Summary
本文介绍了在小鼠高眼压诱导视网膜缺血再灌注损伤的过程。视网膜缺血再灌注损伤的高眼压用于人类疾病视网膜特点是妥协的氧气和营养物质的交付模式，使研究人员能够检查视网膜神经血管单元的人类疾病的潜在细胞机制和治疗。
Abstract
视网膜缺血再灌注（I / R）是有助于在多个眼部病症，包括青光眼，糖尿病性视网膜病和视网膜血管阻塞的细胞损伤病理生理过程。 I / R损伤的啮齿动物模型中提供显著见解为人类I / R损伤的机制和治疗策略，特别是关于在视网膜神经血管单元神经变性损伤。这里介绍的是通过眼内压（IOP）升高诱导小鼠视网膜I / R损伤的协议。在这个协议中，眼部前房插管用针，通过该流动升高盐水储层的滴注。使用该滴提高眼压上述收缩动脉血压，从业者暂时停止内视网膜血流（缺血）。当循环被除去套管的恢复（再灌注），严重的细胞损伤随之而来，在视网膜的神经变性，最终导致。最近螺柱IES表明炎症，血管通透性和毛细管变性作为该模型的另外的元件。相比于替代视网膜I / R方法，如视网膜动脉结扎术，视网膜我/ R损伤的高眼压有优势在其解剖的特殊性，实验可追踪性和技术辅助，呈现自己作为一个有价值的工具，用于检查神经元病机及治疗视网膜神经血管单元。
Introduction
视网膜缺血再灌注（I / R）表征许多人视网膜病变，包括青光眼，糖尿病性视网膜病和视网膜血管闭塞1。在视网膜我/ R，血流量减少（缺血）在视网膜血管造成视网膜过敏的氧气和其他营养物质，沉淀严重的氧化和炎症损伤的状态时，循环后来又恢复（再灌注）2。视网膜神经似乎特别容易受到这些变化，患有视网膜神经变性的也许就是我/ R引起的损伤最鲜明的特点。这里介绍的是在小鼠模型视网膜I / R损伤的协议。这项技术使研究人员能够检查视网膜神经血管单元的人类疾病的潜在机制和治疗策略。
通过寻求理解手术贫血3的神经退行性后果外科医生于1952年首创，罗登ŧ视网膜的I /高眼压（IOP）R于1991年重新建立缺血损伤后4标准化神经退行性端点的目的。用盐水贮存提高眼压以上收缩压的滴，这些研究表明，加压眼部插管足以中止视网膜循环，并由此引发的神经元变性。使用视网膜我/ R高眼压最近的努力已开始拟订底层I / R引起的视网膜神经性变性5-12机制。多组报道额外的病理改变包括炎症13,14，血管通透性15,16，和毛细血管变性14,17。总之，这些研究已经更加普遍建立高眼压视网膜I / R损伤视网膜神经血管疾病的模型。
表征I / R损伤的机制是对VA的研究必不可少scular疾病。视网膜我/ R损伤的高眼压是众多缺氧性损伤模型，包括I / R损伤肺18，19心脏，脑20，21肝脏，肾脏22，和小肠23中的一个。这些模型已经在推进我们的血管疾病的认识及临床补救措施至关重要。通过扩展I / R进程眼部组织，视网膜我/ R损伤的高眼压的调查有助于绘制的这些相关条件，更全面的了解。
在临床视网膜神经退行性疾病，视网膜我/ R损伤的高眼压密切相应提出了兴趣探索缺血的发病机制研究的宝贵工具。本文描述的协议是有针对性的，听话的，并且可以访问。它是通过在神经元变性的端点，例如视网膜神经元的定量，视网膜厚度的测量，和电ř补充井视网膜神经元功能的ECORDING。这种模式已经证明了其在促进神经血管查询工具，它显示了在收入中的视觉医学研究的一个基础性协议状态的承诺。
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Protocol
伦理学声明：所有程序均按照由约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会规定的准则进行。
注意：在拍摄过程中使用的小鼠是从杰克逊C57BL / 6小鼠，虽然也可以使用其他啮齿动物品系或物种。当使用其他菌株或物种，应注意麻醉剂量和伤害时间表可能会有所不同。它适应I / R的条件，以适应应变，物种和实验的变化是重要的。
1.准备麻醉鸡尾酒
- 结合1.25毫升氯胺酮，0.625毫升赛拉嗪，0.375毫升乙酰丙嗪，和22.75毫升磷酸盐缓冲盐水在50毫升离心管中。
