Introduction
혈액 - 뇌척수액 장벽 (BCSFB)은 혈액과 뇌 (1) 사이의 세 가지 장벽 사이트 중 하나입니다. 그것의 형태 학적 상관 관계가 맥락막 신경총 (CP) 2,3의 상피 세포이며, 강력하게 혈관과 뇌의 뇌실에 위치하고있는 내피 - 상피 컨볼. 제어 포인트는 뇌척수액 (CSF)를 생산뿐만 아니라 혈액에서 후자를 분리하는 역할을한다. 장벽 기능을 달성하기 위해, CP 상피 세포는 낮은 pinocytotic 활성을 나타내는 특정 전송기를 표현하고 조밀 기밀 접합 (TJS) 2,3-의 연속적인 네트워크에 의해 접속되어있다.
일본인 여성 4 악성 맥락막 신경총 유두종 유래의 인간 맥락막 신경총 유두종 (HIBCPP) 세포의 BCSFB의 시험 관내 모델의 기능을 구성하는 데 사용 하였다. HIBCPP 세포는 TJ의 형성 등의 기능 BCSFB의 특성 몇 가지를 보여스트랜드 transepithelial 전기 저항 (티이)로 판정 할 수있는 높은 transepithelial 막전위의 개발 및 거대 분자를위한 작은 투과성. 또한, HIBCPP 세포는 이온 성 미세 환경을 조절하는 역할을하고, 기저 / 혀끝 극성 5,6,7를 표시 할 수 있습니다 특성 수송을 표현한다.
BCSFB는 중추 신경계 (CNS)에 8 병원균 (박테리아, 바이러스, 진균)에 대한 엔트리 사이트로서 기능하는 것으로 나타났다. 나이 세리아 뇌수막염 (N. 뇌수막염), 그람 음성 박테리아를 포함하여 병원균의 침입은 뇌막염과 같은 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 는 CP의 보호 상피 장벽을 극복 증거가 수막 구균 성 질환은 혈관과 CP 상피 세포 9, 10에서 수막 구균의 증가 금액을 나타내는 환자에서 조직 병리학 적 관찰에 의해 지원됩니다. 숙주 세포 바로 항목을 얻으려면cteria들은 중재 또는 숙주 세포에있는 특정 표면 수용체에 의해 트리거되는 endocytotic 메커니즘을 하이재킹. 이들 수용체와 병원체의 상호 작용이 종 수 있기 때문에 특정 (11) 동물 모델은 제한된 범위로 참고 될 수있다. HIBCPP 세포주 침입 프로세스뿐만 아니라 인간의 모델 시스템에서 기본이되는 분자 기전을 연구 할 수있는 기회를 제공한다. 세포 배양 삽입을 사용하는 두 가지 세포 측면에서 숙주 세포로 병원균의 상호 작용을 분석하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 많은 박테리아를 포함 N. 뇌수막염은 감염 분석하는 동안 중력의 영향을 강하게 될 수 있습니다. 분석법 중 HIBCPP 세포와 병원체의 최적의 상호 작용의 경우, 초기 박테리아는 세포 배양 필터 삽입 시스템의 상부 구획에 첨가 하였다. 각각 체외 시스템의 두 가지 변화가 있었다 ESTA 꼭대기 또는 기저 세포 측에서 감염을 사용하려면blished : 표준 시스템에서 HIBCPP 세포 미생물이 CSF 측에 위치하며 셀 (도 1a, C)의 꼭대기면 접촉에 들어갈 때의 상황을 모방 필터 인서트의 상부 구획으로 시딩 하였다. 반면, 반전 된 세포 배양 필터 인서트 시스템에서 HIBCPP 세포를 사용하여 세균이 혈류를 입력 한 상황을 반영한다. 미생물은 기저 측 (그림 1B, D)에서 혈액과 만남 CP 상피 세포에 전파. 주목할이 모델 시스템에서 세균이 기저 세포 측면에서 특히 5,7- 극성 방식 HIBCPP 세포에 침입하는 것이 밝혀졌다.
