Introduction
La barrière hémato-céphalorachidien (BCSFB) est l' un des trois sites de barrière entre le sang et le cerveau 1. Corrélat morphologique sont les cellules epitheliales du plexus choroïde (CP) 2,3, une spire endothéliale épithéliale, qui est fortement vascularisée et situé dans les ventricules du cerveau. Le CP sert à produire le liquide céphalorachidien (LCR), ainsi que pour séparer celui-ci du sang. Afin d'obtenir la fonction de barrière, les cellules épithéliales CP présentent une activité faible pinocytose, expriment des transporteurs spécifiques, et sont fortement connectés par un réseau continu de jonctions serrées (TJS) 2,3.
Human papilloma du plexus choroïde (HIBCPP) cellules, dérivées d'une maligne plexus choroïde papillome d'une femme japonaise 4, ont été utilisés pour construire une fonctionnelle dans le modèle in vitro de l'BCSFB. HIBCPP cellules présentent quelques caractéristiques d'une BCSFB fonctionnelle que la formation de TJbrins, le développement d'un potentiel de membrane transépithélial élevée qui peut être déterminé que la résistance électrique transépithélial (TEER), et des perméabilités mineures pour macromolécules. En outre, les cellules HIBCPP expriment les transporteurs caractéristiques, qui peuvent servir à réguler le microenvironnement ionique, et de montrer apical / basolateral 5,6,7 de polarité.
Le BCSFB a été montré pour fonctionner comme un site d'entrée pour les agents pathogènes (bactéries, virus et champignons) dans le système nerveux central (SNC) 8. L'invasion de pathogènes, y compris Neisseria meningitidis (meningitidis N.), une bactérie à Gram négatif, peut provoquer des maladies graves comme la méningite. Preuve qu'il surmonte la barrière épithéliale protectrice du CP est pris en charge par des observations histopathologiques chez les patients avec une maladie méningococcique présentant des quantités accrues de méningocoques dans les vaisseaux et les cellules CP épithéliales 9,10. Pour gagner l'entrée dans des cellules hôtes bacteria détournent souvent des mécanismes d'endocytose, qui sont médiées par des récepteurs ou déclenchées de surface spécifiques situés sur les cellules hôtes. Depuis les interactions des agents pathogènes avec ces récepteurs peuvent être des espèces modèles spécifiques 11, animaux ne peuvent être consultés dans une mesure restreinte. La lignée cellulaire HIBCPP offre la possibilité d'étudier le processus d'invasion, ainsi que les mécanismes moléculaires sous-jacents dans un système de modèle humain. En utilisant des inserts de culture cellulaire permet d'analyser les interactions des agents pathogènes avec les cellules hôtes à partir de deux côtés de cellule distincts. Beaucoup de bactéries, y compris N. meningitidis, sont fortement soumis à l'impact de la gravité au cours des essais d'infection. Pour une interaction optimale des agents pathogènes avec les cellules HIBCPP au cours des essais, les bactéries sont tout d'abord ajoutés dans le compartiment supérieur du système d'insertion de filtre de culture cellulaire. Pour permettre l' infection de la apical ou du côté de la cellule basolatérale, respectivement, deux variantes du système in vitro ont été established: Dans le système standard de cellules HIBCPP sont ensemencés dans le compartiment supérieur de l'insert filtrant, mimant la situation dans laquelle les micro - organismes sont situés sur le CSF-côté et entrer en contact avec le côté apical des cellules (Figure 1A, C). En revanche, en utilisant les cellules HIBCPP dans un système d'insertion de filtre de culture cellulaire inversée reflète les conditions lorsque les bactéries ont pénétré dans le flux sanguin. Microorganismes diffusent dans le sang et la rencontre CP cellules épithéliales du côté basolatéral (Figure 1B, D). Il convient de noter qu'il a été démontré que , dans ce système de modèle que les bactéries envahissent les cellules d'une manière HIBCPP polaire spécifiquement du côté basolatéral de 5,7 cellulaire.
