Abstract
Med den hurtige udvikling af stamcelle-baserede genterapier mod HIV, der er presserende behov for en dyremodel til at undersøge hæmatopoietisk differentiering og immunfunktion af de genetisk modificerede celler. Det humaniserede Knoglemarv / Liver / Thymus (BLT) musemodel giver mulighed for fuld rekonstituering af et humant immunsystem i periferien, som omfatter T-celler, B-celler, NK-celler og monocytter. Den humane thymisk implantat giver også mulighed for thymisk udvælgelse af T-celler i autolog thymisk væv. Ud over studiet af HIV-infektion, modellen står som et kraftfuldt værktøj til at studere differentiering, udvikling og funktionaliteten af celler afledt fra hæmatopoietiske stamceller (HSC'er). Her har vi skitsere konstruktionen af humaniseret ikke-obese diabetiske (NOD) -Hårdt kombineret immundefekt (SCID) -Fælles gamma-kæde knockout (c γ - / -) -Bone-marv / Liver / Thymus (NSG-BLT) mus med HSC'er transducerede med CD4 kimært antigen receptor (CD4CAR)lentivirusvektor. Vi viser, at CD4CAR HSC'er succes kan differentiere til flere slægter og har anti-HIV-aktivitet. Målet med undersøgelsen er at demonstrere brugen af NSG-BLT musemodel som en in vivo model for manipuleret immunitet mod HIV. Det er værd at bemærke, at fordi lentivirus og humant væv anvendes, bør udføres eksperimenter og operationer i en klasse II biosikkerhed kabinet i en biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) med særlige forholdsregler (BSL2 +) facilitet.
Introduction
Trods succes kombineret anti-retroviral terapi, HIV-infektion er stadig en livslang sygdom. Det cellulære immunrespons mod HIV spiller meget vigtig rolle i at kontrollere HIV-replikation. Nylige fremskridt i stamceller manipulation har tilladt for den hurtige udvikling af genterapi tilgange til HIV-behandling 1-3. Som følge heraf er det vigtigt at have en ordentlig dyremodel, der tillader in vivo-undersøgelse af effektiviteten af cellebaserede behandlingsformer mod HIV.
Arbejde med HIV i dyremodeller kompliceres af det faktum, at virussen inficerer kun humane celler. For at omgå denne begrænsning, har forskerne tyet til at bruge sygdomsmodeller som Simian Immunodeficiency Virus (SIV) i Rhesus makakaber 4,5. Desværre er der store begrænsninger i denne model på grund af de iboende forskelle på tværs af arter og forskellene mellem SIV og HIV. Derudover kun højt specialiserede faciliteter er capable at støtte arbejdet med primater og hver makak kræver en stor investering. Således er der et presserende behov for en model, der udnytter det humane immunsystem, som er modtagelige for HIV-infektion / patogenese, og er mindre økonomisk prohibitiv.
Den ikke-fede diabetiske (NOD) -Hårdt kombineret immundefekt (SCID) -Fælles gamma kæde knockout (c γ - / -) (eller NSG) Blood / Lever / Thymus (BLT) humaniseret musemodel i stigende grad vist sig at være et vigtigt redskab at studere HIV-infektion. Ved at implantere hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) og føtal thymus, musene kan udvikle og rekapitulere et humant immunsystem 1-3. En type stamcelle baseret genterapi involverer "omdirigere" perifere T-celler til at målrette HIV ved omprogrammering hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) til at differentiere til antigenspecifikke T-celler. Vi har tidligere vist, at tekniske HSC'er med en molekylær klonet anti-HIV-specifik T-celle receptor (TCR) mod SL9 epitop (aminosyre 77-85; SLYNTVATL) af HIV-1 Gag kan omdirigere stamceller til dannelse modne T-celler, der undertrykker HIV-replikation i det humaniserede NSG-BLT musemodel 6. Det forbehold af anvendelse af en molekylær klonet TCR er, at det er begrænset til en specifik human leukocyt antigen (HLA) subtype, der vil begrænse anvendelsen af denne terapi. Kimære antigen-receptorer (CAR), på den anden side, kan anvendes universelt til alle HLA-undertyper. Indledende undersøgelser blev udført under anvendelse af en CAR konstrueret med de ekstracellulære og transmembrane domæner af humant CD4 fusioneret til det intracellulære ζ signalering domæne af CD3 (betegnet CD4ζCAR). CD4ζCAR udtrykt på CD8 T-celler kan genkende HIV envelope og udløse et cytotoksisk T-celle-respons, der svarer til den medieres af en T-cellereceptor 7. Vi har for nylig vist, at humane HSC'er kan modificeres med CD4ζCAR, som derefter kan differentiere til flere hæmatopoietisk lineages, herunder funktionelle T-celler kan undertrykke HIV-replikation i den humaniserede musemodel 8. Med den hurtige fremgang i kimære antigen receptor terapier for cancer 9, og den igangværende karakterisering af potente brede neutraliserende antistoffer mod HIV 10-12, der tillader konstruktionen af enkeltkædet antistof biler, er det opfattes, at mange nye kandidat konstruktioner, foruden CD4ζCAR vil genereres og testes for stamceller baseret genterapi af HIV-sygdomme og andre sygdomme. Desuden kan den humaniseret NSG-BLT musemodel indeholder disse antigen-specifikke CARs også et nyttigt redskab til nøje at undersøge de menneskelige T-celle responser in vivo. Vigtigere er det, vores protokol adskiller sig fra tidligere beskrevne fremgangsmåder til konstruktion af humaniseret af BLT mus 13-15 i at HSC'er i gelatinøse protein blanding anvendes i stedet for føtale lever trunks 16. Denne protokol beskriver: 1) opførelse af humanized BLT mus manipuleret med CD4ζCAR; og 2) karakterisering af differentieringen af de genetisk modificerede celler; og 3) karakterisering af funktionaliteten af de genetisk modificerede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Humant fostervæv blev opnået fra Advanced Biosciences Ressourcer eller fra Novogenix og blev opnået uden at identificere oplysninger og krævede ikke IRB godkendelse til brug. Animal forskning beskrevet i dette manuskript blev udført under den skriftlig godkendelse fra University of California, Los Angeles, og (UCLA) Animal Research Committee (ARC) i henhold til alle føderale, statslige og lokale retningslinjer. Konkret blev disse undersøgelser gennemført under nøje overensstemmelse med retningslinjerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Research Council og akkreditering og retningslinjer af foreningen for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AALAC) International under UCLA ARC Protocol Number 2010-038-02B. Alle operationer blev udført under ketamin / xylazin og isofluran anæstesi og blev gjort alle bestræbelser på at minimere dyr smerte og ubehag.
