Protocol
1. Tasarımı ve Uygun Sticky saplı Sipariş oligonükleotidler
- Serbestçe kullanılabilir çevrimiçi programları kullanarak genomik analiz yoluyla potansiyel rho-bağımsız sonlandırıcılar tanımlayın. 7
- Iki iplikçikli DNA ile çalışırken, sonlandırıcı yönü, test edilecek belirler. 7 PGR-Mavi plazmid, sadece en (ileri şerit) yön 3 '5' lige sonlandırıcılar doğrular.
- , Ücretsiz online yazılım kullanarak PGR-Blue test için APE, örneğin dizisi yeniden yönlendirmek için onun tersine tamamlayıcı bir alt (ters) iplik terminatör dönüştürün.
- oryantasyon doğru olduğu belirlendikten sonra, üst telin sonuna 5 'yapışkan sonu "5'-CGAC-3"' ekleyin. . Alt şeridinin sonuna 5 'yapışkan sonu "5'-CCGC-3"' Ekle 8 Bu o bağlanan insert uygun olarak eklenecektir sağlayacaktıryönlendirme GGA kullanılmıştır.
- dizileri belirlendikten sonra, ticari tek iplikli oligonükleotidler olarak sipariş.
2. Tavlama Oligonükleotidler (Dondurularak kurutulmuş DNA Sadece geçerlidir)
- 100 uM bir konsantrasyona nükleaz içermeyen su içinde Tek tek oligonükleotidler yeniden askıya.
- 1 M NaCl ve 100 mM Tris-HCI pH 7.4: 10 x dupleksleştirme tamponu sağlayın. Tavlama tamponu birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Dupleksleştirme tamponu yapılır ve oligonükleotidler yeniden süspanse edildikten sonra, tavlama 8 başlar.
- Her terminatör test edilecek, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne ultra saf su 16 ul ekleyin.
- Her mikrosantrifüj tüpüne 10x tavlama tampon 2 ul ekleyin.
- İstenilen terminatör gelen üst iplik oligonükleotid 1 ul (100 uM) ekleyin.
- İstenen terminatör arasında alt iplik oligonükleotid 1 ul (100 uM) ekleyin.
- kaynar su ba oluşturunsıcak bir plaka üzerinde musluk suyu ve yerin yaklaşık 400 ml içeren bir 1000 ml'lik beher kullanarak inci.
- float adım 2.6 mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin ve 4 dakika boyunca kaynatın. 4 dakika sonra, ısı plakası rahatsız edecek, ancak boru ayrılıp su banyosunda yavaş yavaş soğumaya O / N (18 saat) 8 yüzer. -20 ° C'de tavlanmış terminatörleri saklayın.
3. Golden Gate Meclisi (Standart Mix - Maliyet Etkin)
- tavlı terminatör 40 nM seyreltme yapın. tavlanmış sonlandırıcılar karışımı (100 mM) 1 ul nükleaz ücretsiz su 124 ul ekleyin.
- buz üzerinde 30 10,000 xg'de sn ve mağaza için santrifüj örnekleri.
- PCR için yeni bir tüp uygun kullanılan içine, nükleaz içermeyen su 6 ul ekleyin.
- 1 Ticari DNA ligaz tamponu ul [300 mM Tris-HCI (pH 7.7-7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, ve 10 mM ATP] ekleyin. Buz üzerinde sonraki tüm adımları uygulayın.
- eklemekPGR-Blue (35-50 ng / | il) mikrosantrifüj tüpüne, hedef plazmid 1 ul.
- mikrosantrifüj tüpüne 40 nM tavlanmış sonlandırıcılar 1 ul ekle.
- mikrosantrifüj tüpüne 0.5 ul ticari yüksek sadakat Bsal restriksiyon endonükleaz ekleyin.
- mikrosantrifüj tüpüne ticari DNA ligazı 0.5 ul ekle.
- 120 saniye boyunca 10,000 x g'de Reaksiyon karışımı santrifüjleyin. Sonra termalcycler doğrudan tüp yerleştirin.
