Protocol
1. Planung und Bestellung von Oligonucleotiden mit den entsprechenden Sticky Ends
- Identifizieren Sie potenzielle rho-unabhängige Terminatoren durch genomische Analyse Programme , die online frei verfügbar sind. 7
- Wenn sie mit doppelsträngiger DNA arbeiten, bestimmen die Orientierung des Terminators zu testen. 7 PGR-Blue - Plasmid nur Abbrechern in der 5 'zu 3' - Richtung auf der Oberseite (Vorwärtsstrang) ligiert prüft.
- Konvertieren Sie einen Boden (rückwärts) Strang Terminator seine umgekehrt Komplement der Sequenz zum Testen in pGR-Blau mit dem kostenlosen Online - Software neu zu orientieren, zum Beispiel ApE.
- Nachdem die Ausrichtung bestimmt wird, korrekt zu sein, fügen Sie das sticky end "5'-CGAC-3 '" an das 5'-Ende des oberen Stranges. Fügen Sie das sticky end "5'-CCGC-3 '" an das 5' - Ende des unteren Strang. 8 Dadurch wird sichergestellt , dass ligierte Insert wird in den entsprechenden eingefügt werdenmit GGA Orientierung.
- Sobald Sequenzen bestimmt werden, zu bestellen im Handel als Einzelstrang-Oligonukleotiden.
2. Ausglühen Oligonucleotides (Gilt nur für gefriergetrocknete DNA)
- Re-suspendieren einzelnen Oligonukleotide in Nuklease freiem Wasser zu einer Konzentration von 100 uM.
- Machen 10x Annealing-Puffer: 1 M NaCl und 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Annealing-Puffer kann bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. Sobald Anelierungspuffer hergestellt und Oligonukleotide erneut suspendiert sind, beginnen die Glühen 8.
- Für jeden Terminator getestet werden, 16 & mgr; l ultrareinem Wasser in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen.
- Fügen Sie 2 ul 10 fach Anelierungspuffer zu jedem Reaktionsgefäß.
- 1 ul des Obertrums Oligonukleotid (100 uM) von dem gewünschten Terminator.
- 1 ul des Untertrums Oligonukleotid (100 uM) von dem gewünschten Terminator.
- Erstellen eines Siedewasser-bath unter Verwendung von auf einer heißen Platte einen 1000-ml-Becher etwa 400 ml Leitungswasser und Ort enthalten.
- Legen Sie die Reaktionsgefäße aus Schritt 2.6 in einem Schwimmer und kochen für 4 min. Nach 4 min, drehen Sie die Heizplatte aber lassen Sie das Rohr und schweben im Wasserbad langsam abkühlen O / N (18 h) 8 ab. Speichern der geglühten Terminatoren bei -20 ° C.
3. Golden Gate Assembly (Standard Mix - Cost Efficient)
- Machen Sie eine 40 nM Verdünnung der angelagerten Terminatoren. In 124 ul Nuklease freiem Wasser auf 1 ul geglüht Terminatoren-Mix (100 & mgr; M).
- Zentrifugieren Sie die Proben für 30 Sekunden bei 10.000 × g und auf Eis lagern.
- In ein neues Röhrchen geeignet für den Thermocycler verwendet werden, fügen Sie 6 ul Nuclease freies Wasser.
- 1 & mgr; l handelsüblichen DNA - Ligasepuffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl 2, 100 mM DTT und 10 mM ATP]. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte auf dem Eis.
- Hinzufügen1 ul PGR-Blue (35-50 ng / ul) Ziel Plasmid mit dem Reaktionsgefäß.
- 1 & mgr; l der 40 nM geglühten Terminatoren an den Mikrozentrifugenröhrchen.
- In 0,5 ul kommerziellen High-Fidelity-BsaI Restriktionsendonuklease zum Reaktionsgefäß.
- In 0,5 ul kommerzieller DNA-Ligase an das Reaktionsgefäß.
- Zentrifugieren der Reaktionsmischung bei 10.000 × g für 120 Sekunden. Dann legen Sie den Schlauch direkt in den Thermocycler.