1. Konstruktion af humaniseret mus Udviklet med CD4 Kimære Antigen receptor
- Forarbejdning Fetal Thymus og isolering CD34 + HSC'er fra føtal lever
- thymus Processing
- Forsigtigt vaske brissel i phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,4, i et 15 ml konisk rør. Gentag vasketrin 3 - 4 gange.
- Tilføj 7 ml RPMI medium + 10% FBS + Pen / strep. Dekanteres alt i en steril 100 mm petriskål.
- Brug skalpeller til at skære brissel i små stykker på ca. 1 mm2. Placer hver eneste thymus stykke i en enkelt brønd på en plade med 96 brønde. Brug buet blunt pincet når der overføres thymus stykker til 96-brønds plade.
- Tilføje en lille mængde af medier (100 - 200 pi) til alle brøndene, således at vævet ikke tørrer. Visualiser under mikroskop (Thymi har lapper og skal se ud sække med celler).
BEMÆRK: Kassér nogen stykker, der ser tvivlsom på nogen måde;der ofte bindevæv og dette bør ikke implanteres.
- Tilføje en lille mængde af medier (100 - 200 pi) til alle brøndene, således at vævet ikke tørrer. Visualiser under mikroskop (Thymi har lapper og skal se ud sække med celler).
- Fjern de bekræftede-thymus stykker og placere dem alle i en T25 cellekultur kolbe. Tilsættes der 7 ml RPMI-medium suppleret med 10% FBS og 450 ug / ml piperacillin / tazobactam og amphotericin B. forsigtigt klippe kolbe blandes. Kultur kolben natten over ved 37 ºC / 5% CO2.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at forhindre bakteriel forurening af vævet. - (Valgfrit trin) Frys thymus til fremtidig brug. Ækvilibrering af klumper i 90% humant AB serum med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) i 10 minutter. Frys dem med en hastighed på 1 ºC / min til -50 ºC, så hurtig afkøling til -150 ºC. Når du er klar til at tø, hurtigt tø i en 37 ºC vandbad og forsigtigt vaske 3x i RPMI komplet medier uden DMSO.
- Lever Processing
- Forsigtigt vaske leveren i PBS i et 50 ml konisk rør. Gentag vasketrin 3 - 4 gange.
- Tilsæt 10 ml (Iscoves Modificeret Dulbeccos Media) IMDM medier til 50 ml konisk rør. Dekanteres alt i en 100 mm steril petriskål.
- Homogenisere levervæv ved brug af to skalpeller. Skær leveren i små stykker på ca. 3 mm 2. Klip og kassér eventuelle hvide bindevæv.
- Brug 10 ml sprøjte forsynet med en 16 gauge stump nål til at optage leveren stykker og medier. Derefter overføre til et 50 ml konisk rør.
- resuspender forsigtigt medierne og væv suspension og udvise 5-7 gange mere at homogenisere vævet helt.
- Fremstilling af 10 ml IMDM medier tilsat enzymer: 500 U / ml collagenase, 2.400 U / ml hyluronidase, og 300 U / ml DNase samt 450 ug / ml piperacillin / tazobactam og amphotericin B. Filter medier via et 0,22 um filter og derefter tilføj medierne til leveren suspensionen.
- Cap de 50 ml koniske rør indeholdende leveren suspension og slutter tæt med selvlukkende film såsom Parafilm to forhindre lækager. Rotere i et rør rotator i inkubatoren ved 37 ºC i 90 minutter.
- Filtrer det fordøjede cellesuspension gennem en 100 um cellefilter i et frisk 50 ml rør.
BEMÆRK: Tilsæt PBS til suspensionen for at bringe det samlede volumen op til 50 ml. Opdele denne i to rør af 50 ml indeholdt hvert 25 ml cellesuspension. - Langsomt og forsigtigt underlag af cellerne i hvert rør med 10 ml densitetscentrifugering medier (f.eks, Ficoll). Spin ved 1200 xg i 20 min uden bremse. Bemærk: al centrifugering er nævnt i denne protokol udføres ved stuetemperatur (25 ºC).
