리 접시에 모든 것을 가만히 따르다.
- 두 메스를 사용하여 간 조직을 균질화시킨다. 약 3mm 2의 작은 조각으로 간을 잘라. 잘라 및 흰색 결합 조직을 폐기합니다.
- 간 조각과 미디어를 차지하기 위해 16 게이지 무딘 바늘로 장착되어 10 ML의 주사기를 사용합니다. 그런 다음 50 ㎖ 원뿔 관에 전송할 수 있습니다.
- 부드럽게 미디어 및 조직 정지를 재현 탁 완전히 조직을 균질화 5-7 번 이상 배출.
- 10 ml의 IMDM 미디어는 효소 보충를 준비 : 500 U / ㎖ 콜라게나, 2400 U / ㎖ hyluronidase, 300 U / ㎖ DNase의뿐만 아니라 450 μg의 / ㎖의 피 페라 실린 / 타조 박탐 및 암포 테리 신 B를 다음 0.22 μm의 필터를 통해 미디어 필터 간 현탁액에 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 간 정지를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브 캡 및 파라 필름 t으로 자기 밀봉 필름 단단히 밀봉O 누수를 방지한다. 90 분 37 ºC에서 인큐베이터에서 튜브 회전에 회전합니다.
- 신선한 50 ㎖ 튜브에 100 μm의 세포 여과기를 통하여 소화 세포 현탁액을 필터.
참고 : 50 ㎖에 총 볼륨 업을 가지고 현탁액에 PBS를 추가합니다. 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액 25 ㎖를 함유하는 각각의 두 튜브에이를 분할. - 천천히 부드럽게 (예를 들면, 피콜) 10 ㎖ 밀도 원심 매체를 각각의 튜브에 세포를 언더. 브레이크없이 20 분 동안 1,200 XG에 스핀. 참고 :이 프로토콜에서 언급 된 모든 원심 분리가 실온 (25 ° C)에서 수행됩니다.
- 조심스럽게 두 개의 분리 된 50 ㎖ 튜브에 각 튜브 및 전송에서 인터페이스 (예., 버피 코트를) 제거합니다. PBS 50 ml의 인터페이스까지의 각 튜브의 볼륨을 가져와. 10 분 - 7 300 XG에 스핀. 조심스럽게 대기음 뜨는.
- 두 개의 알약을 결합합니다. 50 ml의 PBS가 2 % FBS를 포함하여 세 번 이상 씻으십시오. 10m - 7 300 XG에 스핀각각의 시간에 조심스럽게 상층 액을 흡입하면서.
- 50 ml의 RPMI 배지 + 10 % FBS에 펠렛을 재현 탁. 세포 분류를 진행하기 전에이 시점에서 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 즉시 CD34 키트를 정렬 (예., CD34 마이크로 비드), 제조 업체의 프로토콜에 따라 사용하여 정렬 CD34 + 세포.
참고 : 또는 세포가 하룻밤 / 1000000에서 RPMI 미디어 + 10 % FBS ㎖에 배양 할 수있다. - CD34 + 및 CD34- 부분을 모두 저장합니다.
참고 :이 단계에서, CD34 + 및 CD34- 세포가 Bambanker을 동결 매체 또는 다른 냉동 매개체를 이용하여 고정 할 수 있습니다. 4 1 ml의 고정 - 튜브 당 6 × 106 CD34 + 세포를 1 ml의 40 동결 - 튜브 60 × 10 (6) CD34- 세포를.
- 흉선 처리
- CD34 + 세포의 형질 도입
- 6 잘 조직 배양 플레이트의 요구 전달 우물의 수를 계산합니다. 도 1은 8 × 106 개의 셀을 형질 도입하는데 사용될 수있다. 에 대한각 BLT 마우스, 0.5 × 10 6 CD34의 +가 CD34- 세포와 신장 캡슐 아래 흉선 0.5 × 106 CD34 + 세포와 함께 이식 될 것이다 정맥 주사한다. 사용하는 CD34 + 세포 수는 쥐 (쥐 당 백만 셀)의 수에 의해 결정된다.
