Protocol
1.设计和使用适当的粘性末端的寡核苷酸排序
- 确定通过基因组分析使用的是免费提供的在线课程潜在的Rho-独立的终结。7
- 当用双链DNA的工作，决定终止的取向来进行测试。7 PGR-蓝质粒只验证在5结扎'到3'的顶部（正向链）的方向终止子。
- 转换底部（反向）链终止其反向补充，重新调整顺序使用免费在线软件PGR-蓝测试， 如猿。
- 方向被确定为正确后，添加粘底“5'-CGAC-3”'5'顶链的末端。的粘性末端“5'-CCGC-3'”添加到5'和底链的末端。8这将确保连接的插入件将在适当的插入定向使用GGA。
- 一旦序列测定，顺序单链寡核苷酸市场。
2.退火寡核苷酸（仅适用于冻干DNA）
- 重悬在无核酸酶的水个体寡核苷酸的100μM的浓度。
- 使10×退火缓冲液：1M NaCl的和100mM的Tris-HCl pH 7.4的。退火缓冲液可以储存在4℃几周。一旦退火缓冲液是由和寡核苷酸重新悬浮，开始退火8。
- 对于每个要测试的终止子，添加16微升的超纯水至1.5ml微量离心管中。
- 加入2微升10X退火缓冲液中向每个离心管中。
- 从期望终止子加入1μl顶链寡核苷酸（100μM）。
- 从期望终止子加入1μl底链寡核苷酸（100μM）。
- 创建沸水巴次使用含有在热板上大约400毫升自来水和地点的一个1000毫升烧杯中。
- 将步骤2.6在浮动的离心管，煮4分钟。 4分钟后，关火板，但留下的管漂浮在水浴中缓慢冷却O / N（18小时），8。存放于-20℃退火终结。
3.金门大会（标准混合 - 成本效率）
- 使退火终结的40纳米的稀释。加入124μL核酸自由水至1微升退火终结混合（100微米）。
- 离心样品以10,000 xg离心30秒并储存在冰上。
- 为配合新的管适用于热循环，增加6μL核酸自由水。
- 加入1μl商业DNA连接酶缓冲液[300mM的Tris-盐酸（pH值7.7-7.8），100mM的MgCl 2的，100毫摩尔DTT，和10mM ATP]。执行冰的所有后续步骤。
- 加1微升PGR-蓝（35-50纳克/微升）的目标质粒的离心管。
- 加入1μl的40纳米退火终结到离心管中。
- 加入0.5微升商业高保真BsaI限制性内切酶的离心管中。
- 加入0.5微升的商业DNA连接酶的离心管中。
- 离心在10,000rpm xg离心120秒的反应混合物。然后直接放在管进入热循环。
- 运行热循环程序：在37℃下20个循环1分钟，然后以1分钟，在16℃下，随后1个循环的15分钟，在37℃。使用的样品，立即冻结或并储存在-20°C。8
4.金门大会（商业预混 - 时间效率）
- 加入124μL核酸自由水的1微升100μM退火步骤2中创建这削弱了终止DNA浓度至40nm终结的。在执行新的这一步，标示1.5 ml离心管。
- 进入一个新的适合于热循环管中，加入14微升核酸自由水。确保新管相应标记。
- 加入2微升商业预混缓冲液的离心管中。
- 添加PGR-蓝质粒1μL（35-50纳克/微升）的离心管中。
- 加入2微升的40纳米退火终结到离心管中。
- 加入1μl商业预混到离心管中。
- 离心40纳米管在10000 XG 120秒。然后直接放在管进入热循环。
- 运行热循环程序：在37℃1个循环的60分钟，随后1个循环的15分钟在55℃。使用的样品，立即冻结或并储存在-20°C。
5.转型与殖民地的选择
- 准备卢里亚基地（LB）琼脂含1毫米concentrat培养皿氨苄西林离子（AMP）和阿拉伯糖（ARB）的10毫米的浓度。制备至少10毫升1 M L -arabinose原液因为此储备溶液会在后面的步骤中使用。
- 使用任何高效率（10月8日至十月九日转化子/微克）化学感受态大肠杆菌 （JM109）细胞转化。9为了达到最佳效果，加3-5微升连接反应至50μl感受态细胞。当使用化学感受态细胞，遵循针对正在使用的细胞转化协议。
- 传播一半（25微升）的转化的细胞到预热的LB（安培/ ARB）琼脂使用无菌L形“曲棍球”平板上并在37℃孵育O / N。由于氨苄青霉素的分解的速度迅速，不于37℃经24小时孵育。
- 根据通过目测颜色进行菌落筛选。一个成功的结扎应该是白色/可见光黄色和绿色荧光理解过程- [R蓝（450纳米）或紫外光。一个不成功的连接会产生一个殖民地是在18后在可见光下颜色为蓝色 - 20小时。
6.核查和终结者的量化
- 制备5-毫升无菌LB-肉汤管用1mM氨苄青霉素和10mM阿拉伯糖。需要管的数目是依赖于被测试的终止子加对照（细胞以氨苄青霉素抗性不发荧光和含有未切割PGR-蓝质粒的细胞）的数目。
- 在可见光下使用挑无菌环2-3白色/黄色菌落（步骤5.4）。允许样品在肉汤，在37℃和160转16-18小时孵育振荡器上。不孵育这些样品在超过24小时。