- Führen Sie die Thermocycler-Programm: 20 Zyklen von 1 min bei 37 ° C, gefolgt von 1 min bei 16 ° C, gefolgt von 1 Zyklus von 15 min bei 37 ° C. Verwenden Proben sofort oder einfrieren und bei -20 ° C. 8
4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - Zeit Efficient)
- In 124 ul nukleasefreiem Wasser zu 1 & mgr; l der 100 & mgr; M Terminatoren in Schritt erstellt geglüht 2. Dies schwächt die Terminator-DNA-Konzentration auf 40 nM.Führen Sie diesen Schritt in einem neuen, markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- In ein neues Röhrchen geeignet für den Thermocycler, fügen Sie 14 ul Nuklease freiem Wasser. Stellen Sie sicher, dass das neue Rohr entsprechend markiert ist.
- In 2 ul Gewerbe Master Mix Puffer zum Reaktionsgefäß.
- 1 ul PGR-Blau-Plasmid (35-50 ng / ul) zum Reaktionsgefäß.
- In 2 ul der 40 nM geglühten Terminatoren an den Mikrozentrifugenröhrchen.
- 1 & mgr; l Gewerbe Master Mix zum Reaktionsgefäß.
- Zentrifugieren Sie die 40 nM Röhrchen bei 10.000 × g für 120 Sekunden. Dann legen Sie den Schlauch direkt in den Thermocycler.
- Führen Sie die Thermocycler-Programm: 1 Zyklus von 60 min bei 37 ° C von 1 Zyklus von 15 min bei 55 ° C gefolgt. Verwenden Proben sofort oder einfrieren und bei -20 ° C.
5. Transformation und Kolonieselektion
- Bereiten Sie Luria Base (LB) Agar-Petrischalen mit 1 mM Konzentration Ampicillin (Amp) und eine 10 mM Konzentration von Arabinose (ARB). Bereiten Sie mindestens 10 ml 1 M L -Arabinose Stammlösung , da diese Stammlösung wird in späteren Schritten verwendet werden.
- Verwenden Sie einen hocheffizienten (10. August - 10. SEPTEMBER Transformanten / ug) chemisch kompetente E. coli (JM109) Zellen für die Transformation. 9 Für die besten Ergebnisse, 3-5 ul der Ligationsreaktion zu 50 ul kompetente Zellen hinzuzufügen. Wenn chemische kompetente Zellen verwenden, befolgen Sie die Transformationsprotokoll spezifisch für die Zellen verwendet wird.
- Die Hälfte (25 ul) der transformierten Zellen auf vorgewärmte LB (Amp / arb) Agarplatten einer sterilen L-förmigen "Hockeyschläger" mit und Inkubation O / N bei 37 ° C. Aufgrund der schnellen Geschwindigkeit der Zersetzung des Ampicillin, nicht inkubieren nicht über 24 h bei 37 ° C.
- Führen Kolonieselektion basierend auf Farbe durch visuelle Inspektion. Eine erfolgreiche Unterbindung sollte weiß / gelb in sichtbares Licht und fluoresziert grün under Blau (450 nm) oder UV-Licht. Ein erfolgloser Ligatur wird eine Kolonie produzieren, die nach 18 in Farbe unter sichtbarem Licht blau ist - 20 Stunden.
6. Überprüfung und Quantifizierung von Terminator
- Bereiten Sie 5 ml sterile LB-Brühe Röhrchen mit 1 mM Ampicillin und 10 mM Arabinose. Die Anzahl der Rohre erforderlich ist, ist abhängig von der Anzahl der Terminatoren getestet und Kontrollen (Zellen, die mit Ampicillin-Resistenz, die fluoreszieren, und die Zellen nicht den ungeschnittenen pGR Blau Plasmid enthält) wird.
- Unter sichtbarem Licht wählen Sie eine sterile Schleife mit 2-3 weiß / gelb Kolonien (Schritt 5.4). Lassen Sie die Proben bei 37 ° C und 160 rpm für 16-18 h in Brühen auf einem Schüttler inkubiert. Sie brüten nicht diese Proben für mehr als 24 Stunden.
- Optional können ein Spektrophotometer optische Zelle Dichte bei 600 nm (OD 600) , um zu bestimmen ausreichende Zellwachstum zu gewährleisten. Im Allgemeinen wird ein OD 600 von ~ 0,8-1,0 nach 16-18 h des Wachstums beobachtet.
- Benutzeneine sterile 96-Well-Platte für die verbleibenden Schritte aus. Führen Sie diese Schritte in einer aseptischen Umgebung und in dreifacher Ausfertigung. In 199 ul sterilem LB + Amp / Arabinose Brühe (1 mM Ampicillin / 10 mM Arabinose) in jede Vertiefung. Fügen Sie Platz auf der Platte für drei separate Steuerungen.
