Abstract
Avec le développement rapide de la thérapie génique à base de cellules souches contre le VIH, il est urgent besoin d'un modèle animal pour étudier la différenciation hématopoïétique et la fonction immunitaire des cellules génétiquement modifiées. La moelle osseuse humanisé / Foie / Thymus (BLT) modèle de souris permet une reconstitution complète d'un système immunitaire humain à la périphérie, qui comprend les lymphocytes T, les lymphocytes B, les cellules NK et des monocytes. L'implant thymique humain permet également la sélection thymique des cellules T dans le tissu thymique autologue. En plus de l'étude de l'infection par le VIH, le modèle se présente comme un outil puissant pour étudier la différenciation, le développement et la fonctionnalité des cellules dérivées de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Nous exposons ici la construction de humanisé non obèse diabétique (NOD) -severe immunodéficientes combinée (SCID) gamma -common chaîne knockout (c γ - / -) -Bone-moelle / Foie / Thymus (NSG-BLT) souris avec CSH transduites avec CD4 récepteur d'antigène chimérique (CD4CAR)vecteur lentivirus. Nous montrons que la CD4CAR CSH peut réussir à se différencier en plusieurs lignées et ont une activité anti-VIH. Le but de l'étude est de démontrer l'utilisation du modèle de la souris NSG-BLT comme modèle in vivo de l' immunité d' ingénierie contre le VIH. Il est intéressant de noter que, parce lentivirus et les tissus humains sont utilisés, les expériences et les chirurgies doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II dans un niveau de biosécurité 2 (NSB2) avec des précautions particulières installation (NSB2 de +).
Introduction
Malgré le succès de la thérapie anti-rétrovirale combinée, l'infection au VIH est encore une maladie chronique. La réponse immunitaire cellulaire contre le VIH joue un rôle très important dans le contrôle de la réplication du VIH. Les progrès récents dans la manipulation de cellules souches a permis le développement rapide de la thérapie génique approches pour le traitement du VIH 1-3. Par conséquent, il est important de disposer d' un modèle animal approprié qui permet étude in vivo de l'efficacité des thérapies basées sur les cellules contre le VIH.
En travaillant avec le VIH dans des modèles animaux est compliquée par le fait que le virus infecte uniquement les cellules humaines. Pour contourner cette limitation, les scientifiques ont eu recours à l' aide de modèles de maladies comme le virus de l' immunodéficience simienne (SIV) chez le macaque rhésus 4,5. Malheureusement, il y a des limites importantes sur ce modèle en raison des différences inhérentes entre les espèces et les différences entre les SIV et le VIH. En outre, seuls les établissements hautement spécialisés sont capable de soutenir le travail avec des primates non humains et chaque macaque nécessite un investissement important. Par conséquent, il existe un besoin urgent pour un modèle qui utilise le système immunitaire humain, qui est sensible à l'infection par le VIH / pathogenèse, et il est moins prohibitif.
Le non-obèses diabétiques (NOD) -severe immunodéficientes combinée (SCID) gamma -common chaîne knockout (c γ - / -) (ou NSG) Sang / Foie / Thymus (BLT) modèle de souris humanisé est de plus en plus avéré être un outil important pour étudier l'infection à VIH. Par l' implantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et thymus foetal, les souris sont capables de développer et de récapituler un système immunitaire humain 1-3. Un type de thérapie génique à base de cellules souches implique '' rediriger les cellules T périphériques pour cibler le VIH en reprogrammant cellules souches hématopoïétiques (CSH) de se différencier en lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Nous avons montré précédemment que les CSH d'ingénierie avec un anti-VIH spécifique re T cellulaire et moléculaire clonéceptor (TCR) contre l'épitope SL9 (acides aminés 77-85; SLYNTVATL) du VIH-1 Gag peut rediriger les cellules souches en cellules formant T matures qui suppriment la réplication du VIH dans le modèle de la souris NSG-BLT humanisé 6. La mise en garde d'utiliser un clone moléculaire de TCR est qu'elle est limitée à un antigène de leucocyte humain (HLA) de sous-type spécifique qui limite l'application de cette thérapie. récepteurs d'antigènes chimériques (CAR), d'autre part, peuvent être universellement appliquées à tous les sous-types HLA. Les premières études ont été effectuées en utilisant un CAR construit avec les domaines extracellulaire et transmembranaire de CD4 humaine fusionné au ζ domaine intracellulaire de CD3 de signalisation (appelé le CD4ζCAR). CD4ζCAR exprimé sur les lymphocytes T CD8 peuvent reconnaître l' enveloppe du VIH et de déclencher une réponse des lymphocytes T cytotoxiques qui est similaire à celle médiée par un récepteur de lymphocyte T 7. Nous avons récemment démontré que les CSH humaines peuvent être modifiés avec CD4ζCAR, qui peut alors se différencier en plusieurs hématopoïétique lineages, y compris les lymphocytes T fonctionnels capables de supprimer la réplication du VIH dans le modèle de souris humanisée 8. Avec les progrès rapides dans les thérapies du récepteur de l' antigène chimérique pour le cancer 9, ainsi que la caractérisation continue des grands anticorps neutralisants puissants 10-12 contre le VIH qui permettent à la construction d' une seule chaîne RAC d'anticorps, il est perceptible que de nombreuses nouvelles constructions candidates, en plus CD4ζCAR seront générés et testés pour la thérapie génique à base de cellules souches de maladies associées au VIH et d'autres maladies. En outre, le modèle de la souris NSG-BLT humanisé contenant ces RAC spécifiques de l' antigène peut également fournir un outil utile pour examiner de près les réponses des lymphocytes T humains in vivo. Surtout, notre protocole diffère des procédés précédemment décrits pour la construction de humanisé de souris BLT 13-15 en ce que les cellules souches hématopoïétiques dans un mélange de protéines gélatineux est utilisé à la place du tronc de foie foetal 16. Ce protocole décrit: 1) la construction de humanisouris BLT zed ingénierie avec CD4ζCAR; et 2) la caractérisation de la différenciation des cellules génétiquement modifiées; et 3) Caractérisation de la fonctionnalité des cellules génétiquement modifiées.
