Introduction
A barreira de fluido cerebrospinal de sangue (BCSFB) é um dos três locais de barreira entre o sangue e o cérebro um. Seu correlato morfológicas são as células epiteliais do plexo coróide (CP) de 2,3, um convoluta-endotelial epitelial, que é fortemente vascularizado e localizado nos ventrículos do cérebro. A CP serve para produzir o fluido cerebrospinal (CSF), bem como para separar o último do sangue. A fim de conseguir a função de barreira, as células epiteliais CP mostram uma actividade pinocitótica baixo, expressar transportadores específicos, e estão densamente ligadas por uma rede contínua de junções apertadas (TJS) 2,3.
Células do plexo coróide do papiloma humano (HIBCPP), derivados a partir de um plexo coróide do papiloma maligno de uma japonesa 4, foram utilizados para construir um modelo funcional em vitro da BCSFB. HIBCPP células mostram um par de características de um BCSFB funcional, tal como a formação de TJfios, o desenvolvimento de um potencial de membrana transepitelial alta que pode ser determinado como a resistência eléctrica transepitelial (TEER), e permeabilidades menores para macromoléculas. Além disso, as células HIBCPP expressar transportadores característicos, que podem servir para regular o micro ambiente iónico, e mostram apical / basolateral 5,6,7 polaridade.
O BCSFB foi mostrado funcionar como um local de entrada para agentes patogénicos (bactérias, vírus, e fungos) no sistema nervoso central (SNC) 8. A invasão de agentes patogénicos, incluindo Neisseria meningitidis (N. meningitidis), uma bactéria Gram-negativa, podem causar doenças graves, como a meningite. A prova de que ele ultrapassa a barreira epitelial de protecção do CP é suportado por observações histopatológicas em pacientes com doença meningocócica exibindo aumento da quantidade de meningococos nos vasos e as células epiteliais 9,10 CP. Para ganhar a entrada em células hospedeiras bacteria muitas vezes mecanismos de endocitose sequestrar, que são mediados ou desencadeada pelos receptores de superfície específicos localizados nas células hospedeiras. Uma vez que as interacções dos agentes patogénicos com estes receptores pode ser espécies modelos 11, específicos dos animais só pode ser consultado em medida restrita. A linha celular HIBCPP proporciona a oportunidade de estudar o processo de invasão, bem como os mecanismos moleculares subjacentes em um sistema modelo humano. Empregando inserções de cultura de células nos permite analisar as interacções dos agentes patogénicos com células hospedeiras de dois lados celulares distintas. Muitas bactérias, incluindo N. meningitidis, são fortemente sujeito ao impacto da gravidade durante ensaios de infecção. Para optimizar a interacção dos agentes patogénicos com as células HIBCPP durante os ensaios, as bactérias são inicialmente adicionado para dentro do compartimento superior do sistema de cartucho filtrante de cultura de células. Para permitir que a infecção do lado apical ou do lado basolateral da célula, respectivamente, duas variações do sistema in vitro têm sido ESTAestabe-: No sistema standard HIBCPP células são semeadas para dentro do compartimento superior do elemento filtrante, simulando a situação quando os microrganismos estão localizados no lado-CSF a e entrar em contacto com o lado apical das células (Figura 1 A, C). Em contraste, usando as células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de células de filtro invertido reflecte as condições quando as bactérias tenham entrado no fluxo sanguíneo. Microorganismos difundir no sangue e encontro CP células epiteliais do lado basolateral (Figura 1B e D). Digno de nota, neste sistema modelo, foi demonstrado que as bactérias invadem as células HIBCPP numa forma polar especificamente de 5,7 lado basolateral da célula.