- 코트가 아닌 조직 문화의 우물의 필요 수는 재조합 인간 피브로넥틴 용액 1.25 ㎖ (예., Retronectin) (PBS에서 20 μg의가 / ㎖) 각각에 잘으로 6 웰 플레이트를 처리 하였다. 플레이트를 커버하고 깨끗한 바이오 캐비넷에서 실온에서 2 시간 동안 방치한다.
- 대기음 피브로넥틴 우물에서 솔루션 및 차단을 위해 각 웰에 FACS 버퍼 (4 % FBS와 PBS)의 1.25 ml를 추가합니다. 플레이트는 30 분 동안 실온 (25 ° C)에 서 할 수 있습니다.
- PBS와 한 번 대기음 FACS 버퍼 및 세척 우물.
- 플레이트를 사용할 준비가 될 때까지 코팅 된 웰에 PBS를 유지합니다. 즉시 사용하지 않을 경우 4 박 ºC에서 접시를 저장합니다.
- 피브로넥틴 용액 코팅 된 웰 (Yssel의 혈청 T 세포 배지에서 2 % 인간 혈청 알부민) 감염 배지에서 플레이트 CD34 + 세포 (~ 2 × 106 세포 / ㎖)을 1 시간 동안 37 ºC 부화.
- 사이 감염의 다양성 (MOI)에서 우물에 렌티 바이러스 벡터를 추가하는 피펫을 사용하여 2 - 10. 조심스럽게 혼합하고 37 ºC에서 밤새 품어.
참고 : 사용하는 렌티 바이러스 벡터의 역가가 사전에 결정되어야한다. - 부드럽게 세포 스크레이퍼로 우물의 바닥을 긁어하여 다음날 아침 세포를 수확. 세포를 수집하고이 시간에 혈구로 계산합니다.
- 임플란트에 대한 세포를 준비 ml의 1.5 멸균 나사 캡 튜브에 마우스, 나누어지는 당 4.5 × 10 6 CD34- 세포를 0.5 × 10 6 형질 CD34 + 세포를 결합합니다. , 대기음 뜨는를 펠릿 300 XG에서 세포를 스핀 다운. 300 XG에 다시 스핀과 P10 피펫을 사용하여 나머지 뜨는을 대기음 및 흡입 매우 캘리포니아refully. 연구를 통해 얼음에 건조 펠렛을 유지합니다. 참고 : 세포가 펠렛 세포를 사용하고 2 ~ 3 시간 이내에 수술을, 가능한 있는지 확인하십시오.
- , 대기음 뜨는를 펠렛 마우스 당 0.5 × 10 6 형질 CD34 + 세포를 스핀 주입 세포를 준비합니다. 마우스 당 100 μl의 RPMI 배지에서 세포를 재현 탁하고 얼음에 보관하십시오.
- 전달 효율을 확인하려면, 나누어지는 ~ 1 × 10 5 비 형질 보충, 200 ㎕의 사이토 카인 배지 (10 % FBS와 RPMI 미디어의 각 조건과 문화에서 CD34 + 세포를 형질 도입 100 NG / ml의 인간 IL-3, IL-6 37 ºC에서 칠일 - 5 96 웰 플레이트에서, SCF).
주 :이 전달을 보장하지만,이 단계에서 사용되는 세포는 수술에 사용되지는 성공하고 벡터 줄기 세포 생존 및 갱신 유해하지 않다. 전달 효율 (GFP 및 CD4 등.) 벡터의 유전자 발현에 대한보고 확인하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수있다.
- 조직 이식은 유전자 조작 마우스를 건설하는
- 같은 날 수술 이전은 세슘 137 조사기 2.7 Gy를 (270Rad)의 투여 량으로 NOD.Cg- Prkdc SCID Il2rg t m1Wjl / SzJ (NSG) 면역 손상 쥐의 전신 조사를 수행합니다.
참고 : NSG 마우스는 심각한 면역 있습니다. 따라서 자신의 주택 및 유지 보수가 가장 높은 건강 표준을 준수하고 고도로 훈련 된 직원에 의해 처리해야합니다. - 60 밀리미터 접시에 플라스크에서 흉선 조각 매체를 따르십시오. 투관침을 청소하고 젖은 신장을 유지하는 데 사용되는 다른 60mm 접시로 PBS를 따르십시오.