Par la suite à l'infection du CP, les agents pathogènes envahis peuvent être reconnus par le système immunitaire innée par ligature à des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). membres bien décrits des PRR appartiennent à la famille des récepteurs Toll-like (TLR). TLR peut bind à des structures caractéristiques des micro-organismes infectieux, qui sont des modèles de Appelés associés à des pathogènes moléculaires (PAMP). Ligation des récepteurs conduit à l' activation de la cellule hôte en cascade de signalisation qui déclenchent l' expression de cytokines et de chimiokines 12, qui à leur tour stimulent la transmigration des cellules du système immunitaire à travers la BCSFB 13,14. Il a été démontré que les cellules expriment HIBCPP plusieurs TLR au niveau de l' ARNm et que l' infection par N. meningitidis entraîne la sécrétion de plusieurs cytokines et de chimiokines, y compris CXCL1-3, IL6, IL8 et TNFa 15,16.
Ici, nous décrivons la culture et l'infection de la lignée cellulaire humaine HIBCPP dans un système d'insert de culture cellulaire inversée qui imite la BCSFB. Ce système modèle permet d'étudier les interactions des agents pathogènes avec la partie pertinente in vivo basolatérale des cellules ainsi que la réponse cellulaire ultérieure.
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Protocol
1. Préparer Culture cellulaire Filter Inserts pour cellules Semis HIBCPP dans un système Inverted Modèle
- Préchauffer DMEM / F12 (HAM) supplémenté avec 5 pg / ml d'insuline, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 10% de sérum de foetus de veau (FCS).
- Utiliser des pinces stériles pour placer la zone de croissance des inserts de filtres de culture cellulaire 0,33 cm² avec une taille de pores de 3 um à l' envers dans une plaque à 12 puits (figure 1E).
- Remplissage moyen dans le compartiment inférieur de la culture cellulaire élément filtrant (environ 3 ml) et 100 ul sur le dessus de la cartouche filtrante. Inonder la plaque ainsi que le compartiment inférieur avec le milieu. Aspirer le milieu en excès de telle manière que le compartiment inférieur de la garniture de filtre reste rempli (figure 1E).
Note: Il est recommandé d'utiliser une pipette sérologique pour cette étape. - Couverture plaque de 12 puits avec le couvercle et transférer les inserts filtrants disposés de culture de cellules dans l'incubateur à 37 ° C,5% de CO 2 jusqu'à ce que l' addition de cellules.
2. La culture et repiquage des cellules HIBCPP
- Préparer DMEM / F12 (HAM) supplémenté avec 5 pg / ml, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 10% de FCS.
- moyen pré-chaud et PBS dans un bain d'eau C 37 °. milieu de Aspirer de flacon. Ajouter 10 ml de PBS dans le ballon et tourbillonnement. Répétez cette étape une fois.
- Ajouter 3 ml de 0,25% de trypsine-EDTA dans le flacon et tourbillonnement. Placer dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Après environ 20 minutes enlever le ballon de l'incubateur. Faire en sorte que les cellules se détachent du fond du flacon et présentent une forme ronde au moment du sondage au moyen du microscope.
Remarque: Les cellules ne se détachent pas complètement l'une de l'autre et sont souvent trouvés dans les agglomérats. Il est recommandé d'utiliser les cellules jusqu'à passage 38. - Pour arrêter trypsinisation ajouter 17 ml de milieu. Resuspendre les cellules par pipetage de haut en bas et de transférer la suspensiondans un tube de 50 ml. Centrifuger à 50 xg pendant 10 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de milieu et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
Remarque: La concentration des cellules remises en suspension HIBCPP doit être de 1 x 10 6 cellules / ml. Pour le maintien de cellules HIBCPP il est proposé de transférer une quantité de 1-6 x 10 6 cellules dans 10 ml de milieu dans un flacon T75,. Changer le milieu tous les deux jours.
3. Semis cellulaire Inversé Culture Filter Inserts avec cellules HIBCPP
- Au - dessus de chaque cartouche de filtre inversé ( à savoir le côté inférieur du filtre) , ajouter 80 pl de suspension cellulaire (p. 8 x 10 4 cellules) (figure 1E).
Remarque: Assurez-vous que les cellules sont réparties uniformément dans la suspension en inversant le tube avant l'ensemencement. - Couvrir les inserts de filtre de culture ensemencé des cellules avec le couvercle de la plaque de 12 puits et transfert à l'incubateur, 37 ° C, 5% CO 2.