Subsequentemente à infecção do CP, os agentes patogénicos podem ser invadidos reconhecido pelo sistema imune inato através de ligação a receptores de reconhecimento de padrões (SRRS). membros bem descritas de PRRS pertencem à família dos receptores de tipo Toll (TLR). pode TLRs bind para estruturas características de microorganismos infecciosos, que são padrões moleculares associados a agentes patogénicos denominado (PAMPs). A ligação dos receptores leva à activação da célula hospedeira cascatas de sinalização que provocam a expressão de citocinas e quimiocinas 12, que por sua vez estimulam a transmigração de células imunes em todo o BCSFB 13,14. Tem sido demonstrado que as células HIBCPP expressar vários TLRs ao nível do mRNA e que a infecção com N. meningitidis resulta na secreção de várias citocinas e quimiocinas, incluindo CXCL1-3, IL6, IL8 e TNFa 15,16.
Aqui, nós descrevemos o cultivo e infecção da linha celular humana HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertido que imita o BCSFB. Este sistema modelo permite estudar as interacções dos agentes patogénicos com o lado da célula in vivo, relevante basolateral, bem como a subsequente resposta celular.
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Protocol
1. Prepare Cultura celular filtro Incorporações nas células Sementeira HIBCPP em um sistema invertido Modelo
- Pré-aquecido DMEM / F12 (HAM) suplementado com 5 ug / ml de insulina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de vitelo (FCS).
- Use fórceps estéreis para colocar 0,33 cm² inserções de filtro de cultura de células da área de crescimento com um tamanho de poro de 3 um de cabeça para baixo em uma placa de 12 poços (Figura 1E).
- Encha meio para dentro do compartimento inferior do cartucho do filtro de cultura de células (cerca de 3 ml) e 100 ul de topo do elemento do filtro. Inundar a placa, bem como o compartimento inferior com forma. Aspirar o meio excessiva de tal maneira que o compartimento inferior do inserto filtro fica cheio (Figura 1E).
Nota: Recomenda-se a utilização de uma pipeta sorológica para esta etapa. - Cubra placa de 12 poços, com a tampa e transferir as inserções de filtro preparados de cultura de células para a incubadora, a 37 ° C,5% de CO 2 até adição de células.
2. Cultivo e Passaging de células HIBCPP
- Prepare DMEM / F12 (HAM) suplementado com 5 ug / mL, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 10% de FCS.
- Pré-quente médio e PBS em banho-maria C 37 °. médio aspirado da garrafa. Adicionar 10 ml de PBS ao balão e redemoinho. Repita este passo uma vez.
- Adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA para o balão e redemoinho. Colocar na incubadora, a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Após aproximadamente 20 min retirar o balão da incubadora. Certifique-se de que as células são destacadas do fundo do frasco e apresentar uma forma redonda quando pesquisados com o microscópio.
Nota: As células não separe completamente uma da outra e são muitas vezes encontrados em aglomerados. Recomenda-se usar as células-se à passagem 38. - Para parar tripsinização adicione 17 ml de meio. Volte a suspender as células por pipetagem cima e para baixo e transferir a suspensãopara um tubo de 50 ml. Centrifugar a 50 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células num volume apropriado de meio e contar as células utilizando um hemocitómetro.
Nota: A concentração de células ressuspensas HIBCPP deve ser de 1 x 10 6 células / ml. Para a manutenção de células HIBCPP sugere-se a transferir uma quantidade de 1-6 x 10 6 células em 10 ml de meio para um frasco de T75-. Mudança do meio cada segundo dia.
3. Sementeira Cultura de Células invertido filtro inserções com células HIBCPP
- No topo de cada elemento do filtro invertido (isto é, o lado inferior do filtro) adicionar 80 ul de suspensão de células (isto é. 8 x 4 10 células) (Figura 1E).
Nota: Certifique-se de que as células são distribuídas uniformemente na suspensão invertendo o tubo antes da semeadura. - Cobrir as inserções de filtro de cultura de células inoculada com a tampa da placa de 12 poços e transferência para a incubadora, a 37 ° C, 5% CO 2.