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Protocol
Déclaration Ethic: tissu fœtal humain a été obtenu à partir Biosciences avancée Ressources ou de Novogenix et a été obtenu sans identifier l' information et n'a pas besoin d' approbation de l' IRB pour son utilisation. La recherche animale décrite dans ce manuscrit a été réalisée sous l'approbation écrite de l'Université de Californie, Los Angeles, et de la recherche (UCLA) Animal (ARC), conformément à toutes les lois fédérales, étatiques et directives locales. Plus précisément, ces études ont été réalisées dans le strict respect des lignes directrices dans le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches et l'accréditation et les lignes directrices de l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des laboratoires de protection des animaux (AALAC) international en vertu de l'UCLA ARC Protocole Numéro 2010-038-02B. Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous la kétamine / xylazine et isoflurane anesthésie et tous les efforts ont été faits pour minimiser la douleur et l'inconfort animal.
1. Construction de souris humanisée Conçu avec CD4 chimériques Antigène Receptor
- Traitement fœtal Thymus et Isoler CD34 + CSH de foie fœtal
- traitement Thymus
- Lavez délicatement le thymus dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4, dans un tube de 15 ml conique. Répétez l'étape de lavage 3 - 4 fois.
- Ajouter 7 ml de milieu RPMI + 10% de FBS + Pen / streptocoque. Décanter le tout dans une boîte de 100 mm de Pétri stérile.
- Utiliser des scalpels pour couper le thymus en petits morceaux d'environ 1 mm 2. Placez chaque morceau thymus unique dans un seul puits sur une plaque de 96 puits. Utilisez courbe pince émoussée lors du transfert de pièces thymus à la plaque de 96 puits.
- Ajouter une petite quantité de support (100 - 200 pl) à tous les puits de telle sorte que le tissu ne sèche pas. Visualisez au microscope (thymus ont lobes et devrait ressembler à des sacs de cellules).
REMARQUE: Jeter les morceaux qui semblent douteux de quelque façon;il y a souvent du tissu conjonctif, ce qui ne doit pas être implanté.
- Ajouter une petite quantité de support (100 - 200 pl) à tous les puits de telle sorte que le tissu ne sèche pas. Visualisez au microscope (thymus ont lobes et devrait ressembler à des sacs de cellules).
- Retirer les morceaux confirmé-thymus et tous les placer dans un flacon de culture de cellules T25. Ajouter 7 ml de milieu RPMI additionné de 10% de FBS et 450 pg / ml de pipéracilline / tazobactam et amphotéricine B. flacon doucement roche pour mélanger. Culture du jour au lendemain du ballon à 37 ° C / 5% de CO 2.
Remarque: Cette étape est nécessaire pour éviter la contamination bactérienne des tissus. - (Étape optionnelle) Geler le thymus pour une utilisation future. Equilibrer les morceaux de 90% de sérum AB humain avec 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) pendant 10 minutes. Les congeler à une vitesse de 1 ° C / min à -50 ° C, puis un refroidissement rapide à -150 ºC. Lorsque vous êtes prêt à fondre, dégeler rapidement dans un bain d'eau à 37 ° C et laver délicatement 3x dans un milieu RPMI complet sans DMSO.
- Traitement du foie
- Lavez délicatement le foie dans du PBS dans un tube conique de 50 ml. Répétez l'étape de lavage 3 - 4 fois.
- Ajouter 10 ml (Modified Médias Dulbecco d'Iscove) le média de IMDM à 50 ml tube conique. Décanter le tout dans une boîte de Petri stérile à 100 mm.
- Homogénéiser le tissu hépatique en utilisant deux scalpels. Couper le foie en petits morceaux d'environ 3 mm 2. Couper et jeter tout tissu conjonctif blanc.
- Utilisez seringue de 10 ml munie d'une aiguille émoussée de calibre 16 pour prendre les morceaux de foie et les médias. Transférer ensuite dans un tube conique de 50 ml.
- Resuspendre doucement la suspension des médias et de tissus et d'expulser 5-7 fois plus pour homogénéiser le tissu complètement.