이어서 CP의 감염의 병원체가 침입 패턴 - 인식 수용체를 통해 결찰 선천 면역 (PRRS)에 의해 인식 될 수있다. PRRS의 잘 설명 된 회원은 수신자 같은 수용체 (TLR) 가족에 속한다. TLR들 수 빈라고 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 있습니다 감염성 미생물의 특성 구조에 라. 수용체의 결찰 차례로 BCSFB 13,14 걸쳐 윤회 면역 세포를 자극 사이토 카인 및 케모카인 (12)의 발현을 유발 숙주 세포의 활성화 시그널링 캐스케이드로 이끈다. HIBCPP 세포가 여러 가지의 mRNA 수준에서 TLR들과 N.와 그 감염을 표현하는 것으로 밝혀졌다 뇌수막염은 CXCL1-3, IL6, IL8 및 TNFα (15, 16)를 포함한 여러 사이토 카인과 케모카인의 분비를 초래한다.
여기에서는 BCSFB 모방 반전 세포 배양 삽입 시스템에서 배양하고, 인간 세포주 HIBCPP 감염을 설명한다. 이 모델 시스템은 생체 관련 기저 세포 측면뿐만 아니라, 이후 세포 반응과 병원균의 상호 작용을 연구 할 수있다.
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Protocol
1. 거꾸로 모델 시스템에서 시드 HIBCPP 세포에 대한 세포 배양 필터 삽입을 준비
- 5 μg의 / ㎖ 인슐린 보충 전 따뜻한 DMEM / F12 (HAM), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 10 % 소 태아 혈청 (FCS).
- 거꾸로 12 웰 플레이트 (도 1E)로 3 ㎛의 공극 크기 0.33 cm² 성장 영역 세포 배양 필터 삽입 배치 무균 핀셋을 사용한다.
- 세포 배양 필터 인서트의 하부 구획실 (약 3 mL) 및 필터 인서트의 상부에 100 ㎕의 배지를 채운다. 플레이트뿐만 아니라 매체와 낮은 구획 홍수. 필터 인서트의 하부 구획 (도 1E)를 충전 상태로 유지하는 방식으로 과도한 매체 기음.
참고 :이 단계에 대한 혈청 학적 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. - , 뚜껑을 12 웰 플레이트를 커버하고 인큐베이터에 준비된 세포 배양 필터 삽입을 전송 37 ° C,세포에 첨가 할 때까지 5 % CO 2.
2. 재배 및 HIBCPP 세포의과 Passaging
- 5 μg의 / ㎖, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 10 % FCS로 보충 된 DMEM / F12 (HAM)을 준비한다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 매체와 PBS. 플라스크에서 대기음 매체. 플라스크 및 소용돌이에 10 ml의 PBS를 추가합니다. 일단이 단계를 반복합니다.
- 플라스크 및 소용돌이에 3 ㎖ 0.25 % 트립신 EDTA를 추가합니다. , 인큐베이터에 37 ° C, 5 % CO 2를 놓습니다.
- 약 20 분 후 인큐베이터에서 플라스크를 제거합니다. 세포가 플라스크의 바닥에서 분리되어 있는지 확인하고 현미경으로 조사 때 둥근 모양을 표시합니다.
주 : 세포가 서로 완전히 분리되지 않고 자주 덩어리에서 발견된다. 통로 (38)까지 세포를 사용하는 것이 좋습니다. - 17 ml의 매체를 추가 트립신 중지하십시오. 아래로 pipetting에 의해 세포를 재현 탁하고, 현탁액을 전송50 ML 튜브로. 실온에서 10 분 동안 50 XG 원심 분리기.
- 매체의 적절한 부피의 세포를 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포 수를 계산.
주 : 현탁 HIBCPP 세포의 농도가 1 × 106 세포 / ml이어야한다. HIBCPP 세포의 유지 대에는 T75 플라스크에 10 ml의 배지에 1-6 × 106 세포의 양을 전송하기 위해 제안된다. 모든 둘째 날 매체 변경합니다.
HIBCPP 세포 3. 시드 반전 세포 배양 필터 삽입
- (필터의 바닥면 예) 각 반전 필터 인서트의 위에 세포 현탁액 (예. 8 × 10 4 세포) (그림 1E)의 80 μl를 추가합니다.
참고 : 세포가 균일하게 파종하기 전에 튜브를 반전 현탁액에 분산되어 있는지 확인합니다. - 인큐베이터에 12 웰 플레이트 및 전송의 뚜껑, 37 ° C, 5 % C와 시드 - 세포 배양 필터 삽입을 커버O 2.
- 첫날, 24 웰 플레이트의 우물에 1 ml의 매체를 입력합니다. 12 웰 플레이트에서 집게를 사용하여 세포 배양 필터 삽입을 들어 올리고, 내부 매체를 폐기 필터 삽입을 켜고 준비 24 웰 플레이트 (그림 1E)에 표준 방향으로 배치합니다.