- No primeiro dia, preencher 1 ml de meio em poços de uma placa de 24 poços. Levantar as inserções de filtro de cultura de células usando uma pinça para fora da placa de 12 poços, descartar a forma interior, por sua vez as inserções de filtro e colocá-los no padrão de orientação na placa de 24 poços preparados (Figura 1E).
- Colocar as células em meio fresco a cada segundo dia. Preparar 24 cavidades com meio fresco e transferir as inserções de filtro a ele. Preencha inserções com 0,5 ml de meio fresco. Verifique TEER todos os dias, como descrito no ponto 4.
- Quando os valores de TEER HIBCPP de células semeadas em inserções de cultura celular for superior a 70 Ω x cm (cerca de 4 dias após a sementeira), em seguida, continuar a cultura de células em meio contendo 1% de FCS e 5 ug / ml de insulina. Prepare a placas de 24 cavidades com 1 ml de meio para cada poço. Transferir inserções de filtro para os recipientes preparados e meio de permuta no compartimento superior.
Nota: Esta retirada soro após confluência leva à formação deum potencial de membrana superior. - médio aspirado do compartimento do filtro, transferir para o bem preparado e encher com 500 � de meio. Repita este passo uma vez. Coloque as células durante a noite na incubadora, a 37 ° C, 5% de CO 2.
4. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER)
- Mergulhar as pontas dos eléctrodos da voltohmmeter tecido epitelial durante 15 min em etanol a 80%. Transferir voltohmmeter sob o capô e deixá-eletrodo seco por um momento. Coloque eléctrodo no respectivo meio de cultura utilizado para as células por mais 15 minutos para equilibrar.
- Realizar medições ao posicionar o braço mais longo do eléctrodo de modo que toque o fundo do compartimento inferior de cada vez, colocar o braço mais curto no compartimento de cartucho do filtro.
Nota: Os valores de resistência de elementos filtrantes de cultura de células sem células em meio deve ser usado como valores em branco ((valor medido (Ω) - valor em branco (Ω)) x filtrosuperfície (isto é, 0,33 cm)). - Após a medição Coloque o eletrodo de volta para 80% de etanol para 15 min. Armazenar em um tubo seco.
5. Determinação do paracelular Permeabilidade
- Dissolve-se 1 g de FITC-inulina em 200 ml de meio de cultura suplementado com 5 ng / ml de insulina 1% de FCS. Aplicar 50? G / ml da solução para dentro do compartimento do filtro superior antes da infecção das células.
- Após a infecção recolher amostras de meio do poço inferior para determinar a quantidade de inulina passada do compartimento do filtro através da camada de células.
- Prepara-se uma solução padrão de FITC-inulina e executar 1: 2 diluições, 10 vezes (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% e 0%) . Determinar a fluorescência por medição de todas as amostras em leitor de microplacas.
6. Preparação de bactérias para a infecção de células HIBCPP numa cultura de células de filtro Inserções
- Um dia antes do experimento, raspar tele N. congelada meningitidis estirpes fora de uma glicerol-estoque e raia para fora em Agar Chocolate com Vitox. Crescer durante a noite na incubadora, a 37 ° C, com 5% de CO 2.
- Extrair 20-30 colónias a partir da cultura durante a noite e transferir para um tubo contendo 8 ml Proteose Peptona meio suplementado com 0,042% de NaHCO 3, 0,01 M de MgCl2 e 1% Polyvitex.
- Agitar as bactérias durante 1,25 h a 220 rpm, 37 ° C. Sedimentar as bactérias por centrifugação a 2684 g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento bacteriano com meio isento de soro de 8 ml. Vortex para assegurar uma suspensão uniforme.
- Para determinar a densidade da cultura, medida uma diluição de 1:10 a uma densidade óptica (OD) de 600 nm. Ajustar a suspensão bacteriana para uma DO 600 de 0,1.
Nota: Esta suspensão contém aproximadamente. 1 x 10 8 UFC / ml. - Para confirmar a concentração de células bacterianas, dilui-se a suspensão por passos (01:10) até umdiluição de 10 ~ 5 e placa em placas de agar de chocolate.