- Préparer 10 ml de milieu de IMDM complété avec des enzymes: 500 U / ml de collagénase, 2.400 U / ml hyaluronidase, et 300 U / DNase ml, ainsi que 450 pg / ml de pipéracilline / tazobactam et amphotéricine B. Filtrer les médias par l'intermédiaire d'un filtre de 0,22 um puis ajouter les médias à la suspension du foie.
- Boucher le tube conique de 50 ml contenant la suspension du foie et de sceller hermétiquement avec un film auto-étanche tel que le t Parafilmo éviter les fuites. Tourner dans un rotateur de tube dans l'incubateur à 37 ° C pendant 90 min.
- On filtre la suspension cellulaire digérée à travers une cellule tamis de 100 um dans un nouveau tube de 50 ml.
NOTE: Ajouter PBS à la suspension pour amener le volume total à 50 ml. Découpé dans deux tubes de 50 ml contenant chacun des tubes de 25 ml de suspension cellulaire. - Lentement et doucement underlay les cellules dans chaque tube avec 10 ml de milieu de densité de centrifugation (par exemple, Ficoll). Spin à 1200 xg pendant 20 min sans frein. Remarque: tous centrifugation mentionné dans ce protocole se fait à la température ambiante (25 ° C).
- Retirez délicatement l'interface (ie., Buffy coat) de chaque tube et transfert à deux tubes de 50 ml distincts. Amener le volume de chaque tube de l'interface jusqu'à 50 ml avec du PBS. Spin à 300 xg pendant 7-10 min. Aspirer le surnageant avec précaution.
- Combiner les deux pastilles. Laver trois fois avec 50 ml de PBS contenant 2% de FBS. Spin à 300 xg pendant 7 - 10 mdans chaque fois tout en aspirant soigneusement le surnageant.
- Reprendre le culot dans 50 ml de milieu RPMI + 10% de FBS. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre à ce moment avant de procéder à un tri cellulaire.
- Tri cellules CD34 + CD34 en utilisant immédiatement Kit de tri (par ex., CD34 microbilles), selon le protocole du fabricant.
NOTE: Alternativement, les cellules peuvent être cultivées dans un milieu RPMI + 10% de FBS à 1 million / ml pendant une nuit. - Enregistrer la fois CD34 + et CD34 fraction.
NOTE: A ce stade, les cellules CD34 + et CD34 peuvent être congelés en utilisant Bambanker médias congélation ou d'autres médias de congélation. Gel 1 ml de 4-6 x 10 6 cellules CD34 + par tube et congeler 1 ml de 40 - 60 x 10 6 CD34 cellules par tube.
- traitement Thymus
- Transduction de cellules CD34 +
- Calculer le nombre de puits de transduction requises d'une plaque à 6 puits-culture tissulaire. 1 et peut être utilisé pour transduire jusqu'à 8 x 10 6 cellules. Pourchaque souris BLT, 0,5 x 10 6 CD34 + sera implanté le long avec des cellules CD34 et thymus sous capsule rénale et 0,5 x 10 6 cellules CD34 + seront injectés par voie intraveineuse. Le nombre de cellules CD34 + à utiliser est déterminé par le nombre de souris (1 million de cellules par souris).
- Enduire le nombre nécessaire de puits d'une culture non-tissu traité plaque de 6 puits avec 1,25 ml de solution recombinant de fibronectine humaine (par exemple., Rétronectine) (20 pg / ml dans PBS) dans chaque puits. Couvrir la plaque et laisser reposer pendant 2 h à température ambiante dans une enceinte de sécurité biologique propre.
- une solution de fibronectine Aspirer à partir des puits et ajouter 1,25 ml de tampon FACS (PBS avec 4% de FBS) dans chaque puits pour le blocage. Laisser la plaque reposer à la température ambiante (25 ° C) pendant 30 min.
- Aspirer FACS Buffer et les puits de lavage une fois avec PBS.
- Gardez PBS dans les puits revêtus jusqu'à ce que la plaque est prête à l'emploi. Rangez la plaque à 4 ° C pendant la nuit si non utilisé immédiatement.
- CD34 + cellules de plaques dans Infection moyenne (2% sérum - albumine humaine dans le sérum-Free T-Cell Yssel moyenne) dans fibronectine puits de solution revêtu (~ 2 x 10 6 cellules / ml) et incuber à 37 ° C pendant 1 h.
- Utiliser une pipette pour ajouter vecteur lentiviral dans les puits à une multiplicité d'infection (MOI) entre 2 - 10. Mélanger doucement et incuber une nuit à 37 ºC.
REMARQUE: Le titre du vecteur de lentivirus utilisé doit être déterminée au préalable. - Récolter les cellules, le lendemain matin en grattant doucement les fonds des puits avec un grattoir à cellules. Recueillir les cellules et compter avec hémocytomètre en ce moment.