- 모든 둘째 날 새로운 배지로 세포를 놓습니다. 신선한 매체와 24 우물을 준비하고 여기에 필터 삽입을 전송합니다. 0.5 ml의 신선한 매체와 삽입을 입력합니다. 4 절에 설명 된대로 매일 봉사자를 확인합니다.
- 세포 배양 인서트에 HIBCPP 시드 셀들 티이 값을 초과 할 경우 70 Ω X cm² (약 사일 파종 후) 다음, 1 % FCS, 5 μg의 / ㎖ 인슐린을 포함하는 배지에서 세포 배양을 계속한다. 물론 각 1 ml의 배지로 24 웰 플레이트를 준비합니다. 상단 구획에 제조 된 우물과 교환 매체로 필터 삽입을 전송합니다.
참고 : 컨 플루 후이 혈청 철수의 형성을 유도높은 막전위. - 필터 실에서 대기음 매체는 잘 준비에 전송하고 500 ㎕의 매체를 입력합니다. 일단이 단계를 반복합니다. , 인큐베이터에 하룻밤 37 ° C, 5 % CO 2 세포를 넣습니다.
Transepithelial 전기 저항 4. 측정 (봉사자)
- 80 % 에탄올에 15 분 동안 상피 조직 voltohmmeter의 전극의 끝 부분을 담가. 후드 voltohmmeter를 전송하고 잠시 전극 건조를 할 수 있습니다. 평형 또 다른 15 분 동안 세포에 사용되는 각각의 배지에 전극을 배치합니다.
- 필터 삽입 실에 짧은 아암을 배치가 하부 구획의 바닥 매번 접촉되도록 상기 전극의 긴 아암을 배치하여 측정을 수행한다.
참고 : 세포 배양 필터 삽입의 저항 값을 배지에서 세포없이이 빈 값을 사용해야합니다 ((측정 값 (Ω) - 빈 값 (Ω)) × 필터표면 (즉, 0.33 cm²)). - 15 분 동안 80 % 에탄올로 전극 제자리를 측정 한 후. 건조 튜브에 저장합니다.
Paracellular 투수 5. 결정
- 5 μg의 / ㎖ 인슐린을 1 % FCS로 보충 된 200 ㎖의 배지에서 1g FITC-이눌린을 녹인다. 세포의 감염 전에 상부 필터 구획에 용액 50 μg의 / ㎖을 적용합니다.
- 감염 후 많은 이눌린은 셀 층을 통해 필터 실에서 전달 방법을 결정하기 위해 낮은 우물에서 매체 샘플을 수집합니다.
- FITC-이눌린 표준 용액을 조제하고 1 수행 2 희석액, 10 배 (100 %, 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 %, 3.13 %, 1.56 %, 0.78 %, 0.39 %, 0.2 % 및 0 %) . 마이크로 플레이트 리더의 모든 시료의 측정에 의해 형광을 결정합니다.
세포 배양 필터 삽입에 HIBCPP 세포의 감염에 대한 박테리아의 6. 준비
- 실험에 어느 날 이전에, 스크랩 t그는 냉동 N. 뇌수막염은 Vitox 초콜릿 한천에 글리세롤 주식과 행진을 해제 균주. 5 % CO 2, 37 ° C에서 인큐베이터에서 하룻밤 성장.
- 하룻밤 문화에서 20-30 식민지를 추출하고 0.042 %의 NaHCO3, 0.01 M의 MgCl 2, 1 % Polyvitex 보충 8 ml의 Proteose 펩톤 매체를 포함하는 튜브에 전송합니다.
- 220 rpm으로 37 ℃에서 1.25 시간 동안 세균을 흔들어. 실온에서 10 분 동안 2,684g에서 원심 분리하여 균체 펠릿. 뜨는을 취소하고 8 ML의 무 혈청 배지와 세균 펠렛을 재현 탁. 소용돌이는 더욱 서스펜션을 보장합니다.
- 배양 밀도를 결정하기 위해, 600 nm 인 광학 밀도 (OD)로 1:10 희석도를 측정한다. OD 0.1 600 세균 현탁액을 조정합니다.
참고 :이 서스펜션이 약이 포함되어 있습니다. 1 × 10 8 CFU / ㎖. - 박테리아 세포 농도를 확인하기 위해, 최대 서스펜션 단계적 (1:10) 희석초콜릿 한천 플레이트 상에 10-5의 희석과 접시.