- 37 ° C'de 15 dakika 1 döngü, ardından 16 ° C'de 1 dakika, ardından 37 ° C'de 1 dakika 20 döngü: PCR programı çalıştırın. Numunelerde hemen veya -20 ° C'de dondurularak saklayın. 8
4. Golden Gate Meclisi (Ticari Master Mix - Zaman Verimli)
- Bu 40 nM terminatör DNA konsantrasyonu sulandırır 2. adımda oluşturduğunuz sonlandırıcılar tavlı 100 mcM 1 ul nükleaz ücretsiz su 124 ul ekleyin.Yeni bu adımı gerçekleştirin, 1,5 ml'lik ependorf tüp etiketli.
- PCR için yeni bir tüp uygun içine, nükleaz serbest su 14 ul ekleyin. Yeni tüp buna göre etiketlenmiş olduğundan emin olun.
- mikrosantrifüj tüpüne Ticari Master Mix Tampon 2 ul ekleyin.
- mikrosantrifüj tüpüne PGR-Mavi plazmid 1 ul (35-50 ng / | il) ilave.
- mikrosantrifüj tüpüne 40 nM tavlanmış sonlandırıcılar 2 ul ekle.
- mikrosantrifüj tüpüne Ticari Master Mix 1 ul ekleyin.
- 120 saniye boyunca 10,000 x g'de 40 nM tüp santrifüjleyin. Sonra termalcycler doğrudan tüp yerleştirin.
- 55 ° C'de 15 dakika 1 döngü, ardından 37 ° C'de 60 dakika 1 döngü: PCR programı çalıştırın. Kullanım örnekleri -20 ° C 'de hemen veya dondurulması ve depolanması.
5. Dönüşüm ve Koloni Seçimi
- Hazırlayın 1 mM concentrat içeren Petri kapları ağar Luria Bankası (LB)ampisilin iyonu (Amp) ve arabinoz (ARB) içindeki bir 10 mM konsantrasyonu. Bu stok çözeltisi, daha sonraki kademelerde kullanım çünkü 1M L -arabinose stok çözeltisi en az 10 ml hazırlayın.
- Herhangi bir yüksek verimli kullanın (10 Ağustos - 10 Eylül transformant / mikrogram) kimyasal yetkili E. transformasyon için E. coli (JM109) hücreleri. En iyi sonuçlar için 9 yetkin hücre 50 ul ligasyon reaksiyonunun 3-5 ul ekle. Kimyasal yetkili hücreleri kullanırken, hücreler kullanılıyor özel dönüşüm protokolü uygulayın.
- steril L-şekilli "hokey sopası" kullanılarak agar plakaları önceden ısıtılmış LB (Amp / ARB) üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin yarısı (25 ul) yayıldı ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin. Nedeniyle ayrışma ampisilin hızlı oranına, 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe yoktur.
- görsel muayene ile renk dayalı koloni seçimi yapın. Başarılı bir ligasyonu / beyaz görünür ışıkta sarı olması ve unde yeşil floresan gerekirr mavi (450 nm) veya UV ışığı. 20 saat - Başarısız bir ligasyon 18 sonra görünür ışık altında mavi renkli bir koloni üretecek.
6. Doğrulama ve Terminator sayısallaştırılması
- 1 mM ampisilin ve arabinoz 10 mM 5 ml steril LB-suyu tüpleri hazırlayın. gerekli tüp sayısı, test edilen terminatörler ve kontrol ünitesinin (hücreler ampisilin direnci ile floresan değildir ve kesilmemiş PGR-Mavi plazmidi içeren hücreler) sayısına bağlıdır.
- Görünür ışık altında steril bir döngü kullanarak 2-3 / beyaz sarı koloniler (adım 5.4) seçin. Numuneler 37 ° C ve 16-18 saat süre ile 160 rpm'de bir çalkalama sıvılarında inkübe izin verin. fazla 24 saat süreyle bu örnekleri inkübe etmeyin.
- İsteğe bağlı olarak, yeterli hücre büyümesinin sağlanması için, 600 nm (OD 600) de optik hücre yoğunluğu belirlemek için bir spektrofotometre kullanmak. Genel olarak, 0.8-1.0 ~ bir OD 600 büyüme 16-18 saat sonra gözlenmiştir.
- kullanımsonraki adımlar için steril 96 oyuklu plaka. aseptik bir ortamda ve üç kopya halinde aşağıdaki adımları yürütün. her oyuğa steril LB + Amp / arabinoz suyu (1 mM ampisilin / 10 mM arabinoz) 199 ul ekleyin. üç ayrı kontroller için plaka üzerinde odası bulunmaktadır.
