Protocol
תכנון 1. Oligonucleotides הזמין עם הקצוות הדביקים המתאימים
- זהה terminators Rho-עצמאית פוטנציאליים באמצעות ניתוח גנטי באמצעות תוכניות שכרגע מחוברים לאתר גלוי. 7
- כשעובדים עם DNA גדילי כפול, לקבוע את הכיוון של terminator להיבדק. 7 הפלסמיד-כחול PGR רק מאמתת terminators ligated ב 5 'ל 3' כיוון על החלק העליון (גדיל קדימה).
- המרת terminator גדיל תחתון (הפוך) כדי להשלים התהפך שלה לארגון מחדש של הרצף לבדיקות PGR-הכחולה באמצעות תוכנה ברשת בחינם, למשל, APE.
- לאחר האורינטציה נקבעת כנכון, להוסיף את הקצה הדביק "5'-CGAC-3" "ל -5" סוף הגדיל העליון. מוסיף את הקצה הדביק "5'-CCGC-3" "ל -5" סוף הגדיל התחתון. 8 פעולה זו תבטיח כי כנס ligated יוכנס המתאיםאוריינטציה באמצעות GGA.
- לאחר רצפים נקבעים, להורות כמו oligonucleotides גדילי יחיד מסחרי.
2. Oligonucleotides חישול (חל רק על מיובשים בהקפאה DNA)
- Re- להשעות oligonucleotides בודדים במים חינם nuclease לריכוז של 100 מיקרומטר.
- הפוך חיץ חישול 10x: 1 M NaCl ו 100 mM Tris-HCl pH 7.4. חיץ חישול יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. לאחר חיץ חישול הוא עשה oligonucleotides מחדש תלוי, להתחיל את החישול 8.
- עבור כל terminator להיבדק, להוסיף 16 μl של מים טהורים כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
- הוסף 2 μl של חיץ חישול 10x על צינור אחד microcentrifuge.
- הוסף 1 μl של oligonucleotide הגדיל העליון (100 מיקרומטר) מן terminator הרצוי.
- הוסף 1 μl של oligonucleotide הגדיל התחתון (100 מיקרומטר) מן terminator הרצוי.
- צור ba מים רותחיםה באמצעות מבחנה 1,000 מ"ל המכיל כ 400 מ"ל של מי ברז ומניחים על צלחת חמה.
- מניחים את הצינורות microcentrifuge משלב 2.6 ב לצוף ומרתיחים במשך 4 דקות. לאחר 4 דקות, לכבות את צלחת חום אבל להשאיר את הצינור לצוף באמבטיה מים O מגניב לאט / N (18 שעות) 8. אחסן את terminators annealed ב -20 ° C.
3. אסיפת שער זהב (Mix הרגיל - עלות יעילה)
- הפוך דילול 40 ננומטר של terminators המרותק. להוסיף 124 μl של מים nuclease חופשי 1 μl של תמהיל terminators annealed (100 מיקרומטר).
- צנטריפוגה דגימות עבור 30 שניות ב XG 10,000 ולאחסן על הקרח.
- לתוך מתאים צינור חדש עבור thermocycler בשימוש, להוסיף 6 μl של מי nuclease חינם.
- הוסף 1 μl של מסחרי DNA האנזים הצפת [300 mM Tris-HCl (pH 7.7-7.8), 100 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ DTT, ו -10 מ"מ ATP]. ביצוע כל הצעדים הבאים על קרח.
- לְהוֹסִיף1 μl של PGR-כחול (35-50 ng / μl) פלסמיד היעד אל הצינור microcentrifuge.
- הוסף 1 μl של terminators annealed 40 ננומטר אל הצינור microcentrifuge.
- הוסף 0.5 endonuclease הגבלת μl המסחרי באיכות הגבוהה BsaI אל צינור microcentrifuge.
- הוסף 0.5 μl של אנזים דנ"א המסחרי אל צינור microcentrifuge.
- צנטריפוגה תערובת התגובה ב XG 10,000 עבור 120 שניות. אז במקום צינור ישירות לתוך thermocycler.