주의 : 유사한 연속 희석 세균 성장 곡선을 계산하기 위해 수행 될 필요가있다.
이중 면역 형광에 의한 세균 침략의 세포 배양 필터 삽입 및 결정에 HIBCPP 세포의 7 감염
- 1 % FCS, 5 μg의 / ㎖ 인슐린을 포함하는 배지에서 세포 배양을 계속 한 후, 상피 조직 voltohmmeter를 사용하여 매일 세포를 측정한다. 세포가 약 500 Ω X cm²의 봉사자에 도달 한 경우, 감염을 수행한다.
- 시간의 지정된 기간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 점 감염 인큐베이터에 감염된 세포 (MOI)의 다수의 세균 현탁액을 제조로 세포를 감염.
주 : MOI가 합류 (1.21 × 106 세포 / ㎠)에서 계정에 세포 배양 필터 인서트 당 세포의 수를 고려하여 계산 될 수있다. - 감염되고 중지1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 500 μL의 혈청 배지로 3 회 (SFM)을 세정 이온 하부 구획 필터 구획에 1 ml에 적용 하였다.
- 500 μL의 SFM 필터 실에 1 % BSA 버퍼를 포함하고 비특이적 결합 부위에 대한 항체의 부착을 방지하기 위해 실온에서 20 분 동안 상기 하부 구획의 1 ml의 차단.
- 100 ㎕를 일차 항체 항 N.으로 품어 필터 구획하고 실온에서 20 분 동안 상기 하부 구획의 500 μL : meningtidis α-OMP (200 1).
주 : 필요한 경우, 항체 농도가 적정 될 필요가있다. - 필터 실로부터 매체를 흡입하여 세포를 세척, 1 % BSA를 함유하는 제조도 1 ML의 SFM에 필터 인서트를 전송하고, 1 % BSA를 함유하는 500 μL의 SFM과 비운 필터 실을 채운다. 두 번이 단계를 반복합니다.
- 필터 안돼요을 500 ㎕의 4 % 포름 알데히드로 세포를 고정rtment 실온에서 10 분 동안 하부 구획 한 용액.
- 필터 실에서 매체를 흡입하여 세포를 씻으, 한 ML PBS와 준비를 잘하여 필터 삽입을 전송하고 500 ㎕의 PBS로 비워 필터 구획을 입력합니다. 일단이 단계를 반복합니다.
참고 : 샘플 4 ° C에서 PBS에 밤새 저장할 수 있습니다. - 컷 고정 된 세포 배양은 삽입의 필터링 250 ㎕의 PBS가 1 % BSA를 함유 씻는다. 세포 외 박테리아를 얼룩 : 라벨 250 μl의 형광 (여기 파장 594 nm의) 차 항체 닭 반 토끼 (500 일)와 실온에서 15 분 동안 세포를 품어.
주 : 필요한 경우, 항체 농도가 적정 될 필요가있다. - PBS 250 ㎕를 실온에서 1 시간 동안 1 % BSA 및 0.5 % 트리톤 X-100가 함유 된 세포 Permeabilize 하시려면. 250 ㎕의 PBS가 1 % BSA를 함유하는 세포를 세 번 씻는다.
- 250 μL 차 항체 항 N.으로 품어 뇌수막염
- 형광 표지 (여기 파장 660 ㎚) Phalloidin의 (1 : 250) 및 4'- 나프티 diamidino -2- 페닐 인돌 염산염 (DAPI () : 형광 표지 (여기 파장 488 ㎚) 이차 항체 (500 (1)) 250 μL를 적용 1 : 50,000) 실온에서 1 시간 동안 역외 및 세포 내 박테리아, 액틴 세포 골격과 핵을 염색합니다.
주 : 필요한 경우, 항체 농도가 적정 될 필요가있다. - 250 ㎕의 PBS가 1 % BSA를 함유하는 세포를 세 번 씻는다. 현미경을 통해 검사까지 4 ° C에서 매체 및 저장을 장착의 셀을 포함.
- 미리 정의 된 필드 당 침입 박테리아의 수를 결정합니다. 필터 멤브레인 당 20 필드를 계산하여이 작업을 수행합니다. 침입 세균의 비율을 계산한다.