- 任选地，使用分光光度计，以确定在600nm（OD 600）的光的细胞密度，以确保有足够的细胞生长。一般来说，〜0.8-1.0的OD 600后增长16-18小时的观察。
- 使用无菌96孔板的其余步骤。进行在无菌环境中，并以一式三份这些步骤。加入199微升无菌LB +安培/阿拉伯糖肉汤（1毫米氨苄西林/ 10毫米阿拉伯糖），每个井。包括在平板上三个独立控制的房间。
- 使用以下三个控件：只有一口井（1）含有LB +安培/阿拉伯糖肉汤和好（2）未转化的感受态细胞（空白）作为空白。用于定量（3）的终止子强度，含有未切割的原始PGR或含PGR-蓝与非终止序列连接单元应包括（为量化参考控制）。参见图1酶标仪布局。
- 吸管1μl的来自澳细胞溶液/ N肉汤到96孔板的各个孔中。
- 密封板具有透气盖，摇晃在37℃18〜20小时，160转。
- 使用读板器，通过读确定OD 600吸光度在600nm处。测量GFP荧光如下：激发395，发射509测量的RFP荧光如下：激发575，发射605 18-20小时后，将OD 600应为大约0.5。
- 为了归在生长变化，使用的公式：
对于GFP和RFP。 - 标准化后，确定相对实力终止使用公式
对于GFP和RFP。 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议将产生含PGR-蓝用金门组装（ 图2）的GFP和RFP之间连接一个终止子的细胞。可以根据颜色来选择含有连接插入阳性菌落。在可见光阳性菌落将白/黄和假阳性将在37℃（ 图3）后培养18-20小时产生蓝色菌落。
菌落筛选后，读板器可用于确定终止子的强度。由于概念证明，六公认的终结（T1-6）中的分枝杆菌Bernal13进行生物信息学鉴定。 图4中的结果表明，用表达未切割/未修饰的PGR作为对照的细胞的相对终止子强度。如果预测的终止子具有类似于PGR一个GFP / RFP比值（〜0.0）或低于0.1，则该序列被确定为不是一个终止（T5和T6）。然而，每个数字增加第十代表终结强度相对于控制倍。例如，T3有GFP表达相对于RFP的高比例，并作为与对照相比，被认为是一个强终止子（ 图4）显示出在终止子强度的5倍的增加（0.5上图）。数据被收集在一式三份，平均为视觉表示。
要确定定量终结者实力的最佳参考对照，我们比较使用不含终止和PGR-蓝已知不是一个终止序列克隆原来的PGR质粒的原始数据。两个控件显示GFP和RFP的表达（ 图5）和，相似水平更重要的是，产生了类似的GFP / RFP比值。
Figure 1.小号电气原理详图平板阅读器布局，房间应包括在酶标仪为三个独立的控制（绿色）。良好（1）含有LB +安培/阿拉伯糖肉汤只和未转化的感受态细胞（空白）井（2）作为一个空白。用于定量（3）的终止子强度，含有未切割的原始PGR或含PGR-蓝与非终止序列连接单元应包括（为量化参考控制）。在该板（黄色）的剩余部分可以被用来测试推定的终止子。建议所有的细胞，一式三份进行培养，并分析前的平均值。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：克隆网站的定位及表达PGR-蓝。AmilCP的组成型表达（蓝蛋白染色体）被GFP和RFP的相反（下链）的方向推动。当用BsaI，AmilCP和BsaI识别位点消化除去和要测试的终止子被永久地连接到质粒。顶链和与适当的粘性末端终止子的底链被示出。该阿糖胞苷调节器和氨苄青霉素抗性基因的质粒，但没有显示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.后菌落筛选克隆。（A）PGR-蓝/终止结扎（标准混合）和细胞转化后，代表板块。蓝色菌落代表不成功结扎和白/黄山坳onies（由箭头指示）是成功的结扎。 （B）在展示改造后的代表殖民地同板块的图像缩放。背景颜色被改变的数字进一步突出菌落颜色差异。转化细胞（ 大肠杆菌 -JM109）接种在含氨苄青霉素和阿拉伯糖LB琼脂制地图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.六个不同的终结者在定量PGR-蓝六公认的终结（T1-6）中的分枝杆菌Bernal13进行生物信息学鉴定。结果表明相对荧光。使用含未切割/未修改PGR作为控制单元的所有结果正常化。 T3被认为是一个强有力的终止符。所有的结果代表一式三份个人成长殖民地和平均的视觉表现。误差棒代表平均数据点之间的偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. GFP和RFP表达的控制。GFP和RFP的未切割/未修改的植物生长调节剂和两种不同的非终止序列插入PGR-蓝表达。所有的结果代表一式三份个人成长殖民地和平均的视觉表现。误差棒代表平均数据点之间的偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这个协议中最重要的步骤是正确的寡核苷酸设计之前订购。寡核苷酸必须具有适当的粘性末端加入到顶部和底部链二者的5'端，以确保GGA掺入是可能的。此外，为左朝向的终止子（终止子即停止对底链转录）的方向切换到右侧面对它是重要的（终止于顶链转录）终止子，因为GFP和RFP的表达是在正确的朝向（顶链方向）。