- Pour préparer des cellules pour implant, mélanger 0,5 x 10 6 cellules CD34 + transduites avec 4,5 x 10 6 CD34 cellules par souris, aliquote dans des tubes vis-bouchon stérile de 1,5 ml. Faites tourner les cellules vers le bas à 300 xg pour les sédimenter, aspirer le surnageant. Spin à nouveau à 300 xg et aspirer tout surnageant restant à l'aide d'une pipette P10 et aspiration très carefully. Gardez les granulés secs sur la glace tout au long de l'étude. Remarque: Pour vous assurer que les cellules sont viables, utiliser les cellules sédimentées et effectuer l'intervention chirurgicale dans 2-3 h.
- Pour préparer des cellules pour l' injection, de spin 0,5 x 10 6 cellules CD34 + transduites par souris pour les sédimenter, aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 100 pl RPMI médias par souris et de garder sur la glace.
- Pour vérifier l' efficacité de transduction, aliquote ~ 1 x 10 5 non transduites et transduites des cellules CD34 + à partir de chaque état et la culture dans 200 milieu de cytokine ul (milieu RPMI avec 10% de FBS, supplémenté avec 100 ng / ml d' IL-3 humaine, l' IL-6 , SCF) dans la plaque de 96 puits pour 5 - 7 jours à 37 ° C.
NOTE: Les cellules utilisées dans cette étape ne sont pas utilisés pour la chirurgie, mais de veiller à ce que la transduction est réussie et le vecteur est pas toxique pour la survie des cellules souches et de renouvellement. L' efficacité de transduction peut être vérifiée par la recherche de l' expression des gènes du vecteur (par ex., La GFP et CD4) et l' analyse par cytométrie en flux.
- Greffes de tissus pour construire des souris génétiquement modifiées
- Le même jour avant l'intervention chirurgicale effectuer une irradiation corporelle totale des NOD.Cg- Prkdc scid IL2RG t m1Wjl / SZJ (NSG) des souris immunodéprimées avec un irradiateur Césium-137 et une dose de 2,7 Gy (270Rad).
NOTE: Les souris NSG sont gravement immunodéprimés. Par conséquent, leur logement et l'entretien doivent être conformes à la norme de santé la plus élevée et géré par un personnel hautement qualifié. - Verser morceaux thymus et le milieu de la fiole dans un plat de 60 mm. Verser PBS dans un autre plat de 60 mm, qui sera utilisé pour nettoyer le trocart et de garder le rein humide.
- Réfrigérer conseils déplacement de pipettes positifs en les plaçant dans 1,5 ml stériles tubes à bouchon à vis ouverts sur la glace. Conserver sur de la glace avec les culots de cellules sèches et mélange de protéines telles que gélatineux Matrigel.
NOTE: Il est important de garder le mélange de protéines gélatineuse et des tubes ou des conseils quiva toucher froid en tout temps jusqu'à ce que l'aiguille de l'implant est chargé. - Anesthetize les souris: Peser les souris individuellement et poids record; oreille coup de poing la souris pour les dénombrer. Les injecter par voie intraperitoneale avec 15 ul de kétamine (2,6 mg / ml dans une solution saline) / xylazine (100 mg / ml dans du sérum physiologique) par gramme de poids corporel). Mettez les souris de retour dans la cage et attendez qu'il soit complètement anesthésié.
REMARQUE: Vérifiez le niveau de la souris d'anesthésie en serrant une patte. Si la souris sursaute réflexive, administrer 25-50% du montant initial de kétamine / xylazine pour anesthésier la souris plus loin. Attendez qu'il ne bronche pas réflexive pour effectuer la chirurgie. - Utilisation de la tondeuse Oster (rasoir), de se raser le côté gauche de chaque souris de la hanche à l'épaule entre le centre de l'arrière et de l'estomac. Injecter sous-cutanée de 0,3 ml de la carprofène diluée (6 mg / kg) dans l'épaule de l'animal ou d'un triangle inguinal (fosse de la jambe). En utilisant un coton-tige, mettre une petite goutte de larmes artificiellessur chaque œil et poser la souris sur sa face arrière dans la cage.
REMARQUE: Limite de préparation à la chirurgie une cage (environ 4-5 souris) à la fois. - Rincer la canule de l'aiguille d'implant du cancer de calibre 16 (trocart) avec du PBS. En utilisant une paire de pinces courbes émoussées, placez un morceau de thymus de la boîte de 60 mm dans l'ouverture de la canule avec le trocart juste à l'intérieur de l'ouverture, puis tirez sur le trocart pour aspirer le tissu dans la canule.
- Utiliser une pipette volumétrique et une pointe refroidie à mettre 5 pi de mélange de protéines gélatineuse froid dans le tube avec un culot cellulaire séché (mélange CD34 + et CD34 pour les cellules implantées) et remuer doucement pour générer une suspension cellulaire. Ne pas pipeter de haut en bas. Pipeter la protéine suspension mélange / cellulaire gélatineux dans l'ouverture de la canule et tirez lentement sur le trocart pour charger l'aiguille.