참고 : 지역 코픽으로 20 현미경 분야의 평균 세균 수를 곱하면ient. 결과는 0.33 cm² 세포 배양 필터 인서트 본 총 박테리아의 양을 나타낸다. 감염 기간 동안 배지에서 자란 균의 양이이 값을 나눈다.
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Representative Results
여기에서 우리는 역 세포 배양 삽입 시스템에서 배양 및 HIBCPP 세포의 감염을 설명합니다. 이 모델은 우리가 (도 1)을 전파하고, 혈류를 통하여 상피 세포에 진입 박테리아의 생리 학적 상태를 재생 상기 기저 셀 측으로부터 침입 메커니즘 기본 분자 신호 경로를 연구 할 수있다.
HIBCPP 셀 최소 레벨에 대한 분자 교환을 제한 할 수 있도록 소정의 배리어 기능을 표시. 이것은 adherens 접합 (AJ) 꽉 접합 (TJ) 단백질의 발현에 의해 달성된다. TJ 관련 단백질 occludin은, 클라우딘 및 ZO-1의 면역 형광 분석은 세포 TJS의 연속 가닥 (그림 2A, B, C)에 의해 서로 연결되어 있음을 입증, 세포 - 세포 접촉의 사이트에 중단없이 신호를 한 것으로 밝혀졌습니다. t의 상세한 인상그 TJ 형태는 송신 (도 2D)에 의해 얻어진 TJS은 셀 사이에 넓은, 케이블 메쉬 형 구조를 형성하는 것을 보여준다 골절 전자 현미경 (도 2e)을 고정하고있다.
상피 세포의 TJS는 따라서 세포 극성에 기여하고, 혀끝과 기저 막 도메인을 분리하는 울타리 역할을합니다. HIBCPP 세포의 기저 셀측 독점적 발현되는 단백질 중에서도 가리키는 상기 AJ 단백질 E 헤린 (ECAD)도 3에서 면역 형광 분석에 의해 도시 된 바와 같이, 간세포 성장 인자 수용체 (HGF / 메트)이다 극성의 특정 수준.
적절한 조건 하에서 배양시 세포 HIBCPP도 막 전위의 형성과 같은 BCSFB 전형적인 배리어 기능뿐만 아니라 macromole에 대해 낮은 투과성을 나타낼cules. 막 전위의 측정은 voltohmmeter 사용하여 티이 측정함으로써 달성 될 수있다. 셀 층의 투과성은 FITC 표지 이눌린하는 paracellular 방식으로 층을 통과 당인가에 의해 정량화된다. 여기, 우리는 이러한 장벽 기능을 안정적으로 유지 및 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 세포 자극 화학 물질에 대한 공통 용매의 표준 농도로 더 애정을 보여 없다는 것을 보여주는 대표적인 실험의 결과를 보여줍니다. 도 4a에서 알 수있는 바와 같이, 티이 값 전과 DMSO에 HIBCPP 세포 노출 후 기록되었다.
세포는 모든 조건은 실험의 시작에서 약 500 Ω X cm²까지 도달 높은 막 전위를 표시. 측정 된 봉사자는 0.2 부피 % DMSO까지 처리 한 세포 2 시간 후 변경되지 않았습니다. 반대로, 티이 값을 용량 의존적 방식으로 감소 WH높은 볼륨 적용된 도중 (도 4A). 막 전위의 감소는 거대 분자에 대한 증가 된 투과성에 수반이었다. 최대 0.5 부피 %의 이눌린에 대한 투과성의 증가를 초래하지 않았다 HIBCPP 세포에 DMSO를 첨가하는 반면, 1 부피 %와 2 부피 %는 비록 제한된 범위 (도 4b)에, 효과를 표시. 또한, 우리는 HIBCPP 세포의 막전위 및 투자율의 사이토 칼라 신 D 액틴 중합 강력한 억제제의 영향을 조사했다. 1 μg의 / ㎖의 사이토 칼라 신 D와 세포의 치료는 티이 값의 상당한 감소뿐만 아니라 FITC-이눌린 자속의 증가 원인 (도 4a를 B). 이 효과는 사이토 칼라 D. 의한 TJS의 개구에 의해 설명 될 수있다
BCSFB의 모델로 HIBCPP 세포주 병원균 작용 및 배리어 형성 상피 세포를 연구하는데 이용 될 수있다. 증거가있다박테리아 N. 그 뇌수막염은 BCSFB을 교차하여 CNS에 항목을 얻는다. 나이 세리아는 생체 내에서 관련되는 기저 세포 측면에서 구체적 HIBCPP 세포에 침입하는 것이 밝혀졌다. 이 과정에서 세균 캡슐은 중요한 역할을한다 : 캡슐-부족 돌연변이 HIBCPP 세포 5에 침략을 증가 보여줍니다. 다음에 우리가 MC58 균주 (17)의 기저 침공을 비교, 자사의 동종 돌연변이 MC58siaD - 캡슐 생산 (17)와 캡슐화 캐리어 결핍은 α14 (19, 20)을 격리 할 것. 사소한 침략 속도합니다 (비병원성 α14 변형 관찰되었다 반면, - HIBCPP 세포 (10) 면역 형광 분석의 MOI에서 4 시간의 시간 과정을 통해 위에서 언급 한 균주에 감염 된 두 병원성 균주 MC58와 MC58siaD 상당한 침해를 밝혀 도 5A). 이중 immunoflu의 대표 이미지각각의 균주에 감염된 세포의 HIBCPP orescence 현미경은도 5A, B 및 C에 도시되어있다.