- Fjern forsigtigt grænsefladen (dvs.., Buffy coat) fra hvert rør og overføres til to separate 50 ml rør. Bringe volumenet af hvert rør af grænseflade op til 50 ml med PBS. Spin ved 300 xg i 7 - 10 min. Aspirer supernatanten omhyggeligt.
- Kombiner de to piller. Vask tre gange med 50 ml PBS indeholdende 2% FBS. Spin ved 300 xg i 7 - 10 mi hver gang mens omhyggeligt opsugning af supernatanten.
- Pellet resuspenderes i 50 ml RPMI-medium + 10% FBS. Tæl celler ved hjælp hæmocytometer på dette tidspunkt, før du fortsætter til celle sortering.
- Sorter CD34 + celler straks ved hjælp CD34 sortering Kit (f.eks., CD34 mikroperler), ifølge fabrikantens protokol.
BEMÆRK: Alternativt kan celler dyrkes i RPMI medier + 10% FBS ved 1 million / ml natten over. - Spare både CD34 + og CD34 fraktion.
BEMÆRK: I dette trin kan CD34 + og CD34 celler fryses ved hjælp Bambanker frysning medier eller andre indefrysning medier. Frys 1 ml 4 - 6 x 10 6 CD34 + -celler pr rør og fryse 1 ml 40 - 60 x 10 6 CD34 celler pr rør.
- thymus Processing
- Transduktion af CD34 + -celler
- Beregne antallet af transduktion brønde der kræves af en 6 brønd-vævs-dyrkningsplade. 1 boringen kan anvendes til at transducere op til 8 x 10 6 celler. Tilhver BLT mus, vil 0,5 x 10 6 CD34 + implanteres sammen med CD34-celler og thymus under nyrekapslen og 0,5 x 10 6 CD34 + celler vil blive injiceret intravenøst. Antallet af CD34 + celler til at bruge, er bestemt af antallet af mus (1 million celler per mus).
- Coat den nødvendige antal brønde i en ikke-vævskulturbehandlet 6-brønds plade med 1,25 ml rekombinant human fibronectin opløsning (f.eks., Retronectin) (20 ug / ml i PBS) i hver brønd. Dæk pladen og lad den stå i 2 timer ved stuetemperatur i en ren biosikkerhed kabinet.
- Aspirer fibronectin opløsning fra brønde, og der tilsættes 1,25 ml FACS buffer (PBS med 4% FBS) til hver brønd til blokering. Lad pladen stå ved stuetemperatur (25 ºC) i 30 minutter.
- Aspirer FACS buffer og vask brøndene en gang med PBS.
- Hold PBS i de overtrukne brønde, indtil pladen er klar til brug. Opbevar pladen ved 4 ºC natten, hvis den ikke anvendes straks.
- Plate CD34 + celler i Infektion Medium (2% humant serumalbumin i Yssel 's serumfrit T-Cell Medium) i fibronectin opløsning brønde (~ 2 x 10 6 celler / ml) og inkuberes ved 37 * C i 1 time.
- Brug en pipette til at tilføje lentiviral vektor til brøndene ved en infektionsmultiplicitet (MOI) mellem 2 - 10. forsigtigt blandes og inkuberes natten over ved 37 * C.
BEMÆRK: Titeren af lentivirus anvendte vektor bør fastlægges på forhånd. - Cellerne høstes næste morgen ved forsigtigt at skrabe bundene af brøndene med en celleskraber. Saml celler og tælle med hæmocytometer på dette tidspunkt.
- For at fremstille celler til implantation, kombinere 0,5 x 10 6 transducerede CD34 + -celler med 4,5 x 10 6 CD34 celler per mus, alikvot i sterile 1,5 ml glas med skruelåg. Spin cellerne ned ved 300 x g til pelletering dem, aspirat supernatant. Spin dem igen ved 300 xg og aspirere eventuel resterende supernatant ved anvendelse af et P10 pipette og opsugning meget carefully. Hold tørre pellets på is under hele undersøgelsen. Bemærk: For at sikre cellerne er levedygtige, bruge pelleterede celler og udføre operationen inden 2-3 timer.
- For at forberede celler til injektion, spinde 0,5 x 10 6 transducerede CD34 + celler per mus til pelletering dem, aspirat supernatant. Resuspender celler i 100 pi RPMI medier pr mus og holde på is.
- At kontrollere transduktionseffektivitet, aliquot ~ 1 x 10 5 ikke-transducerede og transducerede CD34 + -celler fra hver betingelse og kultur i 200 pi cytokin medium (RPMI medium med 10% FBS, suppleret med 100 ng / ml humant IL-3, IL-6 SCF) i 96-brønds plade i 5 - 7 dage ved 37 * C.
BEMÆRK: celler, der anvendes i dette trin bruges ikke til kirurgi men at sikre, transduktion er vellykket og vektoren ikke er toksisk for stamcelle overlevelse og fornyelse. Transduktionseffektivitet kan kontrolleres ved at lede efter genekspression af vektoren (f.eks., GFP & CD4) og analysere ved flowcytometri.