- 얼음에 열린 1.5 ml의 멸균 나사 캡 튜브에 배치하여 긍정적 인 변위 피펫 팁을 진정. 같은 마트 리겔로 건조 된 세포 펠렛 및 젤라틴 단백질 혼합물을 얼음에 보관하십시오.
참고 : 그것은 젤라틴 단백질 혼합물 및 튜브 또는 팁을 유지하는 것이 중요하다임플란트 바늘이로드 될 때까지 항상이 감기 터치합니다. - 쥐를 마취 : 개별적으로 마우스와 기록의 무게를 달아; 귀를 숫자로 마우스를 펀치. 케타민 15 μL (염수 중 2.6 ㎎ / ㎖) 체중 당 g / 크 실라 진 (식염수 100 ㎎ / ㎖))로 복강을 주입. 다시 케이지에 쥐를 넣고 완전히 마취 될 때까지 기다립니다.
참고 : 발을 압박하여 마우스의 마취 수준을 확인합니다. 마우스가 반사적으로 움찔하는 경우, 추가로 마우스를 마취하는 케타민 / 자일 라진 원래 양의 25-50%을 관리 할 수 있습니다. 이 반사적으로 수술을 수행하는 데 주저하지 않을 때까지 기다립니다. - 오스터 클리퍼 (면도기)를 사용하여 후면 위의 중심 사이 어깨 엉덩이에서 각 마우스의 좌측 면도. 피하 동물의 어깨 또는 서혜부 삼각형 (다리 피트)로 희석 카프로 펜 (6 ㎎ / ㎏)의 0.3 ml를 주입. 면봉을 사용하여, 인공 누액의 작은 방울을 넣어각각의 눈 위에 다시 케이지 옆에 마우스를 배치합니다.
참고 : - 한 번에 (5 마우스 약 4) 한 케이지에 제한 수술 준비. - PBS와 16 게이지 암 주입 바늘 (투관침)의 정맥을 플래시합니다. 무딘 곡선 포셉 한 쌍을 사용하여 한 캐 뉼러에 조직을 흡인하기 위해 다시 투관침에 당겨, 단지 개방 내부의 투관침과 캐 뉼러의 개방에 60mm 접시에서 흉선의 조각을 놓습니다.
- 건조 된 세포 펠렛 (이식 세포 CD34 + 및 CD34- 혼합물)로 튜브에 차가운 젤라틴 단백질 혼합물의 5 μl를 넣고 부드럽게 세포 현탁액을 생성하도록 자극하는 긍정적 인 변위 피펫 및 냉각 팁을 사용합니다. 최대 피펫 아래로하지 마십시오. 캐 뉼러의 구멍에 젤라틴 단백질 혼합물 / 세포 현탁액을 피펫 천천히 바늘을로드 다시 투관침에 당깁니다.
참고 : 하나는 임플란트 바늘을 조작하는 동안 피펫을로드 할 도우미를하는 것이 좋습니다. <리> 포비돈 - 요오드와 마우스의 면도 영역을 면봉과 이후 세 번 알코올로 영역을 닦아 닦아. 피부에서 가장 어두운 지점을 결정합니다. 이것은 비장의 위치를 나타낸다. 신장은 약 비장에 5mm의 지느러미입니다. 곡선 집게로 피부를 들어 올려 비장에 피부 평행 수술 가위와 15mm 긴 절개를합니다. 그 후 복막에서 비슷한 컷 아래 층합니다. 남성에서, 신장은 쉽게 볼 수 있어야하고, 복부 누름으로써 간단히 압출 할 수있다. 당신은 지혈 또는 곡선 무딘 포셉 한 쌍의 신장을 지원할 수 있습니다. 암컷 난소 쉽게 추출의 신장을 차단하는 경향이있다. 지혈제를 사용하여 난소를 선택하고주의 깊게 신장을 노출.