注意：对于手稿的其余部分，该解决方案将被称为鸡尾酒。 - 过滤到鸡尾酒用60毫升注射器和0.20微米的过滤器的新的无菌50ml离心管中。标签和日期这个新涂是。
- 完全包住鸡尾酒管在铝箔以防止麻醉剂的光诱导降解。
注：鸡尾酒可在室温下保存和再使用直至其最早的过期的成分的到期日。
2.准备麻醉助推器
- 在50ml离心管中，结合4毫升氯胺酮和16毫升磷酸盐缓冲盐水。
注：该解决方案将作为今后助推器被称为。 - 过滤成助推器用60毫升注射器和0.20微米的过滤器的新的无菌50ml离心管中。标签和日期这一新管。
注：助力器可以在室温下保存和再使用直至其最早的过期的成分的到期日。
3.准备手术套房
- 设定18℃，21℃之间的室温。
- 打开手术表，并调整其表面热到解释第1条ST温度。
- 覆盖手术底衬所有的工作表面。
- 排列在手术台的空笼或其他容器温暖。
- 安排一个规模上台面的耳朵恶搞。
4.准备肝素钠的平衡盐溶液
- 将0.5ml肝素钠到500ml四瓶平衡盐溶液（HBSS）中的。
- 将prepierced Y形管插入瓶中0.1％肝素钠的主要集的尖底。
5.设置输液架
- 挂在输液架上延伸0.1％肝素钠的瓶子，并扣打开prepierced Y形管的主要集空气过滤器盖。
- 提升0.1％瓶肝素钠到163厘米（120毫米汞柱）。测量从桌面到肝素钠滴的峰的高度。
- 通过手动弹prepierced Y形管的主要集中移除在静脉输液管的气泡。
6.设置肝素钠滴灌
- prepierced Y形管的主要组连接到五阀歧管。
- 连接30号½使用露儿男性对男性露儿管接头英寸针到五端口歧管。
- 将每个30号½英寸针到30号管自己的10寸段。
- 使用止血，打破新的30口径，½英寸针针尖和他们的钝端插入30号管。针尖无菌消毒或将是必要的步骤8.3。
- 使用磁带，安排与针，使得连接到内口管被定位在连接到外端口的管的顶部的30号管。这种安排将防止前房插管过程中管缠绕。
- 打开0.1％肝素钠流至五个阀歧管和每个单独的端口。
- 确保0.1％肝素钠是为每个端口强烈流动。如果一个端口弱流动，更换端口或无菌注射器与空气清除。
- 允许0.1％肝素钠流动为2 - 3分钟以从30号管和5-阀歧管除去气泡。
- 关闭于5阀组的所有端口。
7.准备手术的小鼠
- 把老鼠的外科手术室。供水瓶每个网箱以防止手术过程中动物脱水。
- 记录每只小鼠的体重。
- 注射每只小鼠腹腔注射每克体重0.02毫升鸡尾酒。
- 标记和记录各小鼠的数目。
- 将所有的老鼠进入上手术台的空容器。允许所有的老鼠5-10分钟，以达到深度麻醉由无踏板戒断反应到脚趾捏的证实。
- 对于每个小鼠，施用一滴托到每个眼睛的瞳孔扩张和短期润滑。
- 对于每个小鼠，施用丙美卡因一滴到每个眼的局部麻醉和短期润滑。
- 安排在麻醉的顺序小鼠，使得第一鼠标被麻醉将是第一个鼠标被插管。
- 允许约2分钟的眼药水才能生效。
- 由磁带上紧紧拉制备胶带的直4英寸件。预留每鼠一块胶带。
注意：如果不紧密地拉在磁带上会导致磁带的卷曲。
8.导管插入前房
- 安排手术显微镜下的第一个鼠标和聚焦显微镜的首选角膜。
注：可以插管在任的眼睛进行。右手主导的外科医生可能会发现我吨最容易导管插入左眼，而左侧优势的外科医生可能更喜欢的权利。 - 打开第一个0.1％肝素钠端口上的五阀组。
- 在手术显微镜，用一双镊子轻轻proptose眼球。大约中途插入30号套管针进入前房的小带纤维和角膜的顶点之间。
- 小心避免划伤或刺破虹膜，晶状体，或内角膜表面。
- 避免穿透角膜第二次。
- 使用温和的扭转运动，克服了套管和角膜之间的摩擦，在所述前房深深插入插管。
- 使用胶带的条带的30号管件固定到该表。为了尽量减少套管插入运动，按30号管对桌面同时达到磁带。
- 记录手术的开始时间。
- 使用显微镜，verify表示无泄漏是明显的。如果泄漏存在，流体的运动将是眼睛附近可见。
- 通过观察，该I / R眼睛比对侧眼大目视确认眼部腹胀。一起，由于没有泄漏和眼腹胀的存在表明眼压的一个成功的高程。