- Le premier jour, remplir 1 ml de milieu dans les puits d'une plaque de 24 puits. Soulever la culture cellulaire inserts de filtre en utilisant une pince sur la plaque de 12 puits, jeter le milieu à l' intérieur, tourner les inserts de filtre et les placer dans l'orientation standard dans la plaque 24 puits préparée (figure 1E).
- Placez les cellules dans un milieu frais tous les deux jours. Préparer 24 puits avec du milieu frais et transférer les inserts de filtre à elle. Remplissez inserts avec 0,5 ml de milieu frais. Vérifiez TEER tous les jours, comme décrit dans la section 4.
- Lorsque les valeurs TEER des cellules ensemencées sur HIBCPP inserts de culture cellulaire est supérieure à 70 Ω x cm (environ 4 jours après le semis), puis continuer la culture de cellules dans un milieu contenant 1% de FCS et 5 pg / ml d'insuline. Préparer des plaques à 24 puits avec 1 ml de milieu pour chaque puits. Transfert inserts de filtre pour les puits préparés et moyen d'échange dans le compartiment supérieur.
Remarque: Ce retrait de sérum après la confluence conduit à la formation deun potentiel de membrane supérieur. - milieu Aspirer du compartiment de filtration, transfert au bien préparé et remplir avec 500 ul de milieu. Répétez cette étape une fois. Mettez les cellules pendant la nuit dans l'incubateur, 37 ° C, 5% de CO 2.
4. Mesure de la résistance électrique transépithélial (TEER)
- Immerger les pointes d'électrodes de voltohmmeter de tissu épithélial pendant 15 min dans 80% d'éthanol. Transfert voltohmmeter sous le capot et laisser électrode sèche pendant un moment. Placer l'électrode dans un milieu de culture respectif utilisé pour les cellules pendant encore 15 minutes pour atteindre l'équilibre.
- Effectuer des mesures en positionnant le bras le plus long de l'électrode, de façon à ce qu'elle touche le fond du compartiment inférieur à chaque fois, placer le bras le plus court dans le compartiment de cartouche de filtre.
Note: Les valeurs de résistance de culture cellulaire inserts filtrants sans cellules dans le milieu doit être utilisé en tant que valeurs vides ((valeur mesurée (Ω) - valeur à blanc (Ω)) x filtrela surface ( à savoir 0,33 cm)). - Après avoir mesuré lieu l'électrode arrière dans 80% d'éthanol pendant 15 min. Conserver dans un tube sec.
5. Détermination de la perméabilité paracellulaire
- Dissoudre 1 g de FITC-inuline dans 200 ml de milieu de culture supplémenté avec 5 pg / ml d'insuline à 1% de FCS. Appliquer 50 pg / ml de la solution dans le compartiment supérieur du filtre avant l'infection des cellules.
- Après l'infection de prélever des échantillons de la moyenne inférieure et de déterminer combien inuline passé du compartiment du filtre à travers la couche cellulaire.
- Préparer une solution standard FITC Inuline et effectuer des dilutions 1: 2, 10 fois (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% et 0%) . Déterminer la fluorescence par la mesure de tous les échantillons dans un lecteur de microplaques.
6. Préparation des bactéries pour l'infection de cellules HIBCPP sur culture cellulaire Filtre Inserts
- Un jour avant l'expérience, scrape til N. congelé meningitidis souches hors glycérol-stock et strie sur Chocolate Agar avec Vitox. Croître pendant une nuit dans l'incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Extraire 20-30 colonies de la culture pendant une nuit et transférer dans un tube contenant 8 ml Proteose Peptone milieu additionné de 0,042% de NaHCO 3, de 0,01 M de MgCl2 et 1% Polyvitex.
- Agiter les bactéries pendant 1,25 heure à 220 tours par minute, 37 ° C. Sédimenter les bactéries par centrifugation à 2684 g pendant 10 min à température ambiante. Rejeter le surnageant et resuspendre le culot bactérien avec un milieu sans sérum 8 ml. Vortex pour assurer une suspension uniforme.
- Pour déterminer la densité de la culture, mesurer une dilution de 1:10 à une densité optique (DO) de 600 nm. Ajuster la suspension bactérienne à une DO 600 de 0,1.
Remarque: Cette suspension contient environ. 1 x 10 8 CFU / ml. - Pour confirmer que la concentration de cellules bactériennes, on dilue la suspension par étapes (1:10) jusqu'à unedilution de 10 -5 et plaque sur des plaques de gélose chocolat.