NOTE: Il est recommandé d'avoir une aide pour charger la pipette tandis que l'un manipule l'aiguille de l'implant. <li> Swab la zone rasée de la souris avec Povidone-iode, puis essuyez la zone avec un tampon imbibé d'alcool à trois reprises. Déterminer le point le plus foncé sous la peau. Ceci indique l'emplacement de la rate. Le rein est d'environ 5 mm dorsale à la rate. Soulevez la peau avec des pinces incurvées et faire une longue incision de 15 mm avec des ciseaux chirurgicaux dans la peau parallèlement à la rate. Ensuite, faire une coupe similaire dans le péritoine couche au-dessous. Chez les hommes, le rein doit être facilement visible, et peut être extrudée en appuyant simplement sur l'abdomen. Vous pouvez soutenir le rein avec un hémostatique ou une paire de pince émoussée incurvées. Chez les femelles, les ovaires ont tendance à bloquer le rein d'extraction facile. L'utilisation d'un hémostatique, ramasser l'ovaire et d'exposer le rein avec soin.
- Le même jour avant l'intervention chirurgicale effectuer une irradiation corporelle totale des NOD.Cg- Prkdc scid IL2RG t m1Wjl / SZJ (NSG) des souris immunodéprimées avec un irradiateur Césium-137 et une dose de 2,7 Gy (270Rad).
- Utilisez la pince à aiguille à bout pour arracher un petit trou à l'extrémité postérieure de la capsule du rein.
NOTE: Ne pas utiliser ces pinces à aiguilles à pointe pour manipuler les matières Biohazard. - Faites glisser l'implantl'aiguille dans le trou et le long du rein jusqu'à ce que l'ouverture de la canule est complètement recouverte par la capsule du rein.
- extruder délicatement le tissu sous la capsule du rein, et tirer l'aiguille arrière. Les morceaux de thymus peuvent être collante afin d'utiliser une pince incurvées pour vous assurer que la pièce de thymus ne sort pas avec l'aiguille.
- Soulevez le péritoine avec la pince et utiliser doucement le hémostatique pour pousser le rein en place. Attachez un double point noué dans le péritoine en utilisant 4-0 vicryl sutures absorbables. Utilisez deux Autoclips clips enroulés pour fermer la peau.
- Mélanger les cellules CD34 + transduites qui ont été mis de côté pour l' injection et l' absorption de 100 pi (0,5x10 6 cellules) dans une seringue à insuline. Injecter ces cellules dans la souris par injection dans la veine rétro-orbitaire ou d'autres voies d'injection intraveineuse. En utilisant un coton-tige, mettre une petite goutte de larmes artificielles sur chaque œil et poser la souris sur sa face arrière dans une cage.
- Une fois que toutes les souris ont been implanté, confirment que les animaux reprennent conscience et ambulantes normalement avant de les quitter.
- Les soins post-opératoire: Le jour après la chirurgie, sous-cutanée injecter 0,3 ml de carprofène dilué (6 mg / kg) et 1,2 ml de solution saline stérile dans chaque souris. 2 et 3 jours après l'intervention chirurgicale, sous-cutanée injecter 1,5 ml de solution saline stérile dans chaque souris. Surveiller les souris et les incisions pour 10-14 jours après la chirurgie. Retirez le Autoclips et peser les souris après 10-14 jours. NOTE: Les souris sont lentes après la radiothérapie et l'injection d'une solution saline empêche les animaux de se déshydrater.
- Après 8 - 10 semaines vérifier la greffe par le saignement des souris et en effectuant une analyse FACS sur le sang périphérique, la coloration des marqueurs tels que CD45, CD3, CD4, CD8, et tous les gènes du vecteur doit exprimer.
2. Caractérisation de la différenciation et le développement du gène modifié Cellules
- caractérisation deGène modifié les cellules du sang périphérique
- 8 - 10 semaines après la greffe, obtenir 50 - 100 pi de sang de souris de rétro-orbital purge. Placer dans des tubes à centrifuger contenant 10 pi d'EDTA. Centrifuger les cellules à 350 g pendant 3 min. Collecter plasma. Congeler à -80 pour l'analyse ELISA ou de plasma test de charge virale si la souris est infectée par le VIH.
- Ajouter 2 ml de NH 4 Cl (83%) , une solution pour lyser les globules rouges. Laisser incuber pendant 5 minutes à température ambiante (25 ° C). Après incubation, on ajoute 10 ml de RPMI 10% SVF pour remplir le tube. Spin à 300 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant avec précaution. Les cellules sont prêtes pour immunocoloration et cytométrie de flux et d'autres tests.
NOTE: Les marqueurs de différentes lignées hématopoïétiques cellulaires, activation et marqueurs phénotypiques pour les cellules naïves ou de la mémoire peut être mesurée toutes les 2 semaines avant et après l'infection à VIH par cytométrie en flux. Portes sont créés par la coloration des cellules avec des contrôles isotypiques. Il est recommandé de tacher healthy CMSP humaines et de l'utilisation que de contrôle positif. En variante, la souris peut être euthanasiés et jusqu'à 1 ml de sang périphérique peuvent être obtenues à partir de ponction cardiaque qui fournira suffisamment de cellules pour de multiples panneaux d'analyse d'écoulement 17.