- Vævstransplantater Konstruér Genetisk modificerede mus
- Samme dag før operation udføre kroppens samlede bestråling af NOD.Cg- Prkdc SCID Il2rg t m1Wjl / SzJ (NSG) immunsvækkede mus med en cæsium-137 strålerøret og en dosering på 2,7 Gy (270Rad).
BEMÆRK: NSG mus er svært immunkompromitterede. Derfor skal deres bolig og vedligeholdelse i overensstemmelse med den højeste sundhed standard og håndteres af højt uddannet personale. - Hæld thymus stykker og medium fra kolben i en 60 mm skål. Hæld PBS i en anden 60 mm skål, som vil blive brugt til at rense trokar og holde nyrerne våd.
- Chill positive forskydning pipettespidser ved at placere dem i åbne 1,5 ml sterile glas med skruelåg på is. Hold på is med de tørrede cellepellets og gelatinøse protein blanding såsom Matrigel.
BEMÆRK: Det er vigtigt at holde geléagtige protein blandingen og eventuelle rør eller tips, dervil røre det koldt på alle tidspunkter, indtil implantatet nålen er indlæst. - Bedøver mus: Afvej mus individuelt og optage vægte; øre punch mus til at nummerere dem. Injicere dem intraperitonealt med 15 pi ketamin (2,6 mg / ml i saltvand) / xylazin (100 mg / ml i saltvand) pr gram kropsvægt). Sæt musene tilbage i buret og vent til det at være fuldt bedøvet.
BEMÆRK: Kontroller anæstesi niveau af musen ved at klemme en pote. Hvis musen refleksivt flinches, administrere 25-50% af den oprindelige mængde af Ketamin / xylazin at bedøver musen yderligere. Vente, indtil det ikke refleksivt vige til at udføre operationen. - Brug af Oster clipper (shaver), barbere den venstre side af hver mus fra hofte til skulder mellem centrum af ryggen og maven. Subkutant injiceres 0,3 ml af den fortyndede Carprofen (6 mg / kg) i dyrets skulder eller inguinale trekant (ben pit). Ved hjælp af en vatpind, sætte en lille dråbe af kunstige tårerpå hvert øje og lægge musen på siden tilbage i buret.
BEMÆRK: Limit kirurgi prep til et bur (ca. 4. - 5. mus) ad gangen. - Skyl kanylen af 16 gauge kræft implantat nål (trokar) med PBS. Anvendelse af et par stumpe buede pincet, placere et stykke thymus fra 60 mm skål i åbningen af kanylen med trokaren lige inden for åbningen, og derefter trække sig tilbage på trokaren at aspirere vævet ind i kanylen.
- Brug en pipette med positiv fortrængning og en kølet tip at sætte 5 pi kold gelatinøse proteinblanding ind i røret med en tørret cellepellet (CD34 + og CD34- blandingen i implanterede celler) og forsigtigt rør til at generere cellesuspension. Må ikke pipette op og ned. Pipettere den gelatinøse proteinblanding / cellesuspension ind i åbningen af kanylen og langsomt trække sig tilbage på trokaren at indlæse nålen.
BEMÆRK: Det anbefales at have en hjælper til at indlæse pipetten mens man manipulerer implantatet nål. <li> Aftør barberede område af mus med povidon-jod og efterfølgende tørre ned i området med en spritserviet tre gange. Bestem den mørkeste plet under huden. Dette indikerer placeringen af milten. Nyren er ca. 5 mm dorsalt til milten. Løft huden med buede pincet og gøre en 15 mm lang indsnit med kirurgiske sakse i huden parallelt med milten. Så gør en lignende snit i bughinden lag nedenfor. Hos mænd, bør nyrerne er let synlige, og kan ekstruderes ved blot at trykke på maven. Du kan støtte nyren med en hæmostat eller et par buede stumpe pincet. Hos kvinder, æggestokkene tendens til at blokere nyre fra let ekstraktion. Ved hjælp af en hæmostat, afhente æggestokken og forsigtigt eksponere ud nyren.
- Samme dag før operation udføre kroppens samlede bestråling af NOD.Cg- Prkdc SCID Il2rg t m1Wjl / SzJ (NSG) immunsvækkede mus med en cæsium-137 strålerøret og en dosering på 2,7 Gy (270Rad).
- Brug nålen spids pincet til at plukke et lille hul ved den bageste ende af nyrekapslen.
BEMÆRK: Brug ikke disse nål spids pincet til at håndtere farligt biologisk materiale. - Skub implantatetneedle i dette hul og langs nyrerne indtil åbningen af kanylen er helt dækket af nyrekapslen.
- presse forsigtigt vævet under nyrekapslen, og træk nålen ud igen. De thymus stykker kan være klistret så bruge en buet pincet for at sikre thymus stykke ikke kommer ud med nålen.
- Løft bughinden med pincet og bruge forsigtigt arterieklemmen at skubbe nyre tilbage på plads. Bind en dobbelt-knudret sting i bughinden hjælp 4-0 Vicryl absorberbare suturer. Brug to autoclips sår klip til at lukke huden.
- Bland de transducerede CD34 + celler, der blev afsat til injektion og optagelse 100 pi (0.5x10 6 celler) i en insulinsprøjte. Sprøjt disse celler i musen gennem retroorbital vene injektion eller andre former for intravenøs injektion. Ved hjælp af en vatpind, sætte en lille dråbe kunstige tårer på hvert øje og lægge musen på siden tilbage i et bur.