- הפעל את התוכנית thermocycler: 20 מחזורים של 1 דקות ב 37 ° C ואחריו 1 דקות ב 16 מעלות צלזיוס, ואחריו 1 מחזור של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. 8
4. אסיפת שער זהב (מיקס מאסטר מסחרי - זמן יעיל)
- להוסיף 124 μl של מים nuclease חופשי 1 μl של 100 מיקרומטר annealed terminators שנוצרה בשלב 2. זה מדלל את ריכוז ה- DNA terminator ל -40 ננומטר.בצע פעולה זו בדרך חדשה, שכותרתו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
- לתוך מתאים צינור חדש עבור thermocycler, מוסיף 14 μl מי nuclease חינם. ודא הצינור החדש מסומן בהתאם.
- הוסף 2 μl של מסחר מיקס מאסטר הצפת צינור microcentrifuge.
- הוסף 1 μl של פלסמיד PGR-כחול (35-50 ng / μl) אל הצינור microcentrifuge.
- הוסף 2 μl של terminators annealed 40 ננומטר אל הצינור microcentrifuge.
- הוסף 1 μl של מסחר מיקס מאסטר אל צינור microcentrifuge.
- צנטריפוגה הצינור 40 ננומטר ב XG 10,000 עבור 120 שניות. אז במקום צינור ישירות לתוך thermocycler.
- הפעל את התוכנית thermocycler: 1 מחזור של 60 דקות ב 37 ° C ואחריו 1 מחזור של 15 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. השתמש דגימות מיד או להקפיא ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
טרנספורמציה 5. בחירת קולוני
- הכין המאגר לוריא (LB) אגר צלחות פטרי המכילות 1 מ"מ תרכיזיםיון של אמפיצילין (AMP) וכן ריכוז 10 מ"מ של arabinose (ARB). הכן לפחות 10 מ"ל של 1 M L -arabinose פתרון המניות, כי פתרון המניות זה ישמש צעדים מאוחר יותר.
- השתמש בכל יעילות גבוהה (אוגוסט 10 - ספטמבר 10 transformants / מיקרוגרם) כימי E. המוסמכת coli (JM109) תאים לטרנספורמציה. 9 לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להוסיף 3-5 μl של תגובת הקשירה 50 μl של תאים מוסמכים. בעת שימוש תאים מוסמכים כימיים, לעקוב אחר פרוטוקול השינוי ספציפי לתא בשימוש.
- מורחים מחצית (25 μl) של תאים טרנספורמציה על מחומם מראש LB (Amp / ARB) צלחות אגר באמצעות "מקל הוקי" סטרילי בצורת L דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס. בשל קצב הפירוק המהיר של אמפיצילין, לא לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
- לבצע בחירת מושבה המבוססת על צבע על ידי בדיקה ויזואלית. קשירה מוצלחת צריכה להיות לבנה / צהובה אור הנראה לזרוח ירוק undeכחול r (450 ננומטר) או אור UV. קשירה מוצלחת תפיק מושבה כי הוא בצבע כחול תחת אור הנראה לאחר 18 - 20 שעות.
אימות 6. וכימות של Terminator
- הכן 5 מ"ל צינורות LB-מרק סטרילית עם אמפיצילין 1 מ"מ ו 10 מ"מ arabinose. מספר הצינורות הדרושים תלוי במספר terminators הנבדקת בתוספת שולטת (תאים עם התנגדות אמפיצילין שאינו לזרוח ותאים המכילים פלסמיד PGR-הכחול נימול).
- תחת אור הנראה לבחור 2-3 מושבות לבנות / צהובות (שלב 5.4) באמצעות לולאה סטרילי. אפשר דגימות כדי לדגור broths על שייקר ב 37 ° C ו 160 סל"ד במשך 16-18 שעות. אין דגירת דגימות אלה במשך יותר מ -24 שעות.
- לחילופין, השתמש ספקטרופוטומטר לקבוע צפיפות התאים אופטי ב 600 ננומטר (OD 600) כדי להבטיח צמיחת תאים נאותה. באופן כללי, OD של 600 ~ 0.8-1.0 הוא ציין לאחר 16-18 שעות של צמיחה.