- 같은 날 수술 이전은 세슘 137 조사기 2.7 Gy를 (270Rad)의 투여 량으로 NOD.Cg- Prkdc SCID Il2rg t m1Wjl / SzJ (NSG) 면역 손상 쥐의 전신 조사를 수행합니다.
- 신장 캡슐의 뒤쪽 끝 부분에 작은 구멍을 뽑은 바늘 스쳐 집게를 사용합니다.
참고 : 생물 학적 자료를 처리하기 위해 이러한 바늘 스쳐 집게를 사용하지 마십시오. - 임플란트를 밀어캐 뉼러의 개구가 완전히 신장 캡슐에 의해 커버 될 때까지 구멍과 신장을 따라 바늘.
- 부드럽게 신장 캡슐에서 조직을 돌출하고, 바늘이 철회 당깁니다. 흉선 조각 확신 흉선 조각이 바늘로 나오지 않는 수 있도록 곡선 집게를 사용하여 접착 할 수있다.
- 포셉로 복막을 들어 올려 조심스럽게 제자리에 다시 신장을 밀어 지혈을 사용합니다. 4-0 vicryl 흡수성 봉합사를 사용하여 복막에 한 두 번 매듭 스티치를 묶어. 피부를 닫이 Autoclips에게 상처 클립을 사용합니다.
- 주입 방치 된 형질 CD34 + 세포를 혼합 인슐린 주사기로 100 μL (0.5x10 6 셀)의 흡수. 안와 정맥 주사 또는 정맥 주사의 다른 경로를 통해 마우스에 이들 세포를 주입한다. 면봉을 사용하여 장에 다시 옆으로 마우스를 각각의 눈에 인공 눈물의 작은 방울을 넣어 놓습니다.
- 모든 마우스는 ㄴ하면EEN은 동물이 의식을 회복하고 그들을 떠나기 전에 일반적으로 ambulating되어 있는지 확인 이식.
- 사후 운영 관리 : 수술 후 하루, 피하 각 마우스로 멸균 생리 식염수 0.3 희석 카프로 펜 (6 ㎎ / ㎏) ml의 1.2 ml를 주입. 2, 3 일 피하 각 마우스로 멸균 생리 식염수 1.5 ml를 주입 수술을 게시 할 수 있습니다. 마우스 및 수술 후 10~14일에 대한 절개를 모니터링합니다. Autoclips를 제거하고 10~14일 후 마우스의 무게를. 참고 : 방사선 식염수의 주입 탈수가되는 동물을 방지 한 후 마우스가 부진하다.
- 8 후 - 십주, 마우스 출혈 및 말초 혈액에 FACS 분석을 수행, 같은 CD45, CD3, CD4, CD8, 그리고 벡터 표현해야하는 유전자와 같은 마커 염색하여 생착을 확인합니다.
2. 차별화의 특성 및 유전자 변형 세포의 개발
- 의 특성말초 혈액에서 유전자 변형 세포
- 8 - 레트로 - 궤도 블리드에서 마우스 혈액 100 ㎕ - 십주 이식 후, 50을 구하십시오. EDTA의 10 μl를 포함하는 마이크로 원심 튜브에 넣습니다. 3 분 350 XG에 원심 분리기 세포. 플라즈마를 수집합니다. 마우스가 HIV가 감염된 경우 ELISA 분석 또는 플라즈마 바이러스 부하 분석을위한 -80에서 고정.
- 붉은 혈액 세포를 용균 2 ml의 NH 4 CL (83 %) 솔루션을 추가합니다. 실온 (25 ° C)에서 5 분 동안 품어. 부화 후, 튜브를 채우기 위해 10 ml의 RPMI 10 % FBS를 추가합니다. 5 분 동안 300 XG 스핀. 조심스럽게 대기음 뜨는. 세포 면역 염색에 대한 준비와 분석 및 기타 분석 유동 세포 계측법.
