Protocol
1. Progettazione e ordinare oligonucleotidi con le appropriate Sticky Ends
- Identificare i potenziali terminatori Rho-indipendente attraverso l'analisi genomica utilizzando programmi che sono liberamente disponibili online. 7
- Quando si lavora con DNA a doppio filamento, determinare l'orientamento del terminatore da testare. 7 Il plasmide PGR-Blue verifica solo terminatori legatura in 5 'a 3' sulla parte superiore (filamento in avanti).
- Convertire un fondo (reverse) Strand terminatore al suo complemento invertita per riorientare la sequenza di test in PGR-blu utilizzando il software gratuito on-line, ad esempio, scimmia.
- Dopo l'orientamento è determinato per essere corretta, aggiungere alla fine appiccicoso "5'-CGAC-3 '" al 5' estremità del filo superiore. Aggiungere fine appiccicoso "5'-CCGC-3 '" al 5' estremità del filo inferiore. 8 Questo assicurerà che inserto legatura sarà inserito nell'appositoorientamento utilizzando GGA.
- Una volta che le sequenze sono determinati, ordinare come singoli oligonucleotidi bloccati commercialmente.
2. ricottura oligonucleotidi (si applica solo a liofilizzato DNA)
- Risospendere singoli oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 pM.
- Fare 10x tampone ricottura: 1 M NaCl e 100 mM Tris-HCl pH 7,4. buffer di ricottura può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. Una volta buffer di ricottura è fatto e oligonucleotidi sono ri-sospesi, iniziare la ricottura 8.
- Per ogni terminazione da testare, aggiungere 16 ml di acqua ultra-pura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Aggiungere 2 ml di 10x tampone di ricottura ad ogni provetta.
- Aggiungere 1 ml di oligonucleotide filo superiore (100 micron) dal terminatore desiderato.
- Aggiungere 1 ml di oligonucleotide fondo filamento (100 micron) dal terminatore desiderato.
- Creare un bollente ba acquaesimo con un bicchiere di 1.000 ml contenente circa 400 ml di acqua di rubinetto e posto su un piatto caldo.
- Mettere le provette da microcentrifuga dal punto 2.6 in un galleggiante e far bollire per 4 minuti. Dopo 4 minuti, spegnere il calore a piastre, ma lasciare il tubo e galleggiare nel bagno d'acqua per raffreddare lentamente O / N (18 ore) 8. Conservare le terminazioni ricotto a -20 ° C.
3. Golden Gate Assembly (Mix Standard - Costo efficiente)
- Fare un nM diluizione dei terminatori ricotto 40. Aggiungere 124 ml di acqua priva di nucleasi di 1 ml di Terminator mix ricotto (100 micron).
- campioni di centrifugazione per 30 secondi a 10.000 xg e memorizzare sul ghiaccio.
- In un nuovo tubo appropriata per il termociclatore in uso, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi.
- Aggiungere 1 ml di commerciale DNA Ligase Buffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl 2, 100 mM DTT, e 10 mm ATP]. Eseguire tutti i passaggi successivi su ghiaccio.
- Aggiungere1 ml di PGR-blu (35-50 ng / ml) plasmide destinazione alla provetta.
- Aggiungere 1 ml di i 40 nm terminatori ricotto alla provetta.
- Aggiungere 0,5 microlitri commerciale ad alta fedeltà BsaI endonucleasi di restrizione alla provetta.
- Aggiungere 0,5 microlitri di DNA ligasi commerciale alla provetta.
- Centrifugare la miscela di reazione a 10.000 xg per 120 sec. Quindi inserire il tubo direttamente nel termociclatore.
- Eseguire il programma termociclatore: 20 cicli di 1 minuto a 37 ° C seguita da 1 min a 16 ° C, seguiti da 1 ciclo di 15 min a 37 ° C. Utilizzare i campioni immediatamente o congelare e conservare a -20 ° C. 8
4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - tempo efficiente)
- Aggiungere 124 ml di acqua priva di nucleasi a 1 l di 100 micron terminazioni creato nel passaggio 2. Questo diluisce la concentrazione di DNA di terminazione a 40 nm ricottura.Eseguire questo passaggio in una nuova, etichettato 1,5 ml provetta.
- In un nuovo tubo appropriata per il termociclatore, aggiungere 14 ml di acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che il nuovo tubo è etichettato di conseguenza.
- Aggiungere 2 ml di Commercial Master Mix Buffer alla provetta.
- Aggiungere 1 ml di PGR-Blue plasmide (35-50 ng / mL) alla provetta.
- Aggiungere 2 ml di i 40 nm terminatori ricotto alla provetta.
- Aggiungere 1 ml di Commercial Master Mix alla provetta.
- Centrifugare il tubo di 40 Nm a 10.000 xg per 120 sec. Quindi inserire il tubo direttamente nel termociclatore.