- להשתמשצלחת 96-היטב סטרילי עבור השלבים הנותרים. לנהל את הפעולות הבאות בסביבה היגיינית בשלושה עותקים. להוסיף 199 μl של מרק LB + Amp / arabinose סטרילית (1 מ"מ אמפיצילין / 10 מ"מ arabinose) זה טוב. כלול חדר על הצלחת במשך שלוש בקרות נפרדות.
- השתמש בפקדים שלוש הבאות: באר (1) המכיל LB + Amp / arabinose מרק רק ובאר (2) עבור תאים המוסמכות untransformed (ריק) כדי לשמש ריק. עבור כימות (3) של כוח terminator, התאים המכילים PGR המקורי נימול או PGR-כחול המכיל ligated עם רצף הפסקת עישון צריך להיות כלול (שליטה התייחסות כימות). ראה איור 1 עבור פריסת קורא צלחת.
- Pipet 1 μl של פתרון התא מן O / broths N לתוך בארות בודדות של הצלחת 96-היטב.
- צלחות חותמות עם כיסוי לנשימה ולנער עבור 18-20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 160 סל"ד.
- באמצעות קורא צלחת, לקבוע OD 600 על ידי קריאהספיגה ב 600 ננומטר. מדוד GFP קרינה כדלקמן: קרינת RFP מדוד עירור 395 ופליטת 509 כדלקמן: עירור 575 ופליטה 605. לאחר 18-20 שעות, OD 600 צריך להיות כ 0.5.
- כדי לנרמל עבור וריאציה בצמיחה, השתמש המשוואה:
הן GFP ו RFP. - לאחר נורמליזציה, לקבוע כוח terminator ביחס באמצעות המשוואה
הן GFP ו RFP. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה יהיה לייצר תאים המכילים PGR-כחול עם terminator ligated בין ה- GFP ו RFP באמצעות שער זהב עצרת (איור 2). מושבות חיוביות המכילות כנס ligated ניתן לבחור על בסיס צבע. באור נראה מושבות חיוביות תהיינה לבנות / צהובות חיוביים שגוי תפקנה מושבות כחולות לאחר 18-20 שעות של דגירה על 37 ° C (איור 3).
לאחר בחירת מושבה, קורא צלחת יכול לשמש כדי לקבוע כוח terminator. כהוכחת מושג, שש terminators המשוערת (T1-6) זוהתה bioinformatically ב mycobacteriophage Bernal13. התוצאות באיור 4 להפגין עוצמה קטלנית יחסית עם תאים המבטאים PGR נימול / ללא שינוי כביקורת. אם מסיים חזה יש יחס GFP / RFP דומה PGR (~ 0.0) או מתחת 0.1, אז הרצף היה נחוש לא להיות קטלני(T5 ו T6). עם זאת, מבחינה מספרית כל עלייה עשירית מייצגת גידול של פי כוח terminator ביחס לשליטה. לדוגמא, היה T3 יחס גבוה של ביטוי GFP ביחס RFP והראה עלייה של 5 פי (0.5 על גרף) בחוזק terminator לעומת מלא נחשב terminator חזק (איור 4). הנתונים נאספו בשלושה עותקים בממוצע עבור ייצוג חזותי.
כדי לקבוע את שליטת המקור הטוב ביותר עבור quantitating כוח terminator, השווינו נתונים גולמיים באמצעות פלסמיד PGR המקורי המכיל לא terminator ו PGR-כחול משובטים עם רצף ידוע לא להיות קטלנית. שולטת הן הראו רמות דומות של ה- GFP וביטוי RFP (איור 5), וחשוב יותר, המיוצר יחסי RFP GFP / דומים.