참고 : 다양한 조혈 세포 계통, 활성화, 그리고 순진 또는 메모리 셀에 대한 표현형 마커 마커는 2 주마다 이전과 유동 세포 계측법에 의한 HIV 감염 후 측정 할 수있다. 게이츠는 아이소 타입 컨트롤로 세포를 염색하여 만들어집니다. healt을 염색하는 것이 좋습니다HY 인간 PBMC를 사용 긍정적 제어 할 수 있습니다. 선택적으로, 마우스를 안락사 수 말초 혈액까지 1 ml의 흐름 분석 (17)의 복수의 패널에 충분한 세포를 제공 심장 천자로부터 얻을 수있다.
- 비장, 흉선과 골수에서 유전자의 특성 수정 세포
- 인간화 된 BLT 마우스에서 수확 비장, 흉선과 골수
- 이소 플루 란의 과다 복용을 사용하여 쥐를 안락사. 이차 자궁 경부 전위와 안락사를 확인합니다. 조직에 부착되는 모피 계속 70 % 에탄올로 카 커스의 표면을 분무. 왁스 해부 트레이의 사지를 고정.
- 피부를 열 절단 수술 가위를 사용하고 체강을 노출 복막 층을 잘랐다.
- 집게를 사용하여 비장을 제거합니다. 집게와 가위를 사용하여 신장의 흉선 임플란트를 제거합니다. 레이블 튜브 접점에있는 흉선 임플란트와 비장을 넣어ining PBS 5 ㎖.
- 중간 복부 절단 및 낮은 사지를 덮고 마우스의 말단 부분으로부터 피부를 제거에서.
- 가위를 사용하여 낮은 사지의 근육을 잘라 조심스럽게 고관절의 비구를 탈구. 대퇴골과 경골을 제거하고 PBS 5 ㎖를 포함하는 튜브에 배치합니다.
- 비장 세포의 분리
- 50 ML 원뿔 튜브에 100 ㎛ 셀 스트레이너를 놓습니다. 10 % FBS와 펜 / 연쇄상 구균 (RPMI 전체 미디어)로 보충 된 RPMI 미디어의 3 ㎖와 스트레이너 젖은.
- 셀 스트레이너에 비장를 놓습니다. 10 mL의 주사기의 플런저의 고무를 사용하여 50 ㎖ 튜브에 여과기를 통해 해리 비장 매쉬.
- 5 ml의 RPMI 전체 미디어 4 ~ 5 시간이 셀 스트레이너를 씻어.
- 10 분 동안 300 XG에 세포를 스핀.
- 5 ml의 적혈구 세포 용해 버퍼에 기음 뜨는 및에 resuspend 펠렛. 객실 템페라에서 품어10 분 동안 진짜야. 7 분 동안 300 XG에 20 ml의 RPMI 전체 미디어와 스핀을 추가합니다.
- 기음 뜨는 및 10 ml의 RPMI 완료 매체에 resuspend 펠렛과 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 다시 필터링합니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
주 : 세포 분석 흐름 생체 외 분석을 위해 사용될 수 있고 viably 나중에 사용하기 위해 고정 될 수있다. 셀 카운팅 전에 트리 판 블루는 생존 세포의 수를 결정하는데 사용될 수있다.
- 임플란트에서 인간의 흉선 세포의 분리
- 6 웰 플레이트의 웰에 PBS 5 ㎖로 흉선를 놓습니다. 사용하여 깨끗하고 무딘 집게와 가위는 작은 조각으로 흉선를 잘라.
- 우물에 멸균 스테인레스 스틸 메쉬 광장을 배치합니다. 10 mL의 주사기의 플런저의 고무를 사용하여, 흉선을 깨지 위해 스테인레스 메쉬 흉선 조각 매쉬.
- 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 잘 변형 세포를 재현 탁. 10 분 동안 300 XG에 세포를 스핀.10 ml의 RPMI 전체 미디어 세포를 일시 중단합니다. 대단히 짧은 시간을 볼 수있는 경우, 다시 셀 스트레이너를 통해 재현 탁 세포를 전달합니다.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
주 : 세포 유동 분석을 위해 사용 viably 나중에 사용하기 위해 고정 될 수있다.