- Eseguire il programma termociclatore: 1 ciclo di 60 min a 37 ° C seguita da 1 ciclo di 15 min a 55 ° C. Utilizzare i campioni immediatamente o congelare e conservare a -20 ° C.
5. Trasformazione e selezione Colony
- Preparare Luria Base (LB) piastre di agar Petri contenenti 1 mM concentratione di ampicillina (Amp) e una concentrazione di 10 mM di arabinosio (ARB). Preparare almeno 10 ml di 1 M L -arabinose soluzione madre perché questa soluzione madre verrà utilizzato nei passaggi successivi.
- Utilizzare qualsiasi alta efficienza (10 8 - 10 9 trasformanti / mg) E. chimicamente competente coli (JM109), le cellule per la trasformazione. 9 Per ottenere i migliori risultati, aggiungere 3-5 ml della reazione legatura a 50 ml di cellule competenti. Quando si usano le cellule chimici competenti, seguire il protocollo di trasformazione specifico per le cellule utilizzate.
- Stendere la metà (25 ml) delle cellule trasformate sul pre-riscaldato LB (Amp / ARB) piastre di agar utilizzando una sterile forma di L "bastone da hockey" e incubare O / N a 37 ° C. A causa del rapido tasso ampicillina di decomposizione, non incubare a 37 ° C superiore a 24 ore.
- Eseguire la selezione delle colonie in base al colore mediante ispezione visiva. Una legatura di successo deve essere di colore bianco / giallo in luce visibile e fluorescenza verde undeR blu (450 nm) o la luce UV. Una legatura successo produrrà una colonia che è di colore blu sotto la luce visibile dopo 18 - 20 ore.
6. Verifica e quantificazione dei Terminator
- Preparare 5 ml sterili tubi LB-brodo con 1 mM ampicillina e 10 mm arabinosio. Il numero di tubi necessari dipende dal numero di terminatori essere testati più controlli (cellule con resistenza all'ampicillina che non fluorescenti e cellule contenenti l'uncut plasmide PGR-blu).
- Sotto la luce visibile raccogliere 2-3 colonie bianche / gialle (passo 5,4) utilizzando un'ansa sterile. Permettere ai campioni di incubare in brodi su un agitatore a 37 ° C e 160 rpm per 16-18 ore. Non incubare questi campioni per più di 24 ore.
- Facoltativamente, utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità cellulare ottica a 600 nm (OD 600) per garantire un'adeguata crescita cellulare. In generale, un diametro esterno 600 di ~ 0,8-1,0 si osserva dopo 16-18 ore di crescita.
- Usouna piastra a 96 pozzetti sterili per i passaggi rimanenti. Eseguire questi passaggi in un ambiente asettico e in triplicato. Aggiungere 199 ml di brodo sterile LB + Amp / arabinosio (1 mM ampicillina / 10 mM arabinosio) in ciascun pozzetto. Includere camera sul piatto per tre comandi separati.
- Utilizzare i seguenti tre controlli: solo un bene (1) contenente brodo / arabinosio LB + Amp e un pozzo (2) per le cellule competenti non trasformate (vuote) per servire come un vuoto. Per la quantificazione (3) della forza terminatore, cellule contenenti non tagliati PGR originale o contenenti PGR-blu legatura con un non-terminazione sequenza dovrebbero essere incluse (controllo di riferimento per la quantificazione). Vedere la Figura 1 per il layout lettore di piastre.
- Pipettare 1 ml di soluzione di cella dal O / N brodi in singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti.
- piastre di tenuta con una copertura traspirante e agitare per 18-20 ore a 37 ° C e 160 giri al minuto.
- Utilizzando un lettore di piastre, determinare OD 600 con la letturaassorbanza a 600 nm. Misurare la fluorescenza GFP come segue: eccitazione 395 ed emissione 509. Misura RFP fluorescenza come segue: eccitazione 575 ed emissione 605. Dopo 18-20 ore, l'OD 600 deve essere di circa 0,5.
- Per normalizzare le variazioni nella crescita, utilizzare l'equazione:
sia per la GFP e RFP. - Dopo la normalizzazione, determinare la resistenza di terminazione relativa utilizzando l'equazione
sia per la GFP e RFP. 
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Representative Results
Questo protocollo produrrà cellule contenenti PGR-blu con un terminatore legatura tra la GFP e RFP utilizzando il Golden Gate di montaggio (Figura 2). colonie positive contenenti inserto legatura possono essere selezionati in base al colore. Alla luce visibile colonie positive saranno bianco / giallo e falsi positivi produrranno colonie blu dopo 18-20 ore di incubazione a 37 ° C (Figura 3).