Figure 1. chematic S המפרט פלייט Reader פריסה. החדר צריך להיכלל על הקורא צלחת במשך שלוש בקרות נפרדות (ירוק). באר מים (1) המכיל מרק LB + Amp / arabinose רק ובאר (2) עבור תאי מוסמכות untransformed (ריק) כדי לשמש ריק. עבור כימות (3) של כוח terminator, התאים המכילים PGR המקורי נימול או PGR-כחול המכיל ligated עם רצף הפסקת עישון צריך להיות כלול (שליטה התייחסות כימות). שאר הצלחת (הצהובה) יכול לשמש כדי לבדוק terminators המשוערת. הוא הציע כל התאים להיות מבוגר בשלושה עותקים בממוצע לפני הניתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. אוריינטציה שיבוט אתר וביטויPGR-כחול. ביטוי המכונן של AmilCP (חלבון כרומו כחול) הוא מונע בכיוון ההפוך (גדיל התחתון) של ה- GFP ו RFP. לאחר העיכול עם BsaI, AmilCP ואת אתרי הכרה BsaI יוסרו terminator להיבדק הוא ligated לצמיתות לתוך פלסמיד. הגדיל העליון הגדיל תחתון של terminator עם הקצוות דביקים המתאימים מוצג. גני התנגדות רגולטור אמפיצילין AraC נמצאים פלסמיד אך לא מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. בחירת קולוני לאחר שיבוט. (א) צלחת נציג לאחר קשירת PGR-כחול / Terminator (תמהיל סטנדרטי) וטרנספורמציה התא. מושבות בכחול מייצגות קשירת צלח col לבן / צהובonies (מסומן בחץ) הוא קשירה מוצלחת. (ב) הגדלה תמונה של אותה צלחת מראה מושבות נציג לאחר השינוי. צבע הרקע שונה דיגיטלי עד הבדלי צבע מושבת שיא נוסף. תאים שהשתנו (E.coli -JM109) היו מצופים על plats אגר LB המכיל אמפיצילין ו arabinose. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. כימותים של שישה Terminators השונה PGR-כחול. שש terminators המשוערת (T1-6) זוהו bioinformatically ב mycobacteriophage Bernal13. תוצאות להראות קרינה יחסית. כל התוצאות היו מנורמל באמצעות תאים המכילים PGR נימול / ללא שינוי כביקורת. T3 נמצאה להיות חזקשליחות קטלנית. כל התוצאות מייצגות מושבות בודדות גדלו בשלושה עותקים בממוצע עבור ייצוג חזותי. ברי שגיאה מייצגים סטיות בין נקודות נתונים ממוצעות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. GFP והביטוי RFP ב בקרות. הביטוי של ה- GFP ו RFP ב נימול / ללא שינוי PGR ושני רצפים שאינם terminator שונים מוכנס לתוך PGR-כחול. כל התוצאות מייצגות מושבות בודדות גדלו בשלושה עותקים בממוצע עבור ייצוג חזותי. ברי שגיאה מייצגים סטיות בין נקודות נתונים ממוצעות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעד החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא עיצוב oligonucleotide הנכון לפני ההזמנה. Oligonucleotides חייבת להיות הקצוות הדביקים המתאימים הוסיפו אל קצוות "5 של הן בשורה העליונה והן גדילים תחתונים כדי להבטיח כי התאגדות GGA אפשרית. בנוסף, חשוב לעבור את הכיוון של terminators מול שמאלה (terminators לזה לעצור שעתוק על הגדיל התחתון) לזה של זכות מול (מסתיים שעתוק על הגדיל העליון) terminators כי ביטוי GFP ו RFP הוא בפינה הימנית מול (גדיל עליון ) כיוון.
שני פרוטוקולי GGA נפרדים ותערובות חיץ יכולים לשמש כדי לבדוק terminators ב PGR-כחול. תמהיל רגיל המשק מורכב רכישת חומרי בנפרד ולאחר מכן מעורבב במעבדה 8. הפרוטוקול השני משתמש תערובת אמן מסחרית מוכנה GGA. בעוד שניהם עובדים היטב; מיקס מאסטר המסחרי הוא יותר זמן יעיל אבל הוא יחסית יקר בהשוואה לתערובת הסטנדרטית.בסביבת חינוך, זה עשוי להיות חסכוני יותר לעשות את מיקס GGA תקן מראש ולהקפיא aliquots לשימוש סטודנטי פרט.
כתוצאה שינוי PGR עבור GGA והוספת amilCP בכיוון ההפוך לבחירה צבע, ביטוי של GFP ו RFP מוגבלת הפלסמיד PGR-כחול נימול ולא אמור לשמש כביקורת התייחסות בעת קביעת חוזק terminator יחסית. עם זאת, כל השינויים יוסרו במהלך תהליך השיבוט המאפשר כימות נכון של כוח terminator יחסית. למרות שזה עדיף להשתמש תוצאות דומות פלסמיד המקורי ללא שינוי PGR יכולה להיות מושגת על ידי שיבוט רצף ידוע לא להיות קטלנית לתוך PGR-כחול. מפקח על שני הראה רמות שווות של GFP וביטוי RFP (איור 5), וחשוב יותר, היה יחס GFP / RFP דומה.