- 골수에서 세포의 분리
- 청소 및 소독 박격포와 70 % 에탄올 유 봉. 박격포로 대퇴골과 경골을 놓습니다. 차가운 PBS의 5 ML을 추가합니다. PBS를 빛 핑크와 흐린 세가 될 때까지 뼈를 분쇄하는 유봉을 사용합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에 배치 된 50 μm의 셀 스트레이너를 통해 박격포와 필터에서 유체를 피펫. 5 ml의 PBS 박격포를 씻고 PBS가 명확해질 때까지 다섯 번 반복한다.
- 7 분 동안 300 XG에 세포를 스핀 다운. 10 ml의 RPMI 전체 미디어의 대기음 뜨는 및에 resuspend.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
주 : 세포 분석을 흐르고 냉동 viably F 일 수 생체 외 분석을 위해 사용될 수있다이상 사용합니다.
- 인간화 된 BLT 마우스에서 수확 비장, 흉선과 골수
유전자 변형 세포의 3. 기능적 특성
- HIV 감염과 바이러스 성 복제 동안 시간 모니터링
- 인간의 면역 시스템 재구성의 확인 후, 인슐린 주사기를 사용 복고풍 궤도 정맥 주사를 통해 HIV 바이러스의 원하는 양을 주입. HIV 감염 후, 복고풍 궤도는 2 주마다 출혈를 통해 100 μl의 말초 혈액을 수집합니다.
- 2.1.2 - 일부 2.1.1 단계에 따라 수확 플라즈마. HIV 바이러스 부하 분석의 경우, 제조업체의 지시에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 바이러스 성 RNA를 추출하고 4,8,18,19 사용되는 HIV 바이러스에 대한 적절한 프라이머 및 프로브 세트로 실시간 RT-PCR에 의해 바이러스 부하를 측정한다.
- 셀 관련 HIV의 RNA를 측정하고 적극적으로 HIV에 감염된 세포를 식별하기 위해 첫 번째 단계 2.1.2 다음 RBC 용해을 수행
- 1에 재현 탁 세포 현탁액; ml의 PBS 두 튜브에 균등하게 나눈다. 5 분 동안 300 XG 스핀. 기음 뜨는.
- 셀 관련된 RNA를 측정하기 위해, RNA는 제조자의 지시에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 적절한 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행 추출한다.
주 : 프라이머 / 프로브 수정 한 줄기 세포를 사용하는 렌티 바이러스를 인식하지 않는 것이 중요 - HIV에게 흐름에 의해 감염된 세포를 측정하기 위해, 50 μL FACS의 다른 튜브에 resuspend 세포는 버퍼 및 항 CD45, 안티 - CD4 및 항 CD3로 원하는 항체와 표면의 얼룩을 수행합니다. 표면 얼룩 후, 수정 및 안티 개그 항체 (클론 KC57)를 사용하여 개그 발현 세포 내에서 세포와 얼룩을 Permeabilize 하시려면. 유동 세포 계측법을 수행합니다.
- 유전자의 생체 사이토 카인 분석은 비장 세포에서 세포를 수정
- 마우스에서 수확 비장 섹션 2.2.2에 설명 된대로.
- 표적 세포를 준비합니다. 기능을 테스트하려면CD4 항원 수용체 키메라 변형 된 T 세포의 성만은 표적 세포로서 HIV 감염 T1 세포를 사용한다. 상기 사이토 카인 분석을 3 일 전에 HIV와 T1 세포를 감염 항 HIV 개그 항체 (클론 KC57)로 세포 내 세포를 염색하여 HIV 감염을 확인한다. 제어 대상 세포로서 T1 비감염 세포를 사용한다.
- 밤새 : 1 비율로 1 대상 또는 제어 세포와 비장 세포를 공동 배양한다. 최상의 결과를 위해, 적정을 수행 (1 : 1, 1 : 3, 1 : 9) 이펙터 (비장) 세포를 타겟 대 (감염 개의 T1). 예를 들어, 0.25 ml의 RPMI 완료 매체에 재현 탁 0.9, 0.3 0,100,000 감염 T1 또는 감염되지 않은 개의 T1을 추가, 0.25 ml의 RPMI 완료 매체에 90 만 비장 세포를 재현 탁.