Remarque: des dilutions en série similaires doivent être effectuées pour calculer les courbes de croissance bactérienne.
7. Infection des cellules HIBCPP sur culture cellulaire Filtre Inserts et détermination de bactéries Invasion par Double immunofluorescence
- Après avoir poursuivi la culture de cellules dans un milieu contenant 1% de FCS et 5 pg / ml d'insuline, de mesurer les cellules chaque jour en utilisant un voltohmmeter de tissu épithélial. Si les cellules ont atteint un TEER d'environ 500 Ω x cm², effectuer l'infection.
- Infecter les cellules avec la suspension bactérienne préparée à une multiplicité d'infection (MOI) de 10. Stockez les cellules infectées dans l'incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant la période de temps indiquée.
Remarque: Le MOI peut être calculé en prenant en compte le nombre de cellules par culture cellulaire élément filtrant à confluence (1.21 x 10 6 cellules / cm 2). - Arrêtez le infections en lavant trois fois avec du milieu sans sérum 500 ul (SFM) contenant de l'albumine de sérum bovin à 1% (BSA) appliquée sur le compartiment du filtre, 1 ml dans le compartiment inférieur.
- Poulie à 500 pi contenant un tampon GFD BSA à 1% dans le compartiment du filtre et 1 ml dans le compartiment inférieur pendant 20 min à température ambiante pour empêcher l'adhérence des anticorps dirigés contre des sites de liaison non spécifiques.
- Incuber avec 100 ul anticorps primaire anti- N. meningtidis α-OMP (1: 200) dans le compartiment du filtre et à 500 pi dans le compartiment inférieur pendant 20 min à température ambiante.
Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée. - Laver les cellules en aspirant le milieu à partir du compartiment de filtre, transférer la cartouche filtrante à un GFD puits avec 1 ml préparée contenant 1% de BSA et de remplir le compartiment du filtre à vide SFM 500 ul contenant 1% de BSA. Répéter deux fois cette étape.
- Fixer les cellules avec 500 pi 4% de formaldéhyde dans le compa filtrertement, 1 ml dans le compartiment inférieur pendant 10 min à température ambiante.
- Laver les cellules en aspirant le milieu à partir du compartiment de filtre, transférer la cartouche filtrante à un puits préparé avec 1 ml de PBS et remplir le compartiment du filtre vide avec 500 ul de PBS. Répétez cette étape une fois.
Remarque: Les échantillons peuvent être conservés pendant une nuit dans du PBS à 4 ° C. - Coupe la culture cellulaire fixe filtre des inserts et laver avec 250 pl de PBS contenant 1% de BSA. Incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante avec 250 ul fluorescent marqué (longueur d'onde d'excitation 594 nm) de poulet anticorps secondaire anti-lapin (1: 500) pour colorer les bactéries extracellulaires.
Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée. - Perméabiliser les cellules avec 250 pl de PBS contenant 1% de BSA et 0,5% de Triton X-100 pendant 1 heure à température ambiante. Laver les cellules trois fois avec 250 ul de PBS contenant 1% de BSA.
- Incuber avec 250 pi de l' anticorps primaire anti- N. meningitidis
- Appliquer 250 pi de marquage fluorescent (excitation de longueur d'onde 488 nm) d'anticorps secondaire (1: 500), marqué par fluorescence (excitation de longueur d'onde 660 nm) phalloïdine (1: 250) et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ( 1: 50 000) pendant 1 h à température ambiante pour colorer les bactéries extra- et intracellulaires, et les noyaux cytosquelette d'actine.
Remarque: Si nécessaire, la concentration en anticorps doit être titrée. - Laver les cellules trois fois avec 250 ul de PBS contenant 1% de BSA. Incluez les cellules dans un milieu et conserver à 4 ° C de montage jusqu'à l'examen par microscope.
- Déterminer le nombre de bactéries envahies par champ prédéfini. Pour ce faire, en comptant 20 champs par membrane filtrante. Calculer le pourcentage de bactéries envahies.
Remarque: Multipliez le nombre de bactéries moyenne des 20 champs microscopiques avec une Coeffic zoneient. Le résultat exprime la quantité de bactéries totales présentes dans un 0,33 cm² culture cellulaire élément filtrant. Diviser cette valeur par la quantité de bactéries cultivées dans un milieu pendant la durée de l'infection.