- Når alle mus har been implanteret, bekræfter, at dyrene genvundet bevidstheden og ambulating normalt inden de forlader dem.
- Post-operativ pleje: Dagen efter operationen, subkutant injiceres 0,3 ml fortyndet Carprofen (6 mg / kg) og 1,2 ml sterilt saltvand i hver mus. 2 og 3 dage efter kirurgi, subkutant injiceres 1,5 ml sterilt saltvand i hver mus. Overvåg mus og indsnittene i 10-14 dage efter operationen. Fjern autoclips og vejer musene efter 10-14 dage. BEMÆRK: Mus er træg efter stråling og injektion af saltvand forhindrer dyrene i at blive dehydreret.
- Efter 8 - 10 uger kontrollere indpodning af blødning musene og udførelse FACS-analyse på den perifere blod, farvning for markører, såsom CD45, CD3, CD4, CD8, og eventuelle gener vektoren bør afgive.
2. Karakterisering af Differentiering og Udvikling af Gene modificerede celler
- karakterisering afGene Modified Celler fra perifert blod
- 8 - 10 uger efter transplantation, opnå 50 - 100 pi mus blod fra retro-orbital blødning. Placer i mikrocentrifugerør indeholdende 10 pi EDTA. Centrifuger cellerne ved 350 x g i 3 min. Indsamle plasma. Frys på -80 til ELISA-analyse eller plasma virusmængde assay, hvis musen er HIV-smittede.
- Tilsæt 2 ml NH4Cl (83%) opløsning for at lysere røde blodlegemer. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (25 ºC). Efter inkubering tilsættes 10 ml RPMI 10% FBS at fylde røret. Spin ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten omhyggeligt. Celler er klar til immunfarvning og flowcytometri analyse og andre assays.
BEMÆRK: Markers til forskellige hæmatopoietiske cellelinier, aktivering og fænotypiske markører for naive eller hukommelse celler kan måles hver 2. uge før og efter HIV-infektion ved flowcytometri. Gates er skabt ved farvning af celler med isotypekontroller. Det anbefales at farve healthy menneskelige PBMC'er og bruge det som positiv kontrol. Alternativt kan mus aflives og kan opnås op til 1 ml perifert blod fra hjertepunktur som vil give nok celler til flere paneler af flow-analyse 17.
- Karakterisering af Gene Modified Celler fra Spleen, Thymus og knoglemarv
- Harvest Spleen, Thymus og knoglemarv fra humaniseret BLT Mus
- Aflive mus ved hjælp af overdosis af isofluran. Bekræft eutanasi med sekundær cervikal dislokation. Spray overfladen af slagtekroppen med 70% ethanol til at holde pels klistrer til væv. Pin ned lemmerne på en voks dissektion bakke.
- Brug kirurgiske sakse, skar huden, og derefter skære gennem den peritoneale lag for at blotlægge kropskaviteten.
- Fjern milten ved hjælp af pincet. Fjern thymiske implantat på nyrerne ved hjælp af pincet og saks. Sæt thymus implantat og milt i mærkede rør contalingen 5 ml PBS.
- Fra midten af maven klippe og fjerne huden fra den distale del af musen, der dækker de nedre lemmer.
- Afbrød musklerne fra de nedre ekstremiteter med en saks og omhyggeligt forskyde acetabulum fra hofteleddet. Fjern lårben og skinneben og placere dem i et rør indeholdende 5 ml PBS.
- Isolering af Splenocytter
- Placer en 100 um celle si på en 50 ml konisk rør. Fugt sien med 3 ml RPMI-medium suppleret med 10% FBS og Pen / strep (RPMI komplette medier).
- Placer milten på cellesigte. Brug af gummistemplet af en 10 ml sprøjte, mash milten at dissociere det gennem sien ned i 50 ml rør.
- Skyl cellesigte med 5 ml RPMI komplette medier 4 til 5 gange.
- Spin celler ved 300 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 5 ml røde blodlegemer lysepuffer. Inkuber ved room temperaTURE i 10 min. Der tilsættes 20 ml RPMI komplette medier og centrifugering ved 300 xg i 7 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 10 ml RPMI komplette medier, og filtreres igen gennem en 100 um celle si. Tæl celler under anvendelse af hæmocytometer.
BEMÆRK: Celler kan anvendes til ex vivo-assays, flow analyse og kan levedygtigt fryses til senere brug. Før celletælling, kan trypanblå anvendes til at bestemme antallet af levedygtige celler.
- Isolering af humane thymocyter fra Implant
- Placer thymus i 5 ml PBS i en brønd af en 6 brønd plade. Brug rene stumpe pincet og saks klippe thymus i små stykker.
- Placer en steriliseret rustfri stålnet ligge i brønden. Brug af gummi stempel af en 10 ml sprøjte, mos brissel stykker på rustfrit stål til at bryde fra hinanden thymus.
- Resuspender celler godt og stamme gennem en 100 um cellefilter. Spin celler ved 300 xg i 10 min.Suspendere celler i 10 ml RPMI komplette medier. Hvis klumper er synlige, passerer de resuspenderede-celler gennem en celle si igen.
- Tæl celler under anvendelse af hæmocytometer.
BEMÆRK: Celler kan anvendes til flow-analyse og levedygtigt fryses til senere brug.