Dopo la selezione delle colonie, un lettore di piastra può essere utilizzata per determinare la resistenza di terminazione. Come prova di concetto, sei terminazioni putativi (T1-6) sono stati identificati bioinformatically nel mycobacteriophage Bernal13. I risultati in Figura 4 mostrano forza terminatore relativa con cellule esprimenti uncut / non modificato PGR come controllo. Se un terminatore predetto ha un rapporto GFP / RFP simile a PGR (~ 0.0) o al di sotto di 0,1, quindi la sequenza era determinato a non essere un terminatore(T5 e T6). Tuttavia, numericamente ogni decimo aumento rappresenta un aumento volte forza terminatore rispetto al controllo. Ad esempio, T3 ha un alto rapporto di espressione GFP rispetto alla RFP e ha mostrato un aumento di 5 volte (0,5 sul grafico) nella resistenza di terminazione rispetto al controllo ed era considerato un terminatore forte (Figura 4). I dati sono stati raccolti in triplice copia e in media per la rappresentazione visiva.
Per determinare il miglior controllo di riferimento per la quantificazione resistenza di terminazione, abbiamo confrontato i dati grezzi utilizzando il plasmide PGR originale che non contiene terminatore e PGR-Blue clonato con una sequenza conosciuta non essere un terminatore. Entrambi i controlli hanno mostrato livelli simili di GFP e di espressione RFP (Figura 5) e, cosa ancora più importante, ha prodotto simili GFP / RFP rapporti.
FIGURA 1. S chematic Detailing Piastra Reader layout. camera dovrebbe essere incluso nel lettore di piastre per tre comandi separati (verde). Un brodo / arabinosio LB + Amp bene (1) contenente solo ed un pozzo (2) per le cellule competenti non trasformate (in bianco) per servire come un vuoto. Per la quantificazione (3) della forza terminatore, cellule contenenti non tagliati PGR originale o contenenti PGR-blu legatura con un non-terminazione sequenza dovrebbero essere incluse (controllo di riferimento per la quantificazione). Il resto della piastra (giallo) può essere utilizzato per testare terminatori putativi. Si suggerisce di tutte le cellule essere coltivate in triplice copia e mediate prima dell'analisi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Orientamento clonazione del sito ed espressione diPGR-blu. espressione costitutiva di AmilCP (Blu Chromo Protein) è guidato nella direzione opposta (in basso a filo) di GFP e RFP. Quando digerito con BsaI, AmilCP ed i siti di riconoscimento BsaI vengono rimossi e il terminatore da testare è legatura in modo permanente nel plasmide. Il filo superiore e filo inferiore di un terminatore con le estremità appiccicose appropriati sono mostrati. I geni regolatore AraC e ampicillina resistenza sono nel plasmide, ma non mostrati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Colony Selezione dopo la clonazione. (A) Piastra Rappresentante dopo PGR-blu / terminazione legatura (mix standard) e trasformazione cellulare. colonie blu rappresentano legature falliti e bianco col / gialloOnies (indicato dalla freccia) sono legature di successo. (B) Un ingrandita immagine della stessa piastra mostrando colonie rappresentativi dopo trasformazione. Il colore di sfondo è stata modificata digitalmente per evidenziare ulteriormente le differenze di colore colonia. Cellule trasformate (E.coli -JM109) sono stati placcati in plats agar LB contenenti ampicillina e arabinosio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Quantificazione dei sei Terminator diversi in PGR-blu. Sei terminazioni putativi (T1-6) sono stati bioinformatically identificato nella mycobacteriophage Bernal13. I risultati mostrano relativa fluorescenza. Tutti i risultati sono stati normalizzati utilizzando cellule contenenti uncut / non modificato PGR come controllo. T3 è risultato essere un forteTerminator. Tutti i risultati rappresentano le singole colonie cresciute in triplice copia e in media per la rappresentazione visiva. Le barre di errore rappresentano le deviazioni tra i punti medi di dati. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. GFP e RFP espressione nei controlli. Espressione di GFP e RFP in uncut / non modificato PGR e due diverse sequenze di terminazione non inserita in PGR-blu. Tutti i risultati rappresentano le singole colonie cresciute in triplice copia e in media per la rappresentazione visiva. Le barre di errore rappresentano le deviazioni tra i punti medi di dati. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il passo più importante in questo protocollo è corretta progettazione oligonucleotide prima di ordinare. Gli oligonucleotidi devono avere le estremità coesive opportune aggiunte alla estremità 5 'della parte superiore e inferiore trefoli per garantire che GGA incorporazione è possibile. Inoltre, è importante cambiare l'orientamento delle terminazioni rivolto verso sinistra (terminatori che fermano la trascrizione sul filamento basso) a quella di destra di fronte (termina la trascrizione sul filo alto) terminatori perché GFP e RFP espressione è in alto a destra di fronte (in alto a filamento ) direzione.