- 6시간 단백질 수송을 억제하고 세포 마커 및 8에서 전술 한 바와 같은 사이토 카인의 세포 내 발현을 위해 염색 수행하는 다음날 아침, 단백질 수송 저해제를 추가한다.
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Representative Results
도 1은 변형 된 줄기 세포와 인간형 BLT 쥐 구성의 개략을 나타낸다. 10주 임플란트 수술 후, 마우스는 유전자 변형 된 세포의 분화 및 발달을 평가하기 위해 희생되었다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 다수의 림프 조직 (혈액, 비장, 흉선 및 골수) CD4ζCAR 변성 된 마우스로부터 수거 하였다. 이 프로토콜에 사용되는 CD4ζCAR는 항 CD4 항체 및 GFP 8의 발현에 의해 검출 될 수 CD4 키메라 항원 수용체와 GFP가 포함되어 있습니다. 세포를 단리하고 인간 CD45에 대한 항체뿐만 아니라 항 CD4 항체로 염색하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. GFP 및 CD4 이중 양성 세포는 여러 림프 조직에서 CD4CAR + 세포의 존재를 나타내는 검출되었다.
유전자 변형 세포의 분화를 조사하기 위해, 비장 세포는 인간 CD45 (림프구), CD3 (T 세포), CD19 (B 세포), CD14 (단핵구 및 대 식세포) 및 CD337 (NK 세포)에 대한 항체로 염색 하였다. 도 3에 도시 된 바와 같이, CD4ζCAR 조혈 줄기 세포는 다중 계통으로 분화.
CD4CAR 변성 세포가 작용하는 경우를 조사하기 위해, 우리는 CD4CAR 셀 (HIV 감염 T1 세포 또는 대조군으로 감염되지 않은 세포 T1)를 인식 할 표적 세포와 비장 세포를 coincubated. 세포를 밤새 공동 배양하고, 단백질 수송 억제제는 추가 6 시간 동안 첨가 하였다. 그 후, 세포는 고정 및 IFNγ와 TNFα와 같은 사이토 카인의 세포 내 발현 얼룩 투과성이되었다. 도 4에 도시 된 바와 같이, CAR 발현 세포 감염된 세포 T1 IFNγ 및 TNFα의 더 많은 양을 생산했다.
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그림 1 :. 태아 흉선 : 수정 된 줄기 세포와 인간화 된 BLT 마우스의 건설 FT의 개요. FL :. 태아 간 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. CD4 키메라 항원 수용체 변성 세포가 여러 림프 조직에서 검출 될 수 마우스 CD4CAR 변성 조혈 모세포로 수확 하였다 수술 복수 림프 조직 후 10 주에 희생시키고, 세포는 항 - 인간 CD45 및 항 인간 CD4 항체로 염색했다 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :.. CD4 키메라 항원 수용체 수정 된 세포는 여러 계통으로 분화 할 수 CD4CAR 변형 마우스의 비장 세포 수확과 인간의 CD45, CD3, CD19, CD14 및 CD337에 대한 항체로 염색과 흐름에 의해 분석 하였다 세포 계측법 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.
그림 4 :. CD4 CAR + T 세포의 전 생체 내 사이토 카인 분석은 HIV의 비장 세포는 CD4CAR 마우스가 표시됩니다 HIV 감염 또는 감염되지 않은 T1 세포 및 사이토 카인의 자신의 세포 내 생산 중 하나를 자극 하였다 감염. 경쟁하려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 WA 더 큰 버전.
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Discussion
CAR 및 임상 연구 향해 HSC 기반 설계 내성 획득 모멘텀 밀접 설계된 세포 분화 및 기능을 검토하기위한 적절한 동물 모델을 사용하는 것이 중요하다. 이 프로토콜에서 우리는 건설 및 HIV에 대한 설계 유 전적으로 변형 된 줄기 세포와 인간화 된 쥐를 시험하기위한 방법을 설명했다. 이식 전에 줄기 세포의 효율적인 전달을하는 것이 중요합니다. 그러나, 표적 세포의 인식에 따라 증식하는 T 세포의 능력으로 인해, 줄기 세포 변성 낮은 수준은 HIV 복제 8에 대해 강력한 응답을 생성하기에 충분 하였다.