- Verwenden Sie die folgenden drei Steuerelemente: Ein gut (1) mit LB + Amp / Arabinose Brühe nur und ein gut (2) für nicht-transformierten kompetenten Zellen (leer) als Rohling zu dienen. Für die Quantifizierung (3) des Terminators Stärke, ungeschnittene ursprüngliche pGR enthaltenden Zellen oder mit einem Gehalt pGR-Blau mit einer nicht abbrechenden Sequenz ligiert sollte (Referenzsteuerung für die Quantifizierung) einbezogen werden. Siehe Abbildung 1 für Plattenleser Layout.
- Pipette 1 ul der Zelllösung aus dem O / N Brühen in einzelne Wells der 96-Well-Platte.
- Dichtungsplatten mit einer atmungsfähigen Deckel und schütteln für 18-20 Stunden bei 37 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute.
- Mit Hilfe eines Plattenlesegerät, bestimmen OD 600 durch LesenExtinktion bei 600 nm. Messen Sie GFP - Fluoreszenz wie folgt: Anregung 395 und Emission 509. Measure RFP Fluoreszenz wie folgt: Anregung 575 und Emission 605. Nach 18-20 h, die OD 600 sollte etwa 0,5 betragen.
- Um eine Veränderung der Wachstums normalisieren, verwenden Sie die Gleichung:
sowohl für GFP und RFP. - Nach der Normalisierung, bestimmen die Gleichung relativ Terminator Stärke unter Verwendung von
sowohl für GFP und RFP. 
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Representative Results
Dieses Protokoll wird produzieren Zellen pGR-Blau mit einem Terminator ligiert zwischen GFP und RFP mit Golden Gate Assembly (Abbildung 2) enthält. Positive Kolonien ligierte Insert enthält, kann auf der Grundlage Farbe ausgewählt werden. Im sichtbaren Licht werden positive Kolonien weiß / gelb und Fehlalarme werden blaue Kolonien nach 18-20 h Inkubation bei 37 ° C (Abbildung 3) zu erzeugen.
Nach Kolonieselektion kann ein Plattenleser verwendet werden Terminator Stärke zu bestimmen. Als Beweis für Konzept, sechs mutmaßliche Terminatoren (T1-6) wurden bioinformatisch im Mycobakteriophage Bernal13 identifiziert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 zeigen relativ Terminator Stärke mit Zellen, die ungeschnitten / unmodifizierten pGR als Kontrolle. Wenn ein vorhergesagter Terminator ein GFP / RFP-Verhältnis ähnlich wie pGR (~ 0,0) oder unter 0,1 hat, und dann wurde die Sequenz bestimmt kein Terminator(T5 und T6). Allerdings numerisch jeder zehnte Erhöhung stellt eine fache Erhöhung der Terminator Stärke im Vergleich zur Kontrolle. Zum Beispiel hatte T3 ein hohes Verhältnis von GFP - Expression im Vergleich zu RFP und zeigte einen 5-fachen Anstieg (0,5 auf Graph) in Kraft Terminator als im Vergleich zur Kontrolle und war ein starker Terminator (Abbildung 4) berücksichtigt. Die Daten wurden in dreifacher Ausfertigung gesammelt und gemittelt für die visuelle Darstellung.
Um die beste Referenz-Steuerung für das Quantifizieren Terminator Stärke bestimmen, verglichen wir Rohdaten die ursprüngliche pGR Plasmid unter Verwendung, die kein Terminator und pGR-Blau mit einer Sequenz geklont nicht bekannt, ein Terminator sein. Beide Kontrollen zeigten ähnliche Niveaus der GFP und RFP Ausdruck (5) und, noch wichtiger, ähnlich GFP / RFP - Verhältnissen hergestellt.