לרגולציה הדוקה של ביטוי גנים, הפלסמיד PGR-כחול constitutively מבטא הרגולטור AraCשל אמרגן pBAD (arabinose מושרה). 10,11 בהתאם לקו התא המשמש ריכוז arabinose גבוה עשוי להידרש על מנת לתת ביטוי GFP ו RFP. תוצאות טובות הושגו באמצעות ריכוז של arabinose 10 מ"מ E. שורת תאים coli JM109. התאים שהשתנו צריך להיות גם לבן / צהוב או כחול תחת האור הנראה. תחת אור UV או אור כחול (450 ננומטר), מקובל לראות רק פלואורסצנטי ירוק אבל לא אדום בתאים טרנספורמציה באופן חיובי. עם זאת, קרינת RFP זוהתה באמצעות קורא הצלחת.
Terminators לשמש הוכחה של קונספט עבור פרוטוקול זה אותרו mycobacteriophage Bernal13. עם זאת, PGR-כחול עובד רק ב E. coli וזה לא וקטור הסעות שיכולים לבוא לידי ביטוי מינים אחרים של חיידקים. התוצאה היא כי אנחנו לא יודעים בדיוק איך terminators המזוהה יתפקד בסביבת המארח שלהם הוא מגבלה פוטנציאלית. החברה הכלולה קלטת ביטויד עם PGR-הכחול הוא מוקף אתרי שיבוט מסורתי תוכל לעבור לחדר וקטור הסעות מתאים. יכולת זו תאפשר לחוקרים פרטיים כדי להתאים PGR-כחול למינים חיידקי הספציפיים שלהם, אם רוצים כל כך.
אמנם יש רצף תפוקה גבוהה אחרים נהלי ניתוח זמינים, רוב להשתמש בגישת גנטיקה קדימה. גישות אלה להשתמש mutagenesis האתר מכוון או-סינתזת אוליגו לייצר מאה עד אלף שילובי רצף פוטנציאליים. 12,13 לאחר יצירתם, ההשפעה של כל שינוי רצף מקוטלג מכן. עם זאת, PGR-כחול מיועד יישום גנטיקה הפוכה מכוונת יותר. כאשר מנתחים הגנום רומן סיליקון, מקובל להתבונן terminators פוטנציאל מרובים באזור נתון. PGR-כחול נועד לסייע לחוקרים במהירות לחדד שלהם תחזיות סיליקון בכך שהוא מאפשר להם לבדוק רצפים המשוערת in vivo. זה יש לציין את plasmi בדיקות terminator PGRד שימש לכמת כוח terminator ב 582 רצפים 4, אולם PGR משתמשת תקן הרכבה הגבלה-אנזים (למשל, הרכבה ביו-לבנים בסיסיים (BBA)), תהליך השיבוט זמן רב יחסית לעומת GGA. 7 הפלסמיד PGR-כחול תוכנן לתפקד באופן דומה PGR אבל משתמשת בחירת צבע המושבה תהליך השכפול מהירה יותר. שינויים אלה, יחד עם הפרוטוקול הפשוט שלנו, להפוך PGR-הכחול וישים למעבדות היא אורינטצית החינוך ומחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות מלקולם קמפבל וטוד Eckdahl עם קונסורציום הגנום להוראת פעילים (GCAT) והברית החינוך HHMI-מדע - ציידים הפאג קידום ג'נומיקס ומדע אבולוציונית (SEA-פאגים) תוכנית.
פרויקט זה מומן על ידי תרומות של המרכז הלאומי לחקר משאבים (P20RR016460) לבין המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (P20GM103429) מן המכון הלאומי לבריאות. מחקר זה מומן בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע תחת IIA-1457888 # מענק. בנוסף מוסדיים (אואצ'יטה המטביל אוניברסיטת) קרנות נמסרו דרך מלגת מחקר קיץ JD פטרסון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
- Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
- Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
- Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
- Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
- Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
- Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
- Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
- Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).