- Caractérisation des gènes modifiés Les cellules de rate, le thymus et la moelle osseuse
- Récolte Spleen, Thymus et de moelle osseuse de la souris humanisée BLT
- Euthanize des souris en utilisant une surdose d'isoflurane. Confirmer l'euthanasie à la dislocation cervicale secondaire. Pulvériser la surface de la carcasse avec 70% d'éthanol afin de maintenir la fourrure de coller aux tissus. Pin vers le bas les branches sur un plateau de cire de dissection.
- Utilisez des ciseaux chirurgicaux, ouvrir la peau, puis couper à travers la couche péritonéale pour exposer la cavité du corps.
- Retirer la rate en utilisant une pince. Retirer l'implant thymique sur le rein en utilisant des pinces et des ciseaux. Mettez l'implant thymique et la rate chez marqué tubes containing 5 ml de PBS.
- De la mi-abdomen coupé et enlever la peau de la partie distale de la souris recouvrant les membres inférieurs.
- Couper les muscles des membres inférieurs avec des ciseaux et disloquent soigneusement le cotyle de l'articulation de la hanche. Enlever le fémur et le tibia et les placer dans un tube contenant 5 ml de PBS.
- L' isolement des splénocytes
- Placer un tamis cellulaire de 100 um sur un tube conique de 50 ml. Mouiller la crépine avec 3 ml de milieu RPMI additionné de 10% de FBS et Pen / streptocoque (RPMI complet des médias).
- Placez la rate sur le tamis cellulaire. À l'aide du piston en caoutchouc d'une seringue de 10 ml, écraser la rate pour dissocier à travers le tamis dans le tube de 50 ml.
- Rincer la crépine de cellules avec 5 ml de RPMI médias complets 4 à 5 fois.
- Spin cellules à 300 xg pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml de tampon de lyse des globules rouges. Incuber à la chambre temperature pendant 10 min. Ajouter 20 ml RPMI milieu complet et rotation à 300 xg pendant 7 min.
- Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de RPMI milieu complet et filtrer à nouveau à travers un tamis de 100 um de la cellule. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
NOTE: Les cellules peuvent être utilisées pour les ex vivo des essais, l' analyse de débit et peuvent être congelés de manière viable pour une utilisation ultérieure. Avant le comptage des cellules, le bleu Trypan peut être utilisée pour déterminer le nombre de cellules viables.
- Isolement des thymocytes humains de l' implant
- Placer le thymus dans 5 ml de PBS dans un puits d'une plaque à 6 puits. Utilisation de pinces et ciseaux émoussés propres couper le thymus en petits morceaux.
- Placez un carré de maille d'acier inoxydable stérilisé dans le puits. À l'aide du piston en caoutchouc d'une seringue de 10 ml, écraser les morceaux thymus sur le treillis en acier inoxydable pour briser le thymus.
- Resuspendre les cellules et filtrer à travers un tamis de 100 um de la cellule. Spin cellules à 300 xg pendant 10 min.Suspendre les cellules dans 10 ml de RPMI milieux complets. Si des amas sont visibles, passer les cellules remises en suspension à travers un tamis cellulaire à nouveau.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
NOTE: Les cellules peuvent être utilisées pour l'analyse des flux et viable congelés pour une utilisation ultérieure.
- Isolement des cellules de la moelle osseuse
- Nettoyez et stérilisez mortier et un pilon avec 70% d'éthanol. Placer le fémur et le tibia dans le mortier. Ajouter 5 ml de PBS froid. Utilisez un pilon pour écraser les os jusqu'à ce que le PBS tourne rose clair et ensoleillé.
- Pipeter le fluide à partir du mortier et le filtre à travers un tamis cellulaire 50 uM placée sur un tube conique de 50 ml. Laver mortier avec 5 ml de PBS et répéter cinq fois jusqu'à ce que PBS devient clair.
- Spin cellules vers le bas à 300 xg pendant 7 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de RPMI milieux complets.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
NOTE: Les cellules peuvent être utilisées pour des essais ex vivo, le débit d' analyse et peut être f viable congeléou utiliser plus tard.
- Récolte Spleen, Thymus et de moelle osseuse de la souris humanisée BLT
3. Caractérisation fonctionnelle du gène modifié Cellules
- Infection et suivi de la réplication virale du VIH au fil du temps
- Après confirmation de la reconstitution du système immunitaire humain, injecter la quantité désirée du virus VIH par injection dans la veine rétro-orbitale à l'aide d'une seringue à insuline. Après l'infection à VIH, de recueillir 100 sang périphérique ul via rétro-orbitaire saignement toutes les 2 semaines.
- Récolte plasma en suivant les étapes en partie 2.1.1 - 2.1.2. Pour le dosage de la charge virale VIH, extraire l' ARN viral en utilisant le kit d'extraction d'ARN selon les instructions du fabricant et de mesurer la charge virale par temps réel RT-PCR avec amorce et de sonde ensembles appropriés pour le virus du VIH utilisé 4,8,18,19.
- Pour mesurer l'ARN du VIH de la cellule associée et identifier les cellules qui sont activement infectées par le VIH, d'abord effectuer la lyse RBC suivant les étapes 2.1.2
- suspension de cellules Resuspendre en 1; Ml PBS, diviser uniformément dans deux tubes. Spin à 300 xg pendant 5 min. surnageant Aspirer.