Fild 1. S Chematic Detaillierung Plate Reader - Layout. Raum sollte für drei separate Regler (grün) auf dem Plattenleser enthalten sein. Ein gut (1) mit LB + Amp / Arabinose Brühe nur und ein gut (2) für nicht-transformierten kompetenten Zellen (leer) als Rohling zu dienen. Für die Quantifizierung (3) des Terminators Stärke, ungeschnittene ursprüngliche pGR enthaltenden Zellen oder mit einem Gehalt pGR-Blau mit einer nicht abbrechenden Sequenz ligiert sollte (Referenzsteuerung für die Quantifizierung) einbezogen werden. Der Rest der Platte (gelb) verwendet werden putative Terminatoren zu testen. Es wird alle Zellen vorgeschlagen in dreifacher Ausfertigung und gemittelt werden, bevor Analyse gezüchtet werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Klonierungsstelle Orientierung und Expression vonpGR-Blau. konstitutive Expression AmilCP (blau Chromo Protein) in der entgegengesetzten (Untertrum) Richtung GFP und RFP angetrieben. Wenn mit BsaI, AmilCP und die BsaI Erkennungsstellen verdaut werden entfernt und der Terminator dauerhaft in das Plasmid ligiert werden getestet. Der Obertrum und Untertrum eines Terminators mit den entsprechenden klebrigen Enden gezeigt. Die AraC Regler und Ampicillin - Resistenzgene in das Plasmid sind aber nicht gezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Colony Auswahl nach Cloning. (A) Repräsentative Platte nach pGR-Blau / Terminator Ligatur (Standard - Mix) und Zelltransformation. Blaue Kolonien repräsentieren erfolglose -Ligationen und weiß / gelb colOnies (durch einen Pfeil gekennzeichnet) sind erfolgreich -Ligationen. (B) A in Bild von der gleichen Platte vergrößert zeigt repräsentative Kolonien nach der Transformation. Die Hintergrundfarbe wurde digital auf weiteres Highlight Kolonie Farbunterschiede verändert. Die transformierten Zellen (E.coli -JM109) wurden auf LB - Agar flicht plattiert , die Ampicillin und Arabinose. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Quantifizierung von sechs verschiedenen Terminatoren in pGR-Blau. Sechs mutmaßliche Terminatoren (T1-6) wurden bioinformatisch im Mycobakteriophage Bernal13 identifiziert. Die Ergebnisse zeigen relative Fluoreszenz. Alle Ergebnisse wurden normalisiert Zellen enthält ungeschnitten / unmodifizierten pGR als Kontrolle verwendet wird. T3 wurde festgestellt, ein stark seinTerminator. Alle Ergebnisse stellen einzelne Kolonien in dreifacher Ausfertigung gewachsen und gemittelt für die visuelle Darstellung. Die Fehlerbalken stellen Abweichungen zwischen gemittelten Datenpunkte. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. GFP und RFP Expression in den Kontrollen. Die Expression von GFP und RFP in ungeschnitten / unmodifizierten pGR und zwei verschiedenen nicht-Terminator - Sequenzen eingefügt in pGR-Blau. Alle Ergebnisse stellen einzelne Kolonien in dreifacher Ausfertigung gewachsen und gemittelt für die visuelle Darstellung. Die Fehlerbalken stellen Abweichungen zwischen gemittelten Datenpunkte. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die richtige Oligonukleotid-Design bis zur Bestellung vor. Die Oligonukleotide müssen die entsprechenden klebrigen Enden sowohl an die 5'-Enden der oberen und unteren hinzugefügt Stränge, um sicherzustellen, dass GGA Einbau möglich ist. Darüber hinaus ist es wichtig, die Ausrichtung von links mit Blick auf Terminatoren (Terminatoren, die Transkription auf dem Untertrum stoppen), die der rechten Verblendung (endet Transkription auf dem oberen Strang) Terminatoren weil GFP und RFP-Expression ist in der rechten Verblendung (Obertrum zu wechseln ) Richtung.
Zwei getrennte GGA Protokolle und Puffermischungen verwendet werden, zu testen, Terminatoren in pGR-Blau. Die Standard-Economy - Mix besteht aus Materialeinkauf einzeln und dann 8 im Labor gemischt. Das zweite Protokoll verwendet eine kommerzielle vorgefertigten GGA Master-Mix. Während beide gut funktionieren; der kommerzielle Mastermix ist zeiteffizienter ist aber relativ teuer im Vergleich zur Standard-Mix.In einer Ausbildung Einstellung, kann es wirtschaftlicher sein, den Standard-GGA-Mix im Voraus zu machen, und Aliquote für einzelne Schüler Verwendung einfrieren.
Als Ergebnis der pGR für GGA Modifizieren und Hinzufügen amilCP in der umgekehrten Orientierung für die Farbauswahl, die Expression von GFP und RFP wird in dem ungeschnittenen pGR Blau Plasmid begrenzt und nicht als Referenzkontrolle verwendet werden sollte, wenn die relative terminator Festigkeit zu bestimmen. Es werden jedoch alle Änderungen während des Klonprozess für eine genaue Quantifizierung der relativen Stärke Terminator ermöglicht entfernt. Während es am besten ist es, die ursprünglichen unveränderten pGR Plasmid um ähnliche Ergebnisse zu verwenden, können durch Klonen einer Sequenz nicht in pGR-Blau sein, um einen Terminator bekannt sind, erreicht werden. Beide Kontrollen zeigten gleiche Niveaus von GFP und RFP Ausdruck (5) und, was noch wichtiger ist , hatten ähnliche GFP / RFP Verhältnissen.