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Representative Results
Nous décrivons ici la culture et l'infection des cellules HIBCPP dans un système d'insert de culture cellulaire inversée. Ce modèle nous permet d'étudier les mécanismes d'invasion et les voies de signalisation moléculaire sous - jacents du côté de la cellule basolatérale, reproduisant une situation physiologique des bactéries diffusant et entrant dans les cellules épithéliales via le flux sanguin (Figure 1).
Les cellules HIBCPP afficher certaines fonctions de barrière, qui leur permettent de limiter l'échange moléculaire à un niveau minimal. Ce résultat est obtenu par l'expression de jonctions adhérentes (AJ) et les protéines des jonctions serrées (TJ). L' analyse par immunofluorescence des protéines associées TJ Occludin, Claudin et ZO-1 a révélé un signal continu au niveau des sites de contact cellule-cellule, ce qui démontre que les cellules sont reliées entre elles par des fils continus (TJ figure 2A, B, C). Une impression détaillée de til TJ morphologie a été obtenue par la transmission (figure 2D) et de geler la microscopie électronique à fracture (figure 2E), ce qui montre que TJs sont situés entre les cellules et forment de larges structures ressemblant à des câbles, maillés.
TJs des cellules épithéliales agissent également comme une barrière pour séparer les domaines de la membrane apicale et basolatérale, contribuant ainsi à la polarité cellulaire. Parmi les protéines qui sont exprimées exclusivement du côté de la cellule basolatérale des cellules HIBCPP, sont la protéine AJ E-cadhérine (Ecad) et le récepteur du facteur de croissance des hépatocytes (HGF / Met) comme montré par une analyse par immunofluorescence de la figure 3, montrant un certain niveau de polarité.
Lorsqu'elle est cultivée dans des conditions appropriées des cellules HIBCPP présentent également des fonctions de barrière typiques de la BCSFB comme la formation d'un potentiel de membrane, ainsi qu'une faible perméabilité à macromolecules. Détermination du potentiel de membrane peut être obtenue par mesure de la TEER par l'utilisation d'un voltohmmeter. La perméabilité de la couche cellulaire est quantifiée par l'application d'inuline marquée par FITC, un sucre qui passe de la couche d'une manière paracellulaire. Ici, nous montrons les résultats d'une expérience représentative, ce qui démontre que ces fonctions de barrière restent stables et ne présentent pas d'affection par des concentrations standard de diméthylsulfoxyde (DMSO), un solvant commun pour stimuler cellules chimiques. Comme on le voit sur la figure 4A, les valeurs TEER ont été enregistrées avant et après exposition des cellules au DMSO HIBCPP.
Les cellules présentaient un potentiel de membrane élevé qui atteint jusqu'à environ 500 Ω x cm au début de l'expérience pour toutes les conditions. La mesure de TEER n'a pas changé après 2 h pour les cellules traitées par jusqu'à 0,2% en volume de DMSO. En revanche, les valeurs TEER ont diminué dans une dose-dépendante wh Manneren volumes plus élevés ont été appliqués (figure 4A). Cette diminution du potentiel de membrane était concomitante à une augmentation de la perméabilité aux macromolécules. Considérant que l' addition de DMSO à des cellules HIBCPP jusqu'à 0,5% en volume n'a pas abouti à une augmentation de la perméabilité de l' inuline, 1% en volume et de 2% en volume affichent un effet, bien que dans une mesure limitée (figure 4B). En outre, nous avons vérifié l'influence de la cytochalasine D, un puissant inhibiteur de la polymérisation de l'actine, le potentiel membranaire et de la perméabilité des cellules HIBCPP. Le traitement des cellules avec le 1 pg / ml de cytochalasine D provoque une baisse significative des valeurs TEER ainsi qu'une augmentation du flux Inuline FITC (figure 4A, B). Cet effet peut être expliqué par l'ouverture de TJs causée par la cytochalasine D.