Nota: diluições em série similares precisam ser executadas para calcular curvas de crescimento bacteriano.
7. A infecção de células HIBCPP em inserções de filtro cultura de células e determinação da invasão bacteriana por imunofluorescência Duplo
- Após continuar a cultura de células em meio contendo 1% de FCS e 5 ug / ml de insulina, as células medir todos os dias utilizando um voltohmmeter tecido epitelial. Se as células atingiram um TEER de cerca de 500 Ω x cm², realizar a infecção.
- Infectar as células com a suspensão bacteriana preparada a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. loja as células infectadas na incubadora, a 37 ° C, com 5% de CO 2 durante o período de tempo indicado.
Nota: O MOI pode ser calculado tendo em conta o número de células por inserção do filtro de cultura de células em confluência (1,21 X 10 6 células / cm2). - Pare o Infectião por lavagem três vezes com meio isento de soro de 500 ul (SFM) contendo albumina de soro bovino 1% (BSA) aplicada ao compartimento do filtro, de 1 ml para o compartimento inferior.
- Bloquear com 500 ul de SFM contendo 1% de BSA em tampão de compartimento do filtro e 1 ml no compartimento inferior durante 20 min a temperatura ambiente para evitar a aderência de anticorpos para locais de ligação não específicos.
- Incubar com 100 uL de anticorpo primário anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) no compartimento de filtro e 500 ul no compartimento inferior durante 20 min à temperatura ambiente.
Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada. - Lavam-se as células por aspiração a forma do compartimento do filtro, transferir o elemento filtrante a uma SFM bem com 1 mL preparada contendo 1% de BSA e encher o compartimento de filtro esvaziado com SFM 500 ul contendo 1% de BSA. Repita esta etapa duas vezes.
- Fixar as células com 500 uL de 4% de formaldeído no compa filtrortment, 1 ml no compartimento inferior durante 10 min à temperatura ambiente.
- Lavam-se as células por aspiração a forma do compartimento do filtro, transferir o elemento filtrante para um poço preparado com 1 ml de PBS e encher o compartimento de filtro esvaziado com 500 ul de PBS. Repita este passo uma vez.
Nota: As amostras podem ser armazenadas durante a noite em PBS a 4 ° C. - cultura de células fixadas corte filtra das inserções e lava-se com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%. Incubar as células durante 15 minutos à temperatura ambiente com 250 ul marcado fluorescente (comprimento de onda de excitação 594 nm) derivado do anticorpo de galinha anti-coelho (1: 500) para corar bactérias extracelulares.
Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada. - Permeabilizar as células com 250 ul de PBS contendo 1% de BSA e 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave as células três vezes com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%.
- Incubar com 250 uL de anticorpo primário anti N. meningitidis
- Aplicar 250 ul de marcação fluorescente (comprimento de onda de excitação de 488 nm) anticorpo secundário (1: 500), marcado fluorescente (comprimento de onda de excitação de 660 nm) faloidina (1: 250) e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) dicloridrato de ( 1: 50000) durante 1 h à temperatura ambiente para corar bactérias intracelulares e extra-, citoesqueleto de actina e núcleos.
Nota: Se for necessário, a concentração de anticorpo deve ser titulada. - Lave as células três vezes com 250 ul de PBS contendo BSA a 1%. Incorporar as células em meio e armazenar a 4 ° C de montagem até à sua análise por meio de microscópio.
- Determinar o número de bactérias invadidas por campo predefinido. Faça isso por meio da contagem de 20 campos por membrana de filtro. Calcula-se a percentagem de bactérias invadidas.
Nota: multiplicar a contagem bacteriana média dos 20 campos microscópicos com um coeffic áreatário. O resultado exprime a quantidade de bactérias totais presentes em uma inserção de cultura de células de filtro de 0,33 cm. Dividir este valor pela quantidade de bactérias cultivadas em meios durante a duração da infecção.