- Afin de mesurer l'ARN associé aux cellules, l'ARN extrait en utilisant le kit d'extraction d'ARN selon les instructions du fabricant et d'effectuer en temps réel, une RT-PCR en utilisant des amorces et des sondes ensembles appropriés.
Remarque: il est important que l'amorce / sonde ne reconnaît pas le lentivirus utilisé pour les cellules souches modifiées - Pour mesurer le VIH des cellules infectées par le flux, remettre les cellules dans l'autre tube dans 50 ul FACS tampon et effectuer la tache de surface avec l'anticorps désiré, comme anti-CD45, anti-CD4 et anti-CD3. Après coloration de surface, fixer et perméabiliser les cellules et les taches intracellulairement pour l'expression de gag en utilisant un anticorps anti-Gag (clone KC57). Effectuer la cytométrie de flux.
- Essai ex vivo de cytokines du gène modifié cellules de splénocytes
- splénocytes Récolte de souris comme décrit dans la section 2.2.2.
- Préparer des cellules cibles. Pour tester la fonctionnalitélité des cellules T CD4 du récepteur de l'antigène chimérique modifié, l'utilisation des cellules infectées par le VIH T1 en tant que cellules cibles. Infect cellules T1 avec le VIH 3 jours avant l'essai de cytokine, confirmer l'infection à VIH par coloration des cellules intracellulairement avec anticorps anti-VIH gag (clone de KC57). Utiliser des cellules non infectées T1 comme cellules cibles de contrôle.
- Co-incubation splénocytes avec des cellules cibles ou de contrôle au rapport 1: 1 nuit. Pour un meilleur résultat, effectuer un titrage (1: 1, 1: 3, 1: 9) d'effecteur (splénocytes) par rapport aux cellules cibles (T1 infectées). Par exemple, resuspendre 0,9 million splénocytes dans 0,25 ml de RPMI milieu complet, ajouter 0,9, 0,3 ou 0,1 million T1 ou non infectées infectées T1 remises en suspension dans 0,25 ml de RPMI milieu complet.
- Le matin suivant, ajouter un inhibiteur de transport de la protéine pendant 6 heures pour inhiber le transport des protéines et d' effectuer la coloration des marqueurs extracellulaires et l' expression intracellulaire des cytokines comme décrit précédemment dans 8.
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Representative Results
La figure 1 montre un schéma de construction de souris BLT humanisés avec une cellule souche modifiée. 10 semaines après l'intervention chirurgicale d'implant, les souris ont été sacrifiées pour évaluer la différenciation et le développement des cellules à gène modifié. Comme on le voit sur la figure 2, de multiples tissus lymphoïdes (sang, la rate, le thymus et la moelle osseuse) ont été récoltées à partir d' une souris qui a été modifié avec CD4ζCAR. Le CD4ζCAR utilisé dans ce protocole contient CD4 récepteur de l' antigène chimère et GFP qui peut être détectée par un anticorps anti-CD4 et de l'expression de la GFP 8. Les cellules ont été isolées et colorées avec un anticorps dirigé contre le CD45 humain, ainsi que l'anticorps anti-CD4 et analysées par cytométrie de flux. GFP et les cellules positives doubles CD4 ont été détectées, ce qui indique la présence de cellules CD4CAR + dans de nombreux tissus lymphoïdes.
Pour étudier la différenciation des cellules du gène modifié, Des splénocytes ont été colorés avec des anticorps contre le CD45 humain (lymphocytes), CD3 (cellules T), CD19 (lymphocytes B), CD14 (monocytes et macrophages) et CD337 (cellules NK). Comme on le voit sur la figure 3, CD4ζCAR cellules souches hématopoïétiques se différencier en lignées multiples.
Afin d'étudier si les cellules modifiées sont CD4CAR fonctionnelle, on co-incubées avec des splénocytes que des cellules cibles des cellules CD4CAR reconnaîtraient (cellules infectées par le VIH T1 ou T1 cellules non infectées, comme témoin). Les cellules ont été co-incubées pendant la nuit et l'inhibiteur de transport de la protéine, on a ajouté pendant une période supplémentaire de 6 heures. Par la suite, les cellules ont été fixées et perméabilisées pour colorer l'expression intracellulaire des cytokines telles que l'IFN-y et TNFa. Comme on le voit sur la figure 4, des cellules exprimant la RCA produites plus grande quantité d'IFN - y et TNFa par des cellules infectées T1.