- Isolering af Celler fra knoglemarv
- Ren, og der steriliseres morter og støder med 70% ethanol. Placer lårben og skinneben i mørtel. Der tilsættes 5 ml kold PBS. Brug støder til at knuse knogler, indtil PBS bliver lys rosa og overskyet.
- Pipetteres op væsken fra mørtel og filtreres gennem en 50 uM cellefilter placeret på en 50 ml konisk rør. Vask mørtel med 5 ml PBS og gentag fem gange, indtil PBS bliver klar.
- Spin celler ned på 300 xg i 7 min. Aspirer supernatanten og resuspender i 10 ml RPMI komplette medier.
- Tæl celler under anvendelse af hæmocytometer.
BEMÆRK: Celler kan anvendes til ex vivo assays, flow analyse og kan være levedygtigt frosne feller senere brug.
- Harvest Spleen, Thymus og knoglemarv fra humaniseret BLT Mus
3. Funktionel karakterisering af Gene modificerede celler
- HIV-infektion og Overvågning af viral Replication Over Time
- Efter bekræftelse af det humane immunsystem rekonstituering injiceres ønskede mængde HIV-virus via retro-orbital vene injektion under anvendelse af en insulinsprøjte. Efter HIV-infektion, indsamle 100 pi perifert blod via retro-orbital blødning hver 2. uge.
- Harvest plasma ved at følge trinene i del 2.1.1 - 2.1.2. For HIV-virus assay, ekstrakt virus-RNA ved hjælp af RNA-ekstraktion kit ifølge producentens instruktion og måle viral belastning ved real time RT-PCR med passende primer og probe sæt til HIV-virus anvendt 4,8,18,19.
- For at måle celle associeret HIV-RNA og identificere celler, der er aktivt smittet med HIV, først udføre RBC lysis efter trin 2.1.2
- Resuspender cellesuspension i 1; Ml PBS, deler ligeligt i to rør. Spin ved 300 xg i 5 min. Aspirer supernatanten.
- For at måle celleassocieret RNA, ekstrahere RNA ved anvendelse RNA-ekstraktion kit ifølge fabrikantens instruktioner og udfører real-time RT-PCR under anvendelse af passende primer og probesæt.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at primer / probe ikke genkender lentivirus anvendes til modificerede stamcellerne - For at måle HIV-inficerede celler ved flow, resuspender cellerne i det andet rør i 50 pi FACS buffer og udfører overflade pletten med ønskede antistof, såsom anti-CD45, anti-CD4 og anti-CD3. Efter overfladen pletten, fastsætte og permeabilisere celler og pletten intracellulært til gag udtryk ved hjælp anti-Gag-antistof (klon KC57). Udfør flowcytometri.
- Ex Vivo Cytokine Assay af Gene modificerede celler fra Splenocytter
- Harvest splenocytter fra mus som beskrevet i afsnit 2.2.2.
- Forbered målceller. For at teste den funktionelletet af CD4 kimære antigen receptor modificerede T-celler, bruge HIV-inficerede T1 celler som målceller. Inficere T1-celler med HIV 3 dage før cytokin assay, bekræfte HIV-infektion ved farvning af cellerne intracellulært med anti-HIV-gag-antistof (klon KC57). Brug inficerede T1 celler som kontrol målceller.
- Co-inkubere splenocytter med mål- eller kontrolceller ved 1: 1-forhold natten over. For bedste resultat, foretage en titrering (1: 1, 1: 3, 1: 9) af effektor (splenocytter) versus target-celler (inficeret T1s). For eksempel resuspender 0,9 millioner splenocytter i 0,25 ml RPMI komplette medier, tilsæt 0,9, 0,3 eller 0,1 millioner inficeret T1 eller uinficerede t1s resuspenderet i 0,25 ml RPMI komplette medier.
- Den næste morgen, tilføje protein transport inhibitor i 6 timer til at inhibere protein transport og udfør farvning for ekstracellulære markører og intracellulær ekspression af cytokiner som tidligere beskrevet i 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en skitse til konstruktion humaniserede BLT mus med modificeret stamcelle. 10 uger efter implantat kirurgi blev musene aflivet for at evaluere differentiering og udvikling af gen modificerede celler. Som vist i figur 2, blev flere lymfoide væv (blod, milt, thymus og knoglemarv) høstes fra en mus, der blev modificeret med CD4ζCAR. Den CD4ζCAR anvendes i denne protokol indeholder CD4 kimært antigen-receptor og GFP som kan påvises ved hjælp af anti-CD4-antistof og ekspressionen af GFP 8. Celler blev isoleret og farvet med antistof mod human CD45 samt anti-CD4-antistof og analyseret ved flowcytometri. GFP og CD4 dobbelt positive celler blev påvist, hvilket indikerer tilstedeværelsen af CD4CAR + -celler i multiple lymfevæv.
For at undersøge differentieringen af genet modificerede celler, splenocytter blev farvet med antistoffer mod human CD45 (lymfocyt), CD3 (T-celler), CD19 (B-celler), CD14 (monocyt- og makrofager) og CD337 (NK-celler). Som vist i figur 3, CD4ζCAR hæmatopoietiske stamceller differentierer til flere slægter.