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Representative Results
Aqui, descrevemos a cultura e infecção das células HIBCPP num sistema de inserção de cultura de célula invertida. Este modelo nos permite estudar os mecanismos de invasão e as vias de sinalização molecular subjacente a partir do lado da célula basolateral, reproduzindo uma situação fisiológica de bactérias divulgação e entrar nas células epiteliais através da corrente sanguínea (Figura 1).
As células HIBCPP exibir certas funções de barreira, que lhes permitem restringir troca molecular a um nível mínimo. Isto é conseguido através da expressão de junção aderente (AJ) e proteínas de junção estanque (Tj). Análise por imunofluorescência das proteínas TJ-associados ocludina, claudina e ZO-1 revelou um sinal ininterrupto nos sítios de contacto célula-célula, o que demonstra que as células estão interligadas por fios contínuos de TJs (Figura 2A, B, C). Uma impressão detalhada de tele morfologia TJ foi obtido por meio de transmissão (Figura 2D) e microscopia electrónica de fractura congelar (Figura 2E), o que mostra que TJs estão localizados entre as células e formar estruturas de cabos do tipo largos, engrenadas.
TJs de células epiteliais também agir como uma barreira para separar domínios de membrana apical e basolateral, por conseguinte, contribuir para a polaridade celular. Entre as proteínas, que são expressos exclusivamente sobre o lado da célula basolateral de células HIBCPP, são a proteína AJ E-caderina (Ecad) e o receptor do factor de crescimento de hepatócitos (HGF / Met) como mostrado por análise de imunofluorescência na Figura 3, que aponta para uma certo nível de polaridade.
Quando cultivada sob condições adequadas HIBCPP células também exibem funções de barreira típicos da BCSFB como a formação de um potencial de membrana, bem como uma baixa permeabilidade para macromoleCules. Determinação do potencial de membrana pode ser conseguida através da medição da TEER com o uso de um voltohmmeter. A permeabilidade da camada de células é quantificado por aplicação de inulina marcada com FITC, um açúcar que passa a camada de forma paracelular. Aqui, mostramos resultados de uma experiência representativa, o que demonstra que estas funções de barreira permanecem estáveis e não apresentam qualquer afecto por concentrações padrão de sulfóxido de dimetilo (DMSO), um solvente comum para produtos químicos estimulante de células. Como pode ser visto na Figura 4A, os valores de TEER foram gravadas antes e após a exposição de células a DMSO HIBCPP.
As células apresentaram um elevado potencial de membrana que atingiu-se a cerca de 500 cm x Ω no início da experiência para todas as condições. O TEER medido não se alterou após 2 horas para as células tratadas com até 0,2% vol de DMSO. Em contraste, os valores de TEER diminuiu num WH maneira dose-dependenteen volumes mais elevados foram aplicados (Figura 4A). Esta redução no potencial de membrana foi concomitante com um aumento da permeabilidade de macromoléculas. Considerando que a adição de DMSO a células HIBCPP até 0,5% em volume não resultaram em um aumento da permeabilidade de inulina, 1 vol% e 2% em volume apresentaram um efeito, embora numa medida reduzida (Figura 4B). Além disso, nós verificamos a influência da citocalasina D, um potente inibidor da polimerização da actina, no potencial de membrana e permeabilidade das células HIBCPP. O tratamento das células com a 1 ug / ml de citocalasina D provoca uma queda significativa dos valores TEER, bem como um aumento no fluxo de FITC-inulina (Figura 4A, B). Este efeito pode ser explicado pela abertura de TJs causada por citocalasina D.