两个单独GGA协议和缓冲混合物可以用来在PGR-蓝测试终止子。标准的经济结构由物资采购在实验室8间，然后混合。第二个协议使用商用预制的GGA预混。虽然这两种工作良好;商业主结构是更多的时间效率，但相比标准混合相对昂贵。在一个教育环境中，可能更经济，使标准GGA混合提前，并冷冻供学生个人用等分试样。
作为改性PGR为GGA并在选色相反方向加入amilCP的结果，绿色荧光蛋白和表达RFP的未切割的PGR-蓝质粒被限制并确定相对终止子强度时不应该被用作参考对照。然而，所有的修改都在克隆过程中，允许相对于终止子强度的适当的量化除去。虽然最好是使用原始未修改PGR质粒类似的结果可以通过克隆已知不被终止子成PGR-蓝色的顺序来实现。两个控件显示GFP的相等的水平和RFP的表达（ 图5），更重要的是，也有类似的GFP / RFP比值。
对于基因表达的调节紧张时，PGR-蓝质粒组成性表达阿糖胞苷调节所述的pBAD（阿拉伯糖诱导型）启动子。10,11取决于细胞系中使用的高阿拉伯糖浓度可能需要的GFP和RFP的表达。使用在大肠杆菌的10mM阿拉伯糖的浓度了良好的结果取得大肠杆菌株JM109。转化细胞应该是白色/黄色或可见光下的蓝色。在UV光下或蓝色光（450纳米），是很常见的只看到绿色荧光但在正转化的细胞而不是红色。然而，使用读板器检测RFP荧光。
作为概念证明该协议的终止符在分枝杆菌Bernal13进行鉴定。然而，PGR-蓝只能在E.大肠杆菌和它是不是可以在其他物种的细菌中表达的穿梭载体。其结果是，我们不知道究竟是如何确定的终结将在其主机环境中发挥作用，是一个潜在的局限性。表达盒准ð与PGR-蓝是由传统的克隆位点侧接，并且可以移动到一个适当的穿梭载体。这将允许个人研究者PGR-蓝定制他们的特定细菌菌种来说，如果需要的话。
虽然有其他的高通量测序分析程序使用，使用最多的一个正向遗传学方法。这些方法使用位点定向诱变或寡聚合成以产生数百至数千潜在序列的组合。12,13一旦创建，每个序列修饰的效果然后编目。然而，PGR-蓝是专为一个更直接的反向遗传学应用。当分析在硅片的新型基因组中，这是常见的在给定的区域来观察多个潜在终止子。 PGR-蓝旨在帮助研究人员很快被允许他们体内试验的推定序列完善其在硅片预测。应当指出的PGR终止测试plasmi天得到了用于定量终结者力量582序列4，但是PGR采用了限制性酶组装标准（ 例如 ，基本生物砖组件（BBA）），一个比较费时克隆过程相比，GGA。7 PGR-蓝质粒被设计为功能类似于PGR，但使用更快速的克隆程序和菌落颜色选择。这些修改，我们简化协议一起，使PGR-蓝适应教育和研究型实验室。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
作者要感谢马尔科姆·坎贝尔和托德Eckdahl与基因组协会的Active教学（GCAT）以及霍华德休斯医学研究所，科学教育联盟 - 噬菌体猎人推进基因组学和进化科学（SEA-噬菌体）计划。
这个项目是由国家研究资源中心（P20RR016460）和通用医学科学院卫生全国学院研究所（P20GM103429）资助。这项研究部分由美国国家科学基金会的资助下＃IIA-1457888的支持。此外机构（沃希托浸会大学）资金通过JD帕特森暑期研究奖学金提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
- Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
- Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
- Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
- Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
- Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
- Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
- Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
- Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).