- Aşağıdaki üç kontrollerini kullanın: İyi (1) içeren LB + Amp / arabinoz suyu sadece ve iyi (2) (boş) dönüştürülmemiş kompetan hücreler boş olarak hizmet etmek için. ölçümü (3) sonlandırıcı gücü olmayan bir sonlandırma dizisi ile lige kesilmemiş ilk PGR ya içeren PGR-mavisi içeren hücreler (ölçümü için bir referans kontrol) dahil edilmelidir. Plaka okuyucu düzeni için Şekil 1'e bakınız.
- Pipet O hücre çözeltisi 1 ul / 96 oyuklu plakanın bireysel çukurlar halinde K et suları.
- Bir nefes kapaklı mühür plakaları ve 37 ° C'de 18-20 saat ve 160 rpm çalkalayın.
- Bir levha okuyucu ile okuyarak OD 600 belirler600 nm'de absorbans. Aşağıdaki gibi GFP floresan ölçün: uyarma 395 ve emisyon 509. Önlem RFP floresan şöyle: uyarma 575 ve emisyon 605. 18-20 saat sonra OD 600 yaklaşık 0,5 olmalıdır.
- büyüme varyasyon normalleştirmek için, denklem kullanmak:
GFP ve RFP hem. - normalleşme sonra, denklem kullanılarak göreceli terminatör gücünü belirlemek
GFP ve RFP hem. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, Golden Gate Meclisi (Şekil 2) kullanılarak GFP ve RFP arasında bağlandı bir sonlandırıcı ile PGR-Mavi içeren hücreleri üretecek. lige inserti ihtiva eden pozitif koloniler rengine göre seçilebilir. Görünür ışık pozitif koloniler / beyaz sarı olacaktır ve yanlış pozitif 37 ° C (Şekil 3) inkübasyon 18-20 saat sonra mavi koloniler üretecektir.
Koloni seçiminden sonra, bir plaka okuyucu terminatör gücünü belirlemek için kullanılabilir. kavramının kanıtı olarak, altı varsayılan sonlandırıcılar (T1-6) bioinformatically mikobakteriyofaj Bernal13 tespit edilmiştir. Şekil 4'te sonuçları bir kontrol olarak kesilmemiş / değiştirilmemiş PGR ifade eden hücreler ile göreli terminatör gücünü gösterir. öngörülen bir terminatör, bir GFP / RFP PGR benzer oranı (~ 0.0) ya da 0.1 altında varsa, o zaman sekansı bir terminatör vermeye tespit edilmiştir(T5 ve T6). Ancak, sayısal her onuncu artış Kontrole göre terminatör gücü bir kat artışı ifade etmektedir. Örneğin, T3 RFP'ye göre GFP yüksek bir oranına sahip ve kontrol ile karşılaştırıldığında, güçlü bir terminatör (Şekil 4) nitelendirildiği terminatör kuvvetinde 5-katlık bir artış (grafikte 0.5) gösterdi. Veri üç nüsha olarak toplanmış ve görsel temsili için ortalama edildi.
terminatör gücü ölçülmesi için en iyi referans kontrolü belirlemek için, bir terminatör olmayacak bilinen bir dizi ile klonlanmış hiçbir terminatör ve PGR-Mavi içeren orijinal BGK plazmid kullanarak ham verileri karşılaştırıldı. Her iki kontroller daha da önemlisi, benzer GFP / RFP oranlarını üretilen GFP ve RFP ifade (Şekil 5) ve benzer seviyelerde göstermiştir.