La lignée cellulaire HIBCPP comme modèle de la BCSFB peut être utilisé pour étudier les interactions entre les agents pathogènes et les cellules épithéliales formant barrière. Il existe des preuvesque la bactérie N. meningitidis gagne l' entrée dans le système nerveux central en traversant le BCSFB. Il a été démontré que les cellules de Neisseria envahissent HIBCPP spécifiquement du côté basolatéral de la cellule, qui est pertinente in vivo. Pendant ce processus , la capsule bactérienne joue un rôle important: les mutants de capsule dépourvue montrent une augmentation de l' invasion dans les cellules HIBCPP 5. Dans ce qui suit , nous avons comparé l' invasion basolatérale de la souche MC58 17, son mutant isogénique MC58siaD - déficientes pour la production de la capsule 17 et le support non encapsulé isoler α14 19,20. Cellules HIBCPP ont été infectées par les souches mentionnées ci - dessus sur un parcours de temps de 4 h à une MOI de 10. L' analyse par immunofluorescence a révélé une invasion importante pour les deux souches pathogènes MC58 et MC58siaD -, tandis que les taux d'invasion mineures ont été observées pour la souche α14 apathogène ( La figure 5A). Une image représentative de la double immunofluLa microscopie orescence des cellules HIBCPP infectées par la souche respective est représentée sur la figure 5A, B et C.
Figure 1:. Standard and Mobile Inverted Système de culture Dans le système de culture cellulaire standard (A, C) l' interaction des bactéries avec les cellules CP épithéliales peut être étudiée au niveau du côté de la cellule apicale, qui est indiqué par microvillosités. Le système de culture cellulaire inversée (B, D) nous permet d'étudier l' interaction bactérienne avec la membrane cellulaire basolatérale, qui est impliqué lors de l' invasion bactérienne via la circulation sanguine dans le SNC. Pour la culture cellulaire des cellules inversée (E) HIBCPP sont ensemencées sur le côté inférieur des éléments filtrants. Le puits inférieur comprenant le compartiment interne de la cartouche filtrante sont inondés avec le milieu. Subsequremment, le milieu en excès est aspiré de manière à ce que le compartiment interne de la cartouche du filtre reste rempli. Le premier jour après le semis, inserts de filtre de culture cellulaire sont retournées et remplies avec le milieu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Cellules HIBCPP Affichage Strands continu de TJs Les protéines TJ ZO-1 (A), Occludin (B) et Claudin-1 (C) ont été détectés dans les cellules HIBCPP. Panneaux AC montrent des images Apotome. Centre de chaque panneau: xy en vue de face des cellules; dessus et à droite: sections transversales de plusieurs tranches optiques à travers le z -Plane. Les barres d'échelle indiquent 10 um. La structure des cellules TJ HIBCPP a été analysée par TransmisLa microscopie électronique à sion. Les cellules sont reliées entre elles par JT, qui sont indiquées par les flèches (D). La barre d'échelle indique 1 um. Geler les études de microscopie électronique de fracture visualiser étroitement maillé brins TJ (E). La barre d'échelle = 0,5 um. Les images de cette figure ont été initialement publiés dans Schwerk et al, PloS One 7: e30069, doi:. 10.1371 / journal.pone.0030069 (2012); réimpression avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Expression des protéines réceptrices impliquées lors de l' invasion de bactéries dans HIBCPP cellules d' analyse d'immunofluorescence affiche expression de Ecad (A) et Met (B) du côté de la cellule basolatérale.. Le pictures montrent des images Apotome. Centre de chaque panneau: xy en vue de face des cellules; dessus et à droite: section transversale de plusieurs tranches optiques à travers le z -Plane. La membrane apicale des cellules HIBCPP (indiquées par des flèches) est positionnée vers le haut de la partie supérieure, ainsi que vers la droite, du côté droit, respectivement, de chaque trame. Les barres d'échelle = 10 pm. Les données de ce chiffre ont également été publiés précédemment dans Gründler et al, Microbes Infect 15: 291-301, doi:.. 10.1016 / j.micinf.2012.12.005 (2013); réimpression avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Influence de DMSO et cytochalasine D sur la fonction barrière de cellules HIBCPP Effets sur la barrière fonc.tion sont déterminées par la mesure des valeurs TEER et FITC-inuline Flux. Les résultats sont présentés pour une expérience représentative, qui a été réalisée en triple. Cellules HIBCPP ont été traités avec du DMSO ainsi que Cytochlalasin D dans les quantités indiquées pendant 2 heures. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Lorsqu'ils sont appliqués à des concentrations allant jusqu'à 0,2% en volume, le DMSO n'a pas d' incidence sur le potentiel membranaire (figure 4A). Des concentrations allant de 0,1% en volume jusqu'à 0,5% en volume de DMSO ne sont pas également une influence sur la perméabilité paracellulaire des cellules (figure 4B). En revanche, 1 pg / ml de cytochalasine D provoque une diminution de la TEER concomitante à une augmentation de FITC-inuline flux à travers la couche de cellules (figure 4A, B).