Für strenge Regulierung der Genexpression, zum Ausdruck bringt PGR-Blau Plasmid konstitutiv den AraC Reglerdes pBAD (Arabinose induzierbaren) Promoter. 10,11 auf der Zelllinie verwendet Je eine hohe Arabinose - Konzentration für die Expression von GFP und RFP erforderlich. Gute Ergebnisse wurden mit einer Konzentration von 10 mM Arabinose in den E. erreicht coli - Zelllinie JM109. Transformierte Zellen sollten entweder weiß / gelb oder blau unter sichtbarem Licht. Unter UV-Licht oder blauem Licht (450 nm), ist es eine grüne Fluoreszenz zu sehen, aber nicht rot in positiv transformierten Zellen nur gemeinsam. Allerdings wurde RFP Fluoreszenz mit dem Plattenlesegerät erkannt.
Die Terminatoren als Proof of Concept für dieses Protokoll verwendet wurden in der Mycobakteriophage Bernal13 identifiziert. Allerdings funktioniert pGR-Blau nur in E. coli und es ist nicht ein Shuttle - Vektor, der in anderen Spezies von Bakterien exprimiert werden kann. Das Ergebnis ist, dass wir nicht genau wissen, wie die identifizierten Terminatoren in ihrer Host-Umgebung funktionieren würde und eine mögliche Einschränkung. Die Expressionskassette Gesellschafterd mit pGR-Blau wird durch traditionelle Klonierungsstellen flankiert und könnte auf einen geeigneten Shuttle-Vektor verschoben werden. Dies würde erlauben, einzelne Forscher pGR-Blau auf ihre spezifischen Bakterienart zuzuschneiden, wenn dies gewünscht wird.
Zwar gibt es andere sind verfügbar Hochdurchsatz-Sequenzanalyseverfahren verwenden die meisten einen vorderen Genetik Ansatz. Diese Ansätze verwenden gerichtete Mutagenese oder Oligo-Synthese Hunderte bis Tausende von möglichen Sequenzkombinationen zu erzeugen. 12,13 Einmal erstellt, die Wirkung jeder Sequenz Modifikation wird dann katalogisiert. Allerdings PGR-Blau für eine gerichtete reversen Genetik Anwendung entwickelt. Wenn ein neuartiges Genom in silico Analyse ist es üblich , mehrere potentielle Terminatoren in einem bestimmten Gebiet zu beobachten. pGR-Blau wurde entwickelt , die Forscher ihre schnell verfeinern in silico Vorhersagen zu helfen , indem sie mutmaßliche Sequenzen in vivo zu testen. Es sollte PGR Terminator Prüfung plasmi zu beachten,d verwendet wurde Terminator Stärke in 582 Sequenzen 4 quantitativ zu bestimmen, jedoch pGR verwendet eine Restriktionsenzym Montage Standard (zB Grund Bio-Ziegel - Baugruppe (BBA)), eine relativ zeitaufwendig Klonprozess zu GGA verglichen. 7 PGR-Blau - Plasmid verwendet aber eine schnellere Klonierungsverfahren und kolonieFarbAuswahl wurde entwickelt, ähnlich wie pGR zu funktionieren. Diese Modifikationen, zusammen mit unserem vereinfachten Protokoll, machen pGR-Blau anpassungsfähig sowohl Bildung und Forschung orientierte Labore.
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Acknowledgments
Autoren möchten Malcom Campbell und Todd Eckdahl mit dem Genome Consortium for Active Teaching (GCAT) und dem HHMI-Science Education Alliance bestätigen - Phage Hunters Advancing Genomics und Evolutions Science (SEA-Phagen) Programm.
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources (P20RR016460) und dem National Institute of General Medical Sciences (P20GM103429) von den National Institutes of Health. Diese Forschung wurde teilweise von der National Science Foundation unter Gewährung # IIA-1457888 unterstützt. Zusätzlich institutionelle (Ouachita Baptist University) Mittel wurden durch die JD Patterson Summer Research Fellowship zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
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