FPlaka Okuyucu Düzeni. Oda Detaylandırma ŞEKIL 1. S chematic üç ayrı kontroller (Yeşil) için plaka okuyucu dahil edilmelidir. Bir çukuru (1) ihtiva eden LB + Amp / arabinoz suyu yalnızca iyi olarak (2) (boşluk), dönüştürülmemiş hücreler için boş olarak hizmet vermektedir. ölçümü (3) sonlandırıcı gücü olmayan bir sonlandırma dizisi ile lige kesilmemiş ilk PGR ya içeren PGR-mavisi içeren hücreler (ölçümü için bir referans kontrol) dahil edilmelidir. (Sarı) plakanın geri kalanı, farazi terminatörler test etmek için de kullanılabilir. Üç nüsha olarak yetiştirilen ve analizden önce ortalama olarak tüm hücreleri önerilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. klonlama yerinin Yönlendirme ve ekspresyonuPGR-Mavi. AmilCP yapısal ifadesi (Mavi Kromo Protein) GFP ve RFP karşı (alt sicim) yönünde tahrik edilir. Bsal, AmilCP ve Bsal tanıma mevkileri ile sindirildiğinde çıkarılır ve test edilecek olan terminatör sürekli plasmid lige edilmiştir. üst sicim ve uygun yapışkan uçları olan bir sonlandırıcı alt şerit gösterilmektedir. AraC regülatörü ve ampisilin direnç genleri plazmid olan fakat gösterilen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. sonra Colony Seçim Klonlama. (A) PGR-Mavi / terminatör ligasyon (standart mix) ve hücre dönüşümden sonra Temsilcisi plaka. Mavi koloniler başarısız ligasyon ve beyaz / sarı col temsil(Okla gösterilen) onies başarılı ligasyonu bulunmaktadır. (B) dönüşümden sonra temsili koloniler gösteren aynı plaka suretinde uzaklaştırdınız. Arka plan rengi dijital ileri vurgu koloni renk farklılıkları değişmiş oldu. Dönüştürülmüş hücreler (E.coli -JM109) ampisilin ve arabinoz içeren LB agar plats ekildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PGR-Mavi. Altı putatif sonlandırıcılar altı farklı Terminatör Şekil 4. miktarının belirlenmesi (T1-6) bioinformatically mikobakteriyofaj Bernal13 tespit edilmiştir. Sonuçlar, göreli floresan gösterirler. Tüm sonuçlar bir kontrol olarak kesilmemiş / değiştirilmemiş PGR içeren hücreleri kullanılarak normalize edildi. T3 güçlü olduğu bulunmuşturterminatörü. Tüm sonuçlar, üç nüsha olarak yetiştirilen bireysel koloniler temsil ve görsel temsili için ortalama. Hata çubukları ortalama veri noktaları arasındaki sapmaları ifade etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kontroller Şekil 5. GFP ve RFP Anlatım. PGR-Mavi takılı kesilmemiş / değiştirilmemiş BGK ve iki farklı olmayan terminatör dizileri GFP ve RFP ifadesi. Tüm sonuçlar, üç nüsha olarak yetiştirilen bireysel koloniler temsil ve görsel temsili için ortalama. Hata çubukları ortalama veri noktaları arasındaki sapmaları ifade etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde en önemli adım sıralamaya uygun oligonükleotid tasarımı önceliklidir. oligonükleotitler, uygun yapışkan uçları GGA bütünleşik hale getirilmesi olası olduğundan emin olmak için, üst ve alt iplikler hem de 5 'uçlarına eklenen olmalıdır. Ayrıca, bakan sağ olduğu soldan bakan sonlandırıcılar (alt iplikçikteki transkripsiyonu durdurmak sonlandırıcılar) yönünü değiştirmek için önemli olan GFP ve RFP ifade bakan sağ olduğundan (üst ipliği sonlandırıcı (üst iplikçikteki transkripsiyonu sonlandırır) ) yönünde.
İki ayrı GGA protokolleri ve tampon karışımları PGR-in Blue sonlandırıcılar test etmek için kullanılır. Standart ekonomi karışımı ayrı ayrı ve daha sonra laboratuarda 8 karışık malzeme satın alma oluşur. İkinci protokol ticari önceden yapılmış GGA ana karışımı kullanır. her ikisi de çalışırken; Ticari master miks daha fazla zaman verimli ama standart karışıma kıyasla nispeten pahalıdır.Bir eğitim ortamında, önceden standart GGA karışımı yapmak ve bireysel öğrenci kullanımı için hacimde dondurmak için daha ekonomik olabilir.