그럼에도 불구하고, 줄기 세포 변형의 높은 수준을 달성하기 위해, 우리는자가 흉선 대신 간 및 다른 곳에서 13 ~ 15 설명했다 쥐 수술 흉선 청크와 젤라틴 단백질 혼합물에 형질 도입 CD34 + 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 젤라틴 단백질 혼합물이다 solubiliz세포 외 기질 단백질이 풍부 에드 조직의 기저막. 정상적인 생리적 조건 하에서, 젤라틴 단백질 혼합물은 줄기 세포 (20)의 효과적인 부착과 분화를 허용하는 재구성 된 생물학적 활성을 안정 행렬을 생성하는 중합. 인간의 세포 재구성 복고풍 궤도 출혈에 의해 확인 및 6 유동 세포 계측법 할 수 있습니다 - 팔주 수술 후. 벡터는 줄기 세포의 생존과 갱신 독성이되지 않도록, 이는 1.2.6에 기술 된 바와 같이 실험에 앞서 CD34 + 세포에서 벡터 역가를 권장합니다.
NSG-BLT 마우스 모델의 능력은 HIV 감염을 치료 한 HIV 면역 병리학 및 세포 - 기반 치료법 연구를 위해 매우 유용하게 점막 감염 모델 일관된 혈증 및 세포 면역 반응을 지원한다. 가장 중요한 NSG-BLT 생쥐에서 생성 된 T 세포 거동을 연구하기 위해 연구를 허용자가 흉선 조직에서 선택한흉선 선택 8,21 후 유전자 변형 된 줄기 세포. 설명 된 방법으로, 우리는 지속적으로 40 % -90 %에게 인간의 면역 세포 재구성을 얻을 수 있었다. 인간 세포 재구성 낮은 수준의 수술 및 이식 조직의 품질을 수행하는 사람의 기술을 포함하여 다수의 요인에 기인 할 수있다. 인간 세포 재구성 높은 수준을 달성하기 위해서는 확실하게 신장 캡슐 밑에 배치되는 이식을 위해 중요하다. 또한, 높은 광학 현미경 수술을 위해 준비 각각의 흉선 임플란트를 검사하고 의심스러운 부분을 삭제하는 것이 좋습니다.
인간화 BLT 마우스 모델 (1,15,22 검토) HIV에 대한 면역 설계 공부 유망한 도구이지만, 자체 한계가있다. 즉,이 모델은 완벽하게 인간의 말초 면역 시스템을 모방하지 않습니다. 연구는 하이퍼 돌연변이, 클래스 전환의 IgG antibo의 손상 발전을 보여 주었다1,23 DY. 또한, 면역 결핍 마우스를 사용하는 것은 기술적으로 도전하고 건강이 마우스를 유지하는 것은 상당한 자원과 훈련이 필요합니다. 미묘한 기회 감염 샘플에 걸쳐으로 유의 한 차이를 나타내 잠재적으로 실험에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 미래의 1.24 데이터의 무결성을 유지하기 위해 잘 준비 시설 적절히 훈련 된 직원이 중요하다. 이들 실시 예 4,8에 의해 입증 된 바와 같이 염두 이러한 제한으로, 인간화 NSG-BLT 마우스 모델은 여전히 줄기 세포 기반 설계 내성의 연구에 중요한 수단을 제공한다.
항체 (10)와보다 효율적 CAR 25 시그널링 도메인의 변경을 중화 HIV 확장에 기초 키메라 항원 수용체의 개발 추세로, 이러한 모델 및 프로토콜의 특성과 유전자 변형 CEL의 기능을 조사하기 위하여 사용될 수있다자동차의 새로운 세대와 함께 LS. 또한,이 모델은 잠재적으로 설계된 면역과 관련하여 (예를 억제 수용체 차단 등)를 기반으로 면역 치료에 대한 연구를 수용 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 microbead kit | Miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | For freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| Piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| Sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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