A linha celular HIBCPP como um modelo da BCSFB podem ser empregues para estudar as interacções de organismos patogénicos e as células epiteliais de formação de barreira. Há evidênciasque a bactéria N. meningitidis ganha entrada no CNS, atravessando o BCSFB. Tem sido demonstrado que a Neisseria invadir células HIBCPP especificamente a partir do lado basolateral da célula, o que é relevante in vivo. Durante este processo, a cápsula bacteriana desempenha um papel importante: mutantes falta da cápsula mostram aumento da invasão em células HIBCPP 5. No seguinte comparamos invasão basolateral da estirpe MC58 17, seu mutante isogênico MC58siaD - deficiente para a produção de cápsula 17 e o transportador não encapsulado isolar α14 19,20. HIBCPP células foram infectadas com as estirpes acima mencionadas ao longo de um curso de tempo de 4 horas a uma MOI de 10. Análise por imunofluorescência revelou invasão significativa para as duas estirpes patogénicas MC58 e MC58siaD -, enquanto as taxas de invasão apenas pequenas foram observadas para a estirpe α14 apatogênica ( Figura 5A). A imagem representativa da dupla immunofluorescence microscopia de células infectadas com o HIBCPP respectiva estirpe é mostrado na Figura 5A, B e C.
Figura 1:. Padrão e celular do sistema invertido cultura no sistema de cultura de células padrão (A, C) a interacção das bactérias com as células epiteliais CP podem ser investigadas para o lado apical de células, o que é indicado por microvilosidades. O sistema de cultura de células invertida (B, D) permite estudar a interacção da bactéria com a membrana da célula basolateral, que está envolvido durante a invasão bacteriana através da corrente sanguínea para o SNC. Para a cultura de células de células invertido (E) HIBCPP são semeadas sobre o lado inferior dos elementos filtrantes. O bem inferiores, incluindo o compartimento interno do elemento filtrante são inundadas com meio. Subsequtemente, o meio é aspirado excessiva de tal maneira que o compartimento interno do cartucho do filtro fica cheio. No primeiro dia após a semeadura, as inserções de filtro de cultura celular são capotou e preenchido com o meio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Células HIBCPP Indicar Strands contínuas de TJs As proteínas TJ ZO-1 (A), ocludina (B) e Claudina-1 (C) foram detectados em células HIBCPP. Painéis AC mostrar imagens ApoTome. Centro de cada painel: xy en vista de face das células; lado superior e direito: cortes transversais de várias fatias ópticos através do z -Plane. As barras de escala indicam 10 um. A estrutura de células TJ HIBCPP foi analisada por transmismicroscopia eletrônica de Sion. As células são inter-ligadas por TJs, que estão indicados por setas (D). A barra de escala indica 1 um. Congelar estudos de microscopia eletrônica de fratura visualizar estreitamente vinculada fios TJ (E). A barra de escala = 0,5 mm. As imagens desta figura foram originalmente publicado em Schwerk et al, PloS One 7: e30069, doi:. 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); re-print com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: expressão do receptor de proteínas envolvidas durante a invasão de bactérias em HIBCPP Células Análise por imunofluorescência da expressão exibe Ecad (A) e Met (B) no lado basolateral da célula.. o pictures mostrar imagens ApoTome. Centro de cada painel: xy en vista de face das células; parte de cima e à direita: corte transversal de várias fatias ópticos através do z -Plane. A membrana apical das células HIBCPP (indicado por setas) é posicionada em direcção ao topo da parte superior, bem como para a direita do lado direito, respectivamente, de cada quadro. Barras de escala = 10 uM. Os dados nesta figura também foram publicados anteriormente em Gründler et al, Micróbios Infect 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); re-print com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Influência de DMSO e citocalasina D na Barreira função das células HIBCPP Efeitos sobre a func barreira.ção são determinadas pela medição dos valores de TEER e FITC-Inulina-fluxo. Os resultados são apresentados para uma experiência representativa, o qual foi executado em triplicado. Células HIBCPP foram tratadas com DMSO, bem como Cytochlalasin D nas quantidades indicadas para 2 horas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quando aplicado em concentrações de até 0,2% em volume, DMSO não afecta o potencial de membrana (Figura 4A). As concentrações que variam de 0,1% em volume até 0,5% em volume de DMSO também não influenciam a permeabilidade paracelular das células (Figura 4B). Em contraste, 1 ug / ml de citocalasina D provoca uma diminuição da TEER concomitante com um aumento da FITC-Inulina-fluxo através da camada de células (Figura 4A, B).