GGA için PGR değiştirme ve renk seçimi için ters yönde amilCP eklenmesi sonucu, GFP ekspresyonu ve RFP kesilmemiş PGR-Mavi plazmid sınırlıdır ve göreli terminatörü gücünü belirlemede referans kontrol olarak kullanılmamalıdır. Ancak, tüm değişiklikler göreceli terminatör gücü doğru ölçümü için izin klonlama işlemi sırasında kaldırılır. orijinal modifiye edilmemiş PGR plazmid benzer sonuçlar kullanmak en iyisidir birlikte PGR-Blue bir terminatör olmamaya bilinen bir dizi klonlama ile elde edilebilir. Her iki kontrol, daha da önemlisi, eşit GFP düzeyleri ve RFP ekspresyonu (Şekil 5) ve gösterdi benzer bir GFP / TÇD olduğu saptanmıştır.
gen ifadesinin sıkı regülasyonu için, PGR-Mavi plazmid yapısal AraC regülatörü ifadehücre hattına bağlı pBAD (arabinoz uyarılabilir) promoteri. 10,11 yüksek arabinoz konsantrasyonu GFP ve RFP ekspresyonu için gerekli olabilir kullanılır. İyi sonuçlar E. içinde 10 mM arabinoz konsantrasyonu kullanılarak elde edildi coli hücre hattı JM109. Dönüştürülmüş hücreler / beyaz, sarı veya görünür ışık altında mavi ya olmalıdır. sadece yeşil floresan görmek ama pozitif dönüştürülmüş hücrelerde kırmızı değil UV ışığı veya mavi ışık (450 nm) altında, yaygındır. Bununla birlikte, RFP floresans plaka okuyucusu ile tespit edildi.
Bu protokol için kavramın kanıt olarak kullanılan terminatörler mikobakteriyofaj Bernal13 tespit edilmiştir. Bununla birlikte, PGR-Blue, E. çalışır E. coli ve bakterilerin diğer türleri ifade edilebilir, bir mekik vektörü değildir. Sonuç olarak biz tespit sonlandırıcılar ev sahibi ortamında işlev görecek tam olarak biliyorum ve potansiyel sınırlamadır kalmamasıdır. ifade kaseti ortakPGR-Blue ile D, geleneksel klonlama bölgeleri tarafından takviye edilir ve uygun bir mekik vektöründe taşınmış olabilir. Bu yüzden eğer istenirse bireysel araştırmacılar, kendi özel bakteri türlerine PGR-Mavi terzi için izin verecek.
Diğer yüksek verimli sekans analiz prosedürleri mevcut olmakla birlikte, çoğu ileri genetik yaklaşım kullanın. Bu yaklaşımlar yer yönlendirilmiş mutagenez veya oligo-sentez potansiyel dizi kombinasyonları binlerce. 12,13 kez oluşturulduğunda için yüzlerce oluşturmak için kullanın, her dizi değişiklik etkisi daha sonra Katalogda edilir. Ancak, PGR-Mavi, daha yönlendirilmiş ters genetik uygulama için tasarlanmıştır. Siliko yeni bir genomu analiz ederken, belirli bir alanda birden fazla potansiyel sonlandırıcılar gözlemlemek yaygındır. PGR-Mavi araştırmacılar hızla onları in vivo varsayılan dizileri test etmek için izin vererek siliko öngörülerin onların rafine yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Bu PGR terminatörü testi plasmi unutulmamalıdırD 582 dizileri 4 terminatör gücünü ölçmek için kullanılmıştır, ancak PGR bir kısıtlama enzimi düzeneği standart kullanır (örneğin, temel biyo-tuğla düzeneği (BBA)), göreceli olarak zaman alıcı klonlamanın GGA göre. 7 PGR-Mavi plazmid PGR benzer çalışması için tasarlanmıştır ancak daha hızlı bir klonlama işlemi ve koloni renk seçimi kullanır oldu. Bu modifikasyonlar, bizim basitleştirilmiş protokolü ile birlikte, eğitim ve araştırma odaklı laboratuarları hem PGR-Mavi uyarlanabilir olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Genomik ve Evrimsel Bilim ilerlemek faj Avcılar (SEA-fajlar) Programın - Yazarlar Aktif Öğretim Genom Konsorsiyumu (GCAT) ve HHMI-Fen Eğitimi İttifak ile Malcom Campbell ve Todd Eckdahl kabul etmek istiyorum.
Bu proje Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (P20RR016460) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (P20GM103429) hibe tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma hibe # IIA-1457888 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir. Ayrıca kurumsal (Ouachita Baptist Üniversitesi) fonları JD Patterson Yaz Araştırma Bursu ile sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
- Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
- Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
- Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
- Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
- Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
- Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
- Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
- Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).