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Figure 1: Schéma de construction de souris BLT humanisés avec des cellules souches modifiées FT:. Thymus fœtal. FL:. Foie fœtal S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Des cellules modifiées CD4 du récepteur de l' antigène chimère peuvent être détectés dans de nombreux tissus lymphoïdes de souris avec CD4CAR modifié CQH ont été sacrifiés 10 semaines après la chirurgie et de multiples tissus lymphoïdes ont été récoltés et les cellules ont été colorées avec des anticorps de CD4 + CD45 anti-humain et anti-humaines et analysées par cytométrie en flux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:.. Cellules modifiées CD4 des récepteurs d'antigènes chimériques peuvent se différencier en plusieurs lignées splénocytes de souris CD4CAR modifiées ont été récoltées et colorées avec des anticorps contre CD45 humain, CD3, CD19, CD14 et CD337 et analysées par cytométrie en flux S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 4:. Ex vivo cytokine dosage de cellules CD4 + T CAR splénocytes de VIH a infecté des souris CD4CAR ont été stimulées avec des cellules infectées ou non infectées par le VIH T1 et leur production intracellulaire de cytokine est indiqué. S'il vous plaît cliquez ici pour rivaliserwa version plus grande de cette figure.
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Discussion
Avec la RCA et à base HSC immunité ingénierie gagne du terrain vers les études cliniques, il est important d'avoir un modèle animal approprié d'examiner de près la différenciation et la fonction de ces cellules modifiées. Dans ce protocole, nous avons décrit les méthodes pour construire et tester des souris humanisées avec des cellules souches génétiquement modifiées génétiquement contre le VIH. Il est important d'avoir une transduction efficace de cellules souches avant la transplantation. Toutefois, en raison de la capacité des lymphocytes T à proliférer lors de la reconnaissance de cellules cibles, de faibles taux de modification de cellules souches étaient suffisantes pour générer une réponse robuste contre la replication du VIH 8.
Néanmoins, pour atteindre un niveau élevé de modification des cellules souches, nous vous recommandons d' utiliser CD34 + transduites cellules dans le mélange de protéines gélatineuse avec thymus autologue au lieu du foie et des morceaux thymus pour la chirurgie des souris qui avaient été décrites ailleurs 13-15. mélange de protéines est un gélatineux solubilizmembrane basale de tissu ed riche en protéines de la matrice extracellulaire. Dans des conditions physiologiques normales, le mélange protéique gélatineuse polymérisent pour produire une reconstitution, une matrice biologiquement active et stable qui permette la fixation et la différenciation efficace de la cellule souche 20. la reconstitution de cellules humaines peut être vérifiée par un saignement rétro-orbital et cytométrie en flux 6 - 8 semaines après la chirurgie. Faire en sorte que le vecteur ne soit pas toxique pour la survie des cellules souches et le renouvellement, il est recommandé de titrer le vecteur dans les cellules CD34 + avant l'expérience comme décrit dans 1.2.6.
La capacité du modèle de souris NSG-BLT pour soutenir l' infection des muqueuses, virémie cohérente et des réponses immunitaires cellulaires en fait un modèle très utile pour étudier la pathologie immunitaire du VIH et des thérapies à base de cellules pour traiter l' infection à VIH 1. Plus important encore, les cellules T générées à partir des souris NSG-BLT sont choisis dans le tissu thymique autologue, ce qui permet au chercheur d'étudier le sortdes gènes modifiés cellules souches après sélection thymique 8,21. Avec la méthode décrite, nous avons été en mesure d'obtenir 40% -90% reconstitution des cellules immunitaires humaines cohérente. Les faibles niveaux de reconstitution de cellules humaines peuvent résulter de plusieurs facteurs, y compris les compétences de la personne qui effectue la chirurgie et la qualité des tissus pour la transplantation. Pour atteindre un niveau élevé de reconstitution de cellules humaines, il est important d'assurer que les greffes sont solidement placés sous la capsule du rein. En outre, il est fortement recommandé d'examiner chaque implant thymique préparé pour la chirurgie au microscope optique et jeter les morceaux douteux.
Bien que le modèle BLT de la souris humanisée est un outil prometteur pour l' étude de l' immunité d' ingénierie contre le VIH (revue dans 1,15,22), il a ses propres limites. A savoir, ce modèle ne reproduit pas parfaitement le système immunitaire périphérique humain. Des études ont montré altération du développement de l'hyper-muté, Antibo IgG classe commutationdy 1,23. De plus, en utilisant des souris immunodéficientes est techniquement difficile et le maintien de ces souris en bonne santé a besoin de ressources et de formation considérables. infections opportunistes subtiles peuvent se manifester comme des différences significatives entre les échantillons et potentiellement avoir des conséquences négatives sur l'expérimentation. Par conséquent , il est important d'avoir des installations bien préparées et un personnel qualifié pour maintenir l' intégrité de l'avenir 1,24 de données. Avec ces limites à l' esprit, le modèle humanisé de souris NSG-BLT fournit encore un outil important pour l'étude de l' immunité d' ingénierie à base de cellules souches, comme cela est démontré par ces exemples 4,8.
Avec la tendance de développer des récepteurs d'antigènes chimériques basés sur le VIH large des anticorps neutralisants 10 et modification du domaine de signalisation pour la RCA plus efficace 25, ce modèle et le protocole peuvent être utilisés pour caractériser et étudier la fonctionnalité du cel gène modifiéls avec une nouvelle génération de RAC. En outre, ce modèle peut éventuellement tenir compte des études sur la thérapie à base d'immunitaire (tels que le blocage du récepteur d'inhibition) en conjonction avec l'immunité machiné.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 microbead kit | Miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | For freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| Piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| Sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
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