그림 1. 표준 및 반전 세포 배양 시스템 CP 상피 세포 세균의 표준 세포 배양 시스템에서, (A, C)의 상호 작용은 미세 융모로 표시된다 혀끝 셀 측에 조사 할 수있다. 반전 세포 배양 시스템 (B, D)은 우리가 CNS에 혈류를 통해 세균 침입시에 포함되는 기저 세포막을 가진 세균의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 반전 세포 배양 (E) HIBCPP 세포 필터 인서트의 바닥면 상에 시딩 하였다. 필터 삽입의 내부 구획을 포함하는 하부 아니라 중간이 쇄도하고 있습니다. Subsequ고한다면, 과도한 중간 필터 인서트의 내부 격실은 충전 상태를 유지하는 방식으로 흡입된다. 파종 후 첫 날, 세포 배양 필터 삽입을 통해 이성을 상실하고 매체 가득합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. HIBCPP 세포 TJS 연속 스트랜드 표시 ZO-1 (A)는, occludin은 (B) 및 클라우딘-1 (C)는 HIBCPP 세포에서 검출 하였다 TJ 단백질. 패널 AC는 Apotome 이미지를 보여줍니다. 각 패널의 센터 : 세포의 얼굴보기 엔 XY; 상단과 오른쪽 : Z 축 -plane를 통해 여러 광학 조각의 단면. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. HIBCPP 세포의 TJ 구조 transmis로 분석시온 전자 현미경. 세포 간 접속되어 화살표 (D)로 표시되는 TJS 의해. 스케일 바는 1 ㎛를 나타냅니다. 골절 전자 현미경 연구를 면밀히 시각화 (E) TJ 스트랜드를 맞물려 고정. 스케일 바는 0.5 μm의 =. . e30069, 도이 :이 그림의 이미지는 원래 Schwerk 등, PLoS의 한 7 발표되었다 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); 재 인쇄 권한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 기저 외측 세포 측에서 ECAD (A)와 메트로 (B)의 HIBCPP 세포 면역 형광 분석 표시 식 박테리아의 침략 동안 참여 수용체 단백질의 발현. 의 picturES는 Apotome 이미지를 보여줍니다. 각 패널의 센터 : 세포의 얼굴보기 엔 XY; 상단과 오른쪽 : Z 축 -plane를 통해 여러 광학 조각의 단면. (화살표로 표시) HIBCPP 세포의 정단 막을 상부의 상단으로뿐만 아니라, 각 프레임의 각각 우측의 오른쪽을 향해 배치된다. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 그림의 데이터는 Gründler 등 이전에 발표 된, 미생물이 감염 15 : 291-301, 도이 :.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); 재 인쇄 권한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : HIBCPP 세포의 장벽 기능에 DMSO와 사이토 칼라 D의 영향 장벽 FUNC에 미치는 영향.기는 봉사자 값과 FITC - 이눌린 - 플럭스의 측정에 의해 결정된다. 결과는 삼중으로 수행 된 하나의 대표 실험에 대해 표시됩니다. HIBCPP 세포는 2 시간 동안 표시된 양의 DMSO뿐만 아니라 Cytochlalasin D로 처리 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
0.2 부피 % 이하의 농도로 적용시, DMSO는 막 전위 (도 4A)에 영향을 미치지 않는다. 0.1 부피 %까지의 DMSO 0.5 부피 % 범위의 농도는 세포 (도 4b)의 paracellular 투과성에 영향을 미치지 않는다. 대조적으로, 1 μg의 / ㎖의 사이토 칼라 신 D의 세포층을 통한 FITC-이눌린 자속의 증가에 수반 봉사자 감소의 원인 (도 4a를 B).