Due protocolli GGA separati e miscele tampone può essere utilizzato per testare terminatori in PGR-blu. Il mix standard di economia consiste di acquisto materiale individualmente e poi mescolati in laboratorio 8. Il secondo protocollo utilizza un master mix GGA pre-fatto commerciale. Mentre entrambi funzionano bene; il master mix commerciale è più tempo efficiente, ma è relativamente costoso rispetto alla miscela standard.In un ambiente di istruzione, può essere più economico per realizzare il mix GGA standard anticipo e congelare aliquote per uso singolo studente.
Come risultato della modifica PGR per GGA e aggiungendo amilCP nell'orientamento indietro per la selezione del colore, l'espressione della GFP e RFP viene limitata nello uncut plasmide PGR-Blue e non devono essere utilizzati come controllo di riferimento per determinare la forza terminatore relativa. Tuttavia, tutte le modifiche vengono rimossi durante il processo di clonazione permettendo una corretta quantificazione di forza terminatore relativa. Anche se è meglio usare i non modificati PGR plasmide risultati simili originali può essere ottenuto mediante la clonazione di una sequenza nota di non essere un terminatore in PGR-blu. Entrambi i controlli hanno mostrato livelli uguali di GFP e l'espressione RFP (Figura 5) e, cosa ancora più importante, ha avuto simili rapporti GFP / RFP.
Per stretta regolazione dell'espressione genica, il plasmide PGR-blu esprime costitutivamente il regolatore AraCdel pBAD (arabinosio inducibile) promotore. 10,11 A seconda della linea cellulare utilizzata una concentrazione elevata arabinosio può essere richiesto per l'espressione di GFP e RFP. Buoni risultati sono stati ottenuti utilizzando una concentrazione di 10 mM arabinosio in E. linea cellulare coli JM109. cellule trasformate devono essere o bianco / giallo o blu sotto la luce visibile. Sotto la luce UV o luce blu (450 nm), è comune vedere solo la fluorescenza verde, ma non rosso in cellule trasformate positivamente. Tuttavia, la fluorescenza RFP è stato rilevato utilizzando il lettore di piastre.
Le terminazioni utilizzate come prova di concetto per questo protocollo sono stati identificati nel mycobacteriophage Bernal13. Tuttavia, PGR-blu funziona solo in E. coli e non è un vettore navetta che può essere espresso in altre specie di batteri. Il risultato è che non sappiamo esattamente come le terminazioni individuati funzionerebbero nel loro ambiente di accoglienza ed è una potenziale limitazione. Il socio cassetta di espressioneD con PGR-Blue è fiancheggiato da siti di clonazione tradizionali e potrebbe essere spostato in un vettore shuttle appropriata. Ciò consentirebbe singoli ricercatori di adattare PGR-blu alla loro specie batteriche specifiche, se lo si desidera.
Mentre ci sono altre procedure di analisi di sequenza high-throughput disponibili, la maggior parte utilizza un approccio di genetica in avanti. Questi approcci utilizzano mutagenesi sito-specifica o oligo-sintesi per generare centinaia di migliaia di potenziali combinazioni sequenza. 12,13 Una volta creato, l'effetto di ogni modifica sequenza è poi catalogato. Tuttavia, PGR-blu è stato progettato per una più diretta applicazione genetica inversa. Quando si analizza un romanzo genoma in silico, è comune osservare più terminatori potenziali in una data zona. PGR-blu è stato progettato per aiutare i ricercatori a perfezionare rapidamente il loro nelle previsioni in silico, consentendo loro di testare le sequenze putative in vivo. Va notato PGR test terminatore Plasmid è stato usato per quantificare la forza terminatore in 582 sequenze 4, tuttavia PGR utilizza uno standard di assemblaggio di restrizione enzimatica (ad esempio, basic assembly bio-mattone (BBA)), un processo di clonazione relativamente tempo rispetto al GGA. 7 Il plasmide PGR-Blue è stato progettato per funzionare in modo simile a PGR ma utilizza una più rapida selezione procedura di clonazione e il colore delle colonie. Queste modifiche, insieme al nostro protocollo semplificato, rendono PGR-blu adattabile sia per l'educazione e laboratori di ricerca orientata.
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Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere Malcolm Campbell e Todd Eckdahl con il Genome Consortium per l'insegnamento attivo (GCAT) e il HHMI-Science Education Alliance - Cacciatori fagi Avanzando Genomica e Evolutionary Science programma (SEA-fagi).
Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Center for Research Resources (P20RR016460) e l'Istituto Nazionale di General Medical Sciences (P20GM103429) dal National Institutes of Health. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla National Science Foundation sotto concessione # IIA-1.457.888. (Ouachita Baptist University) fondi Inoltre istituzionali sono stati forniti attraverso il JD Patterson Estate Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
- Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
- Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
- Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
- Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
- Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
- Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
- Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
- Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).