For at undersøge, om CD4CAR modificerede celler er funktionelle, vi coinkuberet splenocytter med target-celler, der CD4CAR celler ville genkende (HIV inficerede T1 celler eller inficerede T1 celler som kontrol). Celler blev co-inkuberet natten og proteinet transport inhibitor blev tilsat i yderligere 6 timer. Bagefter blev cellerne fikseret og permeabiliseret til farvning til intracellulær ekspression af cytokiner, såsom IFNy og TNFa. Som vist i figur 4, CAR udtrykker celler produceret større mængde IFNy og TNF med inficerede T1 celler.
belastning / 54048 / 54048fig1.jpg "/>
Figur 1: Oversigt over konstruktionen af humaniseret BLT mus med modificerede stamceller FT:. Fetal thymus. FL:. Føtal lever Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Kan detekteres CD4 kimært antigen receptor modificerede celler i multiple lymfevæv Mus med CD4CAR modificerede HSC'er blev aflivet 10 uger efter operation og multiple lymfevæv blev høstet, og cellerne blev farvet med anti-humant CD45 og anti-humane CD4-antistoffer og analyseret ved flowcytometri. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:.. CD4 kimære antigen receptor modificerede celler kan differentiere i flere slægter Splenocytter fra CD4CAR modificerede mus blev høstet og farvet med antistoffer mod humant CD45, CD3, CD19, CD14 og CD337 og analyseret ved flowcytometri Klik her for at se et større version af denne figur.
Figur 4:. Ex vivo cytokin assay af CD4 CAR + T-celler Splenocytter fra HIV-inficerede CD4CAR mus blev stimuleret med enten HIV inficeret eller ikke-inficerede T1 celler og deres intracellulære produktion af cytokin vises. Klik her for at viewa større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med CAR og HSC-baserede manipuleret immunitet vinder momentum i retning af kliniske studier, er det vigtigt at have en ordentlig dyremodel til nøje at undersøge den differentiering og funktion af disse manipulerede celler. I denne protokol beskrev vi de metoder, til at konstruere og teste humaniseret mus med genetisk modificerede stamceller-celler manipuleret mod HIV. Det er vigtigt at have en effektiv transduktion af stamceller før transplantation. Men på grund af evnen hos T-celle til at proliferere efter genkendelse af målceller, lave niveauer af stamceller modifikation var tilstrækkelig til at frembringe en robust respons mod HIV-replikation 8.
Ikke desto mindre, at opnå en høj grad af stamceller modifikation, anbefaler vi at bruge transducerede CD34 + celler i gelatinøse protein blanding med autolog thymus stedet for lever og thymus bidder for mus operation, der var blevet beskrevet andetsteds 13-15. Gelatinøse protein blanding er en solubilized væv basalmembran rig på ekstracellulære matrixproteiner. Under normale fysiologiske forhold, gelatinøse protein blanding polymerisere til at producere en rekonstitueret, biologisk aktiv og stabil matrix, der ville muliggøre en effektiv tilknytning og differentiering af stamceller 20. Human celle rekonstituering kan kontrolleres ved retro-orbital blødning og flowcytometri 6 - 8 uger efter kirurgi. At sikre, at vektoren ikke er toksisk for stamcelle overlevelse og fornyelse, anbefales det at titrere vektoren i CD34 + -celler inden forsøget som beskrevet i 1.2.6.
Kapaciteten af NSG-BLT musemodel at støtte slimhinde infektion, konsekvent viræmi og cellulære immunreaktioner gør det til en meget nyttig model til at studere hiv immun patologi og cellebaserede behandlingsformer til behandling af HIV-infektion en. Vigtigst, er T-celler genereret fra NSG-BLT mus valgt i autologe thymus væv, gør det muligt for forskeren at studere skæbneaf gen modificeret stamceller efter thymisk udvælgelse 8,21. Med den beskrevne fremgangsmåde, har vi været i stand til at få 40% -90% human immun celle rekonstituering konsekvent. Lave niveauer af human celle rekonstitution kan skyldes flere faktorer, herunder de færdigheder af den, der udfører operationen og kvaliteten af væv til transplantation. For at opnå en høj grad af human celle rekonstitution er det vigtigt at sikre de transplantationer er sikkert placeret under nyrekapslen. Desuden er det stærkt anbefales at undersøge hver thymus implantat forberedt til operation under lysmikroskop og kassere tvivlsomme stykker.
Selv humaniseret BLT mus model er et lovende redskab til at studere manipuleret immunitet mod HIV (revideret i 1,15,22), den har sine egne begrænsninger. Nemlig, går denne model ikke perfekt efterligne et humant perifert immunsystem. Undersøgelser har vist nedsat udvikling af hyper-muteret, klasse-switched IgG Antibody 1,23. Derudover bruger immun-mangel mus er teknisk udfordrende og holde disse mus sund kræver betydelige ressourcer og uddannelse. Subtile opportunistiske infektioner kan manifestere sig som signifikante forskelle på tværs af prøver og potentielt har negative konsekvenser for eksperimenter. Derfor er det vigtigt at have velforberedte faciliteter og behørigt uddannet personale til at opretholde integriteten af den fremtidige data 1,24. Med disse begrænsninger i tankerne, humaniseret NSG-BLT musemodel giver stadig et vigtigt redskab for studiet af stamceller baseret manipuleret immunitet, som det fremgår af disse eksempler 4,8.