그림 5 : N.의 침략 HIBCPP 세포로 뇌수막염. 이중 면역 형광 현미경 방송 침입 (녹색), 부착 (노란색) 박테리아. 이미지 내에서 흰색 상자 오른쪽에있는 확대 사진 세부 사항을 나타냅니다. 기저 침공은 N. 관찰되었다 수막 구균 균주 MC58 (A) 및 MC58siaD - 캡슐 제조 (B)을위한 결손 단지 소량 침입 속도가 α14 (C)에 대해 결정되었다 반면. 그림은 MC58와 MC58siaD의 침공 율이 있음을 보여줍니다 - α14에 비해 매우 중요하다 (**, P <0.01). MC58 또는 MC58siaD이 때 극단적 인 의미가 표시됩니다 - 각각 α14 비교 하였다 (***, P <0.001) MC58siaD - MC58에 비교 하였다 (###, p <0.001). 규모는 indica의 바테 10 μm의. . D의 다이어그램은 원래 보르 코브 스키에 발표 된 외, J 신경 염증 11 : 163, 도이 : 10.1186 / s12974-014-0163-X (2014); 재 인쇄 권한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제어 포인트의 상피 세포는 혈액 2,3-에서 CSF를 분리 BCSFB을 형성한다. 우리는 최근 BCSFB의 기능적 인간 모델로 HIBCPP 세포주를 확립. 세포는 높은 막 전위의 개발 고분자에 대해 낮은 투과성뿐만 아니라 TJS 5 연속 스트랜드의 존재를 포함하여 시험 관내 BCSFB 중요한 장벽 기능을 표시. TJ 단백질은 세포의 기저 / 혀끝 극성에 기여한다. 극성 표면 수용체에 관한 지역화 높은 중요성뿐만 아니라 특정 수송 체 단백질이다. 우리는 CNS 6,7 내에서 높은 제어 미세 환경을 유지하는 ATP 바인딩 카세트의 수용체 ECAD와 만난뿐만 아니라 회원 (ABC) 트랜스 포터 가족의 극성 현지화를 보여 주었다.
BCSFB을 극복하여 CNS에 항목을 얻을 수있는 여러 가지 미생물 지도자로있다수막염 (8)을 포함한 중증 질병에 g. CP 상피 세포에 침입 할 수있는 병원체의 하나는 인간의 특정 그람 - 음성 박테리아 인 N. 기저 외측 셀 사이드 (5)에서 특히 극성 방식으로 HIBCPP 세포를 입력하는 것으로 나타났다 뇌수막염 9, 10,. 박테리아 뇌막염 도중에 혈액으로부터 보급과 만남 CP 상피 세포 때의 BCSFB 전체 뇌 감염 생리 학적 관련성 방향이다. 시험관 내에서 이러한 상황을 반영하여, HIBCPP 세포 필터의 하측에 성장된다. 셀이 상부 구획으로 시딩 표준 필터 인서트 모델과는 달리 반전 배양 시스템이 셋업은 기저 셀측 5,21에서 특히 상피 세포를 감염시킬 수있다.
HIBCPP 기저 세포로 침윤 두 병원성 N. 관찰 한 뇌수막염 - 비 병원성 캐리어 분리하는 반면, α14는 한계 침공 (15)을 표시. 이것은 HIBCPP 셀 모델이 침입 과정과 관련된 신규 병원성 인자 가능한 돌연변이 라이브러리를 검색 할 수있는 가능성을 제공한다는 것을 나타낸다. 주목할만한, 그것은 L. 포함한 다른 병원균 입증되었다 모노 사이토과 연쇄상 구균 SUIS (S.의 SUIS)는 극성 패션 5,7에 HIBCPP 세포를 침공.