Figura 5: Invasão de N. meningitidis em células HIBCPP. imunofluorescência Duplo microscopia mostra invadido (verdes) e bactérias aderidas (amarelo). caixas brancas dentro de imagens representam o detalhe da imagem ampliada no lado direito. Invasão basolateral foi observado para a N. meningitidis estirpes MC58 (A) e MC58siaD -, deficiente para a produção de cápsulas (B), enquanto que apenas uma pequena taxa de invasão foi determinada para α14 (C). O diagrama demonstra que as taxas de invasão do MC58 e MC58siaD - são altamente significativo quando comparado com α14 (**, p <0,01). Extrema importância é exibido quando MC58 ou MC58siaD -, respectivamente, foram comparados com α14 (***, P <0,001) e MC58siaD - foi comparado com MC58 (###, p <0,001). Escala de barras indicate 10 um. . O diagrama da D foi publicado originalmente em Borkowski et al, J Neuroinflammation 11: 163, doi: 10,1186 / s12974-014-0163-x (2014); re-print com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As células epiteliais do CP formar o BCSFB que separa o CSF a partir do sangue 2,3. Recentemente, estabeleceu a linha de células HIBCPP como um modelo humano funcional do BCSFB. As células apresentam funções de barreira importantes da BCSFB in vitro, incluindo o desenvolvimento de um potencial de membrana elevada, uma baixa permeabilidade de macromoléculas, bem como a presença de filamentos contínuos de TJs 5. As proteínas TJ contribuir para uma polaridade apical / basolateral das células. A polaridade é de grande importância para uma localização dirigida de receptores de superfície, bem como proteínas transportadoras específicas. Mostrámos localização polar dos receptores Ecad e MET, bem como membros da cassete de ligação a ATP (ABC) da família transportador que mantém um micro-ambiente altamente controlado dentro do SNC 6,7.
Há diversos microrganismos que são capazes de obter a entrada no CNS, superando a BCSFB, leading a doença grave, incluindo meningite 8. Um dos agentes patogénicos que são capazes de invadir células epiteliais em CP é a bactéria Gram-negativa específica N.-humano meningitidis 9,10, o que foi mostrado para entrar nas células HIBCPP numa forma polar, especificamente a partir do lado basolateral da célula 5. Este é o sentido fisiologicamente relevante para a infecção do cérebro através da BCSFB quando as bactérias disseminar e células epiteliais encontro CP a partir do sangue durante o curso da meningite. Para reflectir esta situação in vitro, as células são cultivadas HIBCPP no lado inferior do filtro. Em contraste com o modelo de inserção do filtro padrão, em que as células são semeadas para dentro do compartimento superior, este conjunto de um sistema de cultura invertido permite infectar as células epiteliais, especificamente a partir do lado basolateral da célula 5,21.
Invasão basolateral em células HIBCPP foi observado para os dois N. patogénico meningitidis -, ao passo que a transportadora não-patogênico isolar α14 exibida somente invasão marginal 15. Isso mostra que o modelo de célula HIBCPP oferece a possibilidade de digitalizar bibliotecas mutantes disponíveis para novos factores de virulência envolvidos durante o processo de invasão. Digno de nota, tem sido demonstrado que os outros agentes patogénicos, incluindo L. monocytogenes e Streptococcus suis (S. suis) invadir células HIBCPP de forma polar 5,7.