Med tendensen til at udvikle kimære antigen receptorer baseret på HIV bred neutraliserende antistoffer 10 og ændring af signalering domæne for mere effektiv CAR 25, kan denne model og protokol anvendes til at karakterisere og undersøge funktionaliteten af genet modificeret cells med en ny generation af biler. Desuden kan denne model potentielt rumme undersøgelser af immun baseret behandling (såsom inhiberende receptor blokade), sammenholdt med konstruerede immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD34 microbead kit | Miltenyi | 130-046-702 | For sorting human CD34+ progenitor cells |
| Bambanker | Wako | 302-14681 | For freezing cells |
| QIAamp Viral RNA kit | Qiagen | 52904 | For measuring viral load in the serum |
| MACSQuant Flow Cytometer | Miltenyi | For flow analysis | |
| BD LSRFortessa™ | BD biosciences | For flow analysis | |
| Hyaluronidase | Sigma | H6254-500MG | For tissue digestion |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002006 | for tissue digestion |
| Collagenase | Life technology | 17104-019 | for tissue digestion |
| CFX Real time PCR detection system | Biorad | For measuring viral load and gene expression | |
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | For culturing cells |
| Piperacillin/tazobactam | Pfizer | Zosyn | Anti-fungal |
| Amphotericin B (Fungizone antimycotic) | Thermo Fisher Scientific | 15290-018 | Anti-fungal |
| Autoclip Wound Clips, 9 mm - 1,000 units | Becton Dickinson | 427631 | For surgery |
| Sterile Poly-Reinforced Aurora Surgical Gowns, 30 per case | Medline | DYNJP2707 | For surgery |
| Sutures, 4-0, vicryl | Owens and Minor | 23000J304H | For surgery |
| Alcohol prep pads | Owens and Minor | 3583006818 | For surgery |
| Gloves, surgical, 6 1/2 | Owens and Minor | 4075711102 | For surgery |
| Yssel’s Serum-Free T-Cell Medium | Gemini Bio-products | 400-102 | For CD34+ cell transduction |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | For CD34+ cell transduction |
References
- Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
- Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2014).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G., Bennett, M., et al. Engineering Antigen-Specific T Cells from Genetically Modified Human Hematopoietic Stem Cells in Immunodeficient Mice. PloS one. 4 (12), e8208 (2009).
- Goulder, P. J. R., Watkins, D. I. HIV and SIV CTL escape: implications for vaccine design. Nature Reviews: Immunology. 4 (8), 630-640 (2004).
- Kitchen, S. G. S., Levin, B. R. B., et al. In vivo suppression of HIV by antigen specific T cells derived from engineered hematopoietic stem cells. PLoS Pathogens. 8 (4), e1002649 (2012).
- Yang, O. O., Tran, A. C., Kalams, S. A., Johnson, R. P., Roberts, M. R., Walker, B. D. Lysis of HIV-1-infected cells and inhibition of viral replication by universal receptor T cells. PNAS. 94 (21), 11478-11483 (1997).
- Zhen, A., Kamata, M., et al. HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer. Annual Review of Medicine. 65 (1), 333-347 (2014).
- Pejchal, R., Doores, K. J., et al. A Potent and Broad Neutralizing Antibody Recognizes and Penetrates the HIV Glycan Shield. Science. 334 (6059), 1097-1103 (2011).
- Caskey, M., Klein, F., et al. Viraemia suppressed in HIV-1-infected humans by broadly neutralizing antibody 3BNC117. Nature. 522 (7557), 487-491 (2015).
- West, A. P., Scharf, L., Scheid, J. F., Klein, F., Bjorkman, P. J., Nussenzweig, M. C. Structural insights on the role of antibodies in HIV-1 vaccine and therapy. Cell. 156 (4), 633-648 (2014).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Melkus, M. W., Estes, J. D., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews: Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
- Vatakis, D. N., Bristol, G. C., et al. Using the BLT humanized mouse as a stem cell based gene therapy tumor model. Journal of visualized experiments : JoVE. (70), e4181 (2012).
- De Rosa, S. C., Brenchley, J. M., Roederer, M. Beyond six colors: a new era in flow cytometry. Nature medicine. 9 (1), 112-117 (2003).
- Shimizu, S., Hong, P., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- Denton, P. W., Olesen, R., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Zhou, J., Zhang, Y., et al. Embryoid bodies formation and differentiation from mouse embryonic stem cells in collagen/Matrigel scaffolds. Journal of Genetics and Genomics. 37 (7), 451-460 (2010).
- Vatakis, D. N., Arumugam, B., Kim, S. G., Bristol, G., Yang, O., Zack, J. A. Introduction of Exogenous T-cell Receptors Into Human Hematopoietic Progenitors Results in Exclusion of Endogenous T-cell Receptor Expression. Molecular Therapy. 21 (5), 1055-1063 (2013).
- Ito, R., Takahashi, T., Katano, I., Ito, M. Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 208-214 (2012).
- Martinez-Torres, F., Nochi, T., Wahl, A., Garcia, J. V., Denton, P. W. Hypogammaglobulinemia in BLT humanized mice--an animal model of primary antibody deficiency. PloS one. 9 (10), e108663 (2014).
- McCune, J. M. Development and applications of the SCID-hu mouse model. Seminars in Immunology. 8 (4), 187-196 (1996).
- Srivastava, S., Riddell, S. R. Engineering CAR-T Cells: Design Concepts. Trends in immunology. 36 (8), (2015).