인식하고 CNS로 미생물 침입에 대응하기 위해, CP의 상피 세포는 PRRS 22,23 표현한다. TLR에는 PRRS 내에서 중요한 가족을 나타냅니다. 정량적 RT-PCR은 HIBCPP 세포가 여러 TLR들과 관련 코 - 수용체와 어댑터 분자에서 MyD88 15 발현 시연 분석한다. 이 수용체 TLR2와 TLR4는 N.에 세포 방어 반응에 관여하는 것으로 관찰되었다 meningitidis 캡슐 다당류 24. 마이크로 어레이 방법의 또 다른 결과는 HIBCPP 세포 N. 감염된 것으로 나타났다 또한, 전사 조절에 관련된 다른 요인 (25), (26), 프로 - 염증성 사이토 카인 IL6 비롯한 특정 표적 유전자의 발현을 15 필수 IκBζ 사이 뇌수막염는 신호 전달 경로의 유도를 표시.
이러한 결과를 확인하려면 HIBCPP 세포는 N.에 감염 반전 배양 시스템에서의 뇌수막염는 사이토 카인 및 케모카인의 방출을 연구하기 위해 사용되었다. 이는이 프로세스는 선천성 면역계 (13, 14)의 활성화에 의한 염증 반응을 조장하는 것을 목표로하는 것으로 알려져있다. HIBCPP 세포 생산 및 호중구와 단핵구 (27)을 유치하기 위해 기술되었다 CXCL1-3, IL6, IL8 및 TNFα (15, 16)를 포함하여 사이토 카인과 케모카인을 분비한다. 우리의 모델 시스템을 사용함으로써, 우리polymorphnuclear 호중구, 단핵구와는 T 림프구가 HIBCPP 세포가 면역 세포의 transepithelial 마이그레이션의 메커니즘을 해독에 적합한 것을 강조 HIBCPP 세포 16, 28을 통해 마이그레이션 것으로 나타났습니다.
본원에 제시된 모델 시스템은 수정할 수있는 기회를 제공한다. HIBCPP 세포 감염시 관련 전달 경로를 수용체와 신호 식별하는 항체 또는 화학적 억제제로 전처리 할 수있다. DMSO 세포 자극 시약 공통 용매 조사 시간 과정을 통해 화학적 영향을받지 않는 안정한 장벽 기능을 표시 HIBCPP 세포에 적절한 양으로 적용될 수있다. 이 속성은 또한 제약 연구에서 모델의 사용을위한 관련이있다.
우리가 HIBCPP 세포가 극성의 일정 수준을 보여 것을 증명했지만, 그들은 자연스럽게 생체 내 모델의 모든 단일 세부 사항을 반영하지 않습니다. <EM> 예는 ABC 트랜스 포터의 가족의 현지화가 부분적으로 만 제약 응용 프로그램은 아마 단지 제한된 범위에 적용 할 수있는 이유를 예상 패턴 6 일치합니다. 또한 HIBCPP 셀 (데이타 미기재) CSF를 생산하지 않는 것. 그럼에도 불구하고, 우리는 HIBCPP 세포 CP 상피 세포 29,30,31,32을 특징적인 마커 단백질 RNA 레벨 5의 단백질 트랜스 티 레틴, 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF2) 및 forkhead 상자 J1 (FOXJ1)를 표현하는 것을 발견 . 이 관찰은 HIBCPP 세포가 CP 상피 세포의 전형적인 특성을 유지 한 것을 지원합니다. 중요한 것은 HIBCPP 세포가 존재하지 접촉 억제를 수행하는 것이 주목되어야한다. 이에 적합 티이 값에 도달하면 실험에 세포를 사용하는 것이 중요하다. 또한, HIBCPP 세포는 높은 통로로 떨어 배리어 기능을 개발하는 가능성이 있기 때문에, 통로 (38)를 넘어 보인다 사용해서는 안된다. 마지막으로, 꼬마 도깨비를 공부CP 상피 및 내피 이루어진 BCSFB 감염에서 공동 배양 모델 중에 세포 - 세포 상호 작용의 행위는 높은 관심을 가질 것이지만, 이러한 모델은 아직 개발 될 필요가있다.
결론적 HIBCPP 세포 배양 모델에서, 특히 인간 BCSFB 특정 병원균의 주요 침입 경로 및 하부 신호 전달 경로를 나타 내기 위해 사용될 수있다. CP의 상피 세포는 또한 알츠하이머 질환을 포함한 신경 퇴행성 질환뿐만 아니라 다발성 경화증이 관여하고, 또한 종양 세포 (33)의 뇌 전이에서는 시스템 기회 일반 큰 다양성에 제공되는 공지 된 바와 같이 질병 관련 메커니즘 조사, 신규 한 치료 표적을 발견 할 가능성을 제공한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
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