Figure 5: Invasion de N. meningitidis dans les cellules HIBCPP. Double immunofluorescence microscopie montre envahi (vert) et collées les bactéries (jaune). Boîtes blanches dans les images représentent le détail de l'image agrandie sur le côté droit. Invasion basolatéral a été observée pour N. meningitidis MC58 (A) et MC58siaD -, déficiente pour la production de la capsule (B), alors qu'un taux d'invasion mineure a été déterminée pour α14 (C). Le diagramme montre que les taux de MC58 et MC58siaD invasion - sont très importantes par rapport à α14 (**, p <0,01). Importance extrême est affichée lorsque MC58 ou MC58siaD -, respectivement, ont été comparés à α14 (***, p <0,001) et MC58siaD - a été comparée à MC58 (###, p <0,001). Echelle barres indicate 10 um. . Le schéma D a été publié dans Borkowski et al, J Neuroinflammation 11: 163, doi: 10.1186 / s12974-014-0163-x (2014); réimpression avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les cellules épithéliales du CP forment le BCSFB qui sépare le LCR de 2,3 sanguin. Nous avons récemment établi la lignée cellulaire HIBCPP comme un modèle humain fonctionnel du BCSFB. Les cellules présentent des fonctions de barrière importantes du BCSFB in vitro, y compris le développement d'un potentiel de membrane élevé, une faible perméabilité pour les macromolécules, ainsi que la présence de fils continus de TJs 5. Les protéines TJ contribuent à une polarité apicale / basolatérale des cellules. La polarité est d'une grande importance pour une localisation dirigée des récepteurs de surface ainsi que des protéines de transport spécifiques. Nous avons montré la localisation polaire des récepteurs ECAD et Met ainsi que les membres de la ATP-binding cassette (ABC) famille des transporteurs qui maintient un microenvironnement hautement contrôlé dans le SNC 6,7.
Il existe plusieurs micro-organismes qui sont capables de pénétrer dans le système nerveux central en surmontant la BCSFB, leading à une maladie grave , y compris la méningite 8. L' un des agents pathogènes qui sont capables d'envahir les cellules epitheliales en CP est la bactérie Gram négatif N. spécifique à l'humain meningitidis 9,10, ce qui a été montré pour pénétrer dans les cellules HIBCPP de façon polaire spécifique depuis le côté basolatéral de la cellule 5. Ceci est la direction physiologiquement pertinente de l'infection du cerveau à travers la BCSFB lorsque les bactéries et les cellules diffusent rencontre CP épithéliales à partir du sang au cours de la méningite. Pour tenir compte de cette situation in vitro, les cellules sont cultivées HIBCPP sur le côté inférieur du filtre. En contraste avec le modèle d'insertion de filtre standard, où les cellules sont ensemencées dans le compartiment supérieur, cette mise en place d'un système de culture inversée permet d'infecter les cellules épithéliales spécifiquement du côté de la cellule basolateral 5,21.
Invasion basolatérale dans les cellules HIBCPP a été observée pour les deux N. pathogènes meningitidis -, alors que le transporteur non pathogène isoler α14 affichés uniquement invasion marginale 15. Cela montre que le modèle de cellules HIBCPP offre la possibilité d'analyser des banques de mutants disponibles pour de nouveaux facteurs de virulence impliqués au cours du processus d'invasion. Il convient de noter, il a été démontré que d' autres agents pathogènes , y compris L. monocytogenes et Streptococcus suis (S. suis) envahissent les cellules HIBCPP de façon polaire 5,7.