A fim de reconhecer e responder aos microorganismos invasores para o SNC, as células epiteliais do CP expressar PRRs 22,23. TLRs representam uma importante família dentro dos PRRs. As análises qualitativas de RT-PCR demonstrou que as células HIBCPP expressar vários TLR, bem como co-receptores relacionados e a molécula adaptadora MyD88 15. Tem sido observado que os receptores de TLR2 e TLR4 estão envolvidos na reacção de defesa celular para N. meningitidis polissacáridos capsulares 24. Resultados adicionais de uma abordagem de microarray revelou que as células infectadas com N. HIBCPP meningitidis exibir uma indução de vias de transdução de sinal, entre outros factores que envolvem também o regulador de transcrição IκBζ 15, obrigatória para a expressão de determinados genes alvo, incluindo IL6 25,26, uma citoquina pró-inflamatória.
Para confirmar estes resultados, as células HIBCPP infectados com N. meningitidis em um sistema de cultura invertido ter sido utilizado para investigar a libertação de citocinas e quimiocinas. Sabe-se que este processo tem como objectivo para instigar uma resposta inflamatória pela activação do sistema imune inato 13,14. células HIBCPP produzir e secretar citocinas e quimiocinas, incluindo CXCL1-3, IL6, IL8 e TNFa 15,16, que têm sido descritas para atrair monócitos e neutrófilos 27. Ao empregar a que sistema de modelodescobriu que os neutrófilos polimorfonucleares, monócitos e linfócitos T também migram através de células HIBCPP 16,28, enfatizando que as células HIBCPP são adequados para decifrar os mecanismos de migração transepitelial de células imunes.
O sistema modelo aqui apresentado oferece também a oportunidade para modificações. HIBCPP células podem ser pré-tratados com anticorpos ou inibidores químicos para identificar receptores e sinalizam vias de transdução envolvidas durante a infecção. DMSO, um solvente comum para estimular células reagentes podem ser aplicados em volumes apropriados para as células HIBCPP, que exibem funções de barreira estáveis que não são afectados pela química ao longo do curso tempo investigada. Essa propriedade também é relevante para a utilização do modelo em estudos farmacêuticos.
Embora tenhamos demonstrado que as células HIBCPP mostrar um certo nível de polaridade, eles não irá, naturalmente, reflectir todos os detalhes de um modelo in vivo. <em> Por exemplo, a localização de membros da família transportador ABC só em parte coincide com os padrões esperados 6, por isso aplicações farmacêuticas provavelmente pode ser aplicado apenas a uma extensão limitada. Além disso, as células HIBCPP não parecem produzir LCR (dados não mostrados). No entanto, verificou-se que as células HIBCPP expressar as proteínas de transtirretina, factor de crescimento tipo insulina 2 (IGF2) e caixa de forkhead J1 (Foxj1) no nível de ARN 5, que são proteínas marcadoras característicos para as células epiteliais CP 29,30,31,32 . Esta observação suporta que as células HIBCPP mantiveram propriedades típicas de células epiteliais CP. Mais importante, deve notar-se que as células HIBCPP fazer inibição de contacto não está presente. Portanto, é crucial para usar as células para a experimentação quando os valores TEER apropriados são atingidos. Além disso, as células HIBCPP não deve ser utilizada para além de passagem 38, uma vez que o potencial para desenvolver uma função de barreira parece cair com passagens mais elevadas. Finalmente, para estudar o IMPato de interacções célula-célula durante as infecções no BCSFB um modelo de co-cultura que consistem em CP epitelial e endotelial seria de grande interesse, mas um tal modelo ainda necessita de ser desenvolvido.
Em conclusão, o modelo de cultura de células HIBCPP pode ser usado para revelar as vias principais de invasão e vias de transdução de sinal de base, em especial de agentes patogénicos específicos de humanos no BCSFB. Como é sabido que as células epiteliais da CP também estão envolvidos em desordens neurológicas degenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, assim como da esclerose múltipla 2, e também em metástases de células de tumor cerebral 33, o sistema oferece, em geral, uma grande variedade de oportunidades para a investigação dos mecanismos relacionados com a doença, proporcionando o potencial para encontrar novos alvos terapêuticos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
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