Afin de reconnaître et de répondre aux micro - organismes envahisseurs dans le SNC, les cellules épithéliales du CP expriment PRRs 22,23. TLR représentent une famille importante dans les PRR. RT-PCR qualitative analyses ont démontré que les cellules expriment HIBCPP plusieurs TLR ainsi que des co-récepteurs apparentés et la molécule adaptatrice MyD88 15. Il a été observé que les récepteurs TLR2 et TLR4 sont impliqués dans la réaction de défense cellulaire à N. meningitidis polysaccharides capsulaires 24. D' autres résultats d'une approche microarray révélé que les cellules infectées par N. HIBCPP meningitidis afficher une induction des voies de transduction du signal, entre autres facteurs impliquant également le régulateur de transcription IκBζ 15, obligatoire pour l' expression de certains gènes cibles , y compris IL6 25,26, une cytokine pro-inflammatoire.
Pour confirmer ces résultats, les cellules infectées par N. HIBCPP meningitidis dans un système de culture inversée ont été utilisées pour étudier la libération de cytokines et de chimiokines. Il est connu que ce processus vise à susciter une réponse inflammatoire par l' activation du système immunitaire inné 13,14 de. cellules HIBCPP produire et sécréter des cytokines et des chimiokines, y compris CXCL1-3, l' IL6, l' IL8 et TNFa 15,16, qui ont été décrits pour attirer neutrophiles et des monocytes 27. En utilisant notre système, nous modèleont constaté que les neutrophiles, les monocytes et polymorphnuclear également les lymphocytes T migrent à travers les cellules HIBCPP 16,28, en soulignant que les cellules HIBCPP conviennent aux mécanismes de la migration transépithélial des cellules immunitaires déchiffrage.
Le système de modèle présenté ici offre également la possibilité d'apporter des modifications. cellules HIBCPP peuvent être prétraitées avec des anticorps ou des inhibiteurs chimiques pour identifier les récepteurs et voies de signalisation impliquées lors de l'infection. DMSO, un solvant commun pour les réactifs stimulant de cellules peut être appliquée dans des volumes appropriés aux cellules HIBCPP, qui présentent des fonctions de barrière stables qui ne sont pas affectés par les produits chimiques tout au long de temps étudié. Cette propriété est également pertinente pour l'utilisation du modèle dans les études pharmaceutiques.
Bien que nous avons démontré que les cellules HIBCPP montrent un certain niveau de polarité, ils ne reflètent pas naturellement tous les détails d'un modèle in vivo. <em> Par exemple , la localisation des membres de la famille des transporteurs ABC correspond que partiellement les motifs attendus 6, pourquoi applications pharmaceutiques peuvent probablement être appliquées dans une mesure restreinte. En outre, les cellules HIBCPP ne semblent pas produire le LCR (données non présentées). Néanmoins, nous avons constaté que les cellules HIBCPP expriment les protéines transthyrétine, l' insuline-like growth factor 2 (IGF2) et boîte de forkhead J1 (FOXJ1) au niveau de l' ARN 5, qui sont des protéines marqueurs caractéristiques de cellules CP épithéliales 29,30,31,32 . Cette observation soutient que les cellules HIBCPP ont conservé des propriétés typiques de cellules épithéliales CP. Surtout, il convient de noter que les cellules ne présentent pas HIBCPP inhibition de contact. Il est donc essentiel d'utiliser les cellules d'expérimentation lorsque les valeurs TEER appropriées sont atteintes. En outre, les cellules HIBCPP ne doivent pas être utilisés au-delà de passage 38, étant donné que le potentiel de développer une fonction de barrière semble tomber avec des passages plus élevés. Enfin, pour étudier l'impacte d'interactions entre les cellules au cours des infections au BCSFB un modèle de co-culture comprenant des CP épithéliales et endothéliales serait d'un grand intérêt, mais un tel modèle doit encore être développé.
En conclusion, le modèle de culture cellulaire HIBCPP peut être utilisée pour révéler principales voies d'invasion et les voies de transduction du signal sous-jacentes, en particulier des agents pathogènes spécifiques humains au BCSFB. Comme il est connu que les cellules épithéliales du CP sont également impliqués dans les troubles dégénératifs neurologiques , y compris la maladie d' Alzheimer, ainsi que la sclérose en plaques 2, ainsi que dans les métastases cérébrales des cellules tumorales 33, le système offre en général une grande variété de possibilités pour l'étude des mécanismes liés à la maladie, en fournissant le potentiel de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| 12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
| Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
| Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
| Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
| Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
| Insulin | Sigma | 19278 | |
| MgCl2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
| Proteose peptone | BD | 211684 | |
| Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
| Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
| Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |
References
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