- 应用羟丙甲纤维素到双眼。羟丙甲纤维素起到润滑角膜和密封中微小。根据需要（大约每30分钟）持续润滑再涂羟丙甲纤维素。
- 重复步骤8，直到所有的动物已经被插管。
9.监控麻醉
- 使用脚趾捏，晶须，或尾部的视觉观察的视觉观察，以确认每个小鼠保持麻醉。如果鼠标演示踏板戒断反应，晶须抽搐，或尾部的运动，立即进行步骤9.2。
- 如果一只老鼠开始在手术过程中，电梯唤醒尾到腹膜内注入0.05毫升增压到下腹部从鼠标后面。允许1 - 2分钟，助推器生效。
- 如果鼠标需要额外的镇静，必要时重复步骤9。
10.前房取出套管
- 对于每个动物，90分钟后已经过去了，轻轻拉动从前房插管。
- 从手术表Untape鼠标，注意不要扰乱相邻动物的套管管道。
- 润滑双眼具有润滑果冻。
- 随后的套管被删除，安排在手术台上的空容器中的小鼠从手术中恢复。不要关闭手术台的热量。
- 允许，至少，2 - 3小时于加热手术台复苏。经常观察，直到他们充分从麻醉中恢复的老鼠。
11.清洁式uipment
- 用消毒酒精擦拭插管。
注意：为消毒或灭菌的其它方法，如高压灭菌，可以被取代。 - 用60毫升注射器填充有空气排出从5阀组0.1％肝素钠，30号针头，30号管和套管。
- 用60毫升注射器充满蒸馏水冲洗5阀组，30号针头，30号管和套管。
- 用60毫升注射器充满空气从5端口歧管，30号针头，30号管和插管排出的蒸馏水。
- 消毒插管和冲洗管道设备后，存放该设备的再利用。
- 商店，放弃或关闭所有其它设备。留在手术台的热量。
12.返回所有小鼠饲养笼
- 后小鼠从手术唤醒（后2 - 3小时），每个动物返回其家笼。每个笼子提供凝胶的食品。返回所有笼子到其指定的房间。
- 关掉手术台的热量。丢弃所有垃圾，并擦拭手术套件。
13.执行视网膜评估
- 适当时，收集组织学分析或暗适应小鼠视网膜电图记录视网膜。
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Representative Results
由高眼压视网膜的I / R的神经变性的影响通常进行评价使用两个标准的方法。神经核的NeuN免疫标记已经揭示以下I / R损伤（ 图1）显著神经元细胞的损失。简单地说，眼睛剜7天I / R固定后，多聚甲醛，与神经细胞的NeuN标记标记和全装。图像用共焦显微镜拍摄的，并标有的NeuN细胞通过计数11定量。减少在神经节细胞层的神经元计数指示I / R诱导的细胞死亡。
视网膜神经元功能损伤已经使用电图（ 图2）记录。简单地说，七天后I / R，暗电图中在多个闪光强度记录。利用图像分析软件的a-和b-波的振幅进行量化
图1. 视网膜I / R诱导的神经节细胞层（GCL）神经元细胞死亡。由控制和I代表的视网膜图像/ R眼睛显示有比例尺表示100μm左右。 （A）中的NeuN阳性细胞中的GCL数在I / R眼睛显著减少与对照相比（B）。 N = 9，误差线：标准错误，*** P <0.0001 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
视网膜我/ R损伤的高眼压已经证明了其在模拟细胞损伤和功能障碍，神经退行性疾病特别是在啮齿动物的视网膜神经血管单位效用。这个程序提供了一个强大的控制组织在技术成熟度而言很方便。它已经在这方面和其他I / R损伤模型，增加的压力和缺血的持续时间可能会增加损伤程度24被注意到。出于这个原因，一些从业者选择使用缺血性压力和持续时间与此处4,6-10,12提出不同。因此，视网膜我/ R损伤的高眼压提供了一个优势，因为它允许一个调整参数的手术，以适应自己的特定的实验目标替代视网膜我/ R技术。
尽管如此，替代技术已被用于在啮齿动物诱导视网膜I / R损伤。视神经束25,26结扎27视网膜中央动脉已被用来暂时阻止视网膜血流。对全身情况类似的策略已经所需的脑动脉28或头侧动脉29结扎，以减少不完全阻碍它的血流量。一个罕见的方法包括使用加权的两端30线程圆周地压缩视网膜全球。尽管这种策略已经成功地促进了在视网膜缺氧诱导的神经血管变化的理解，这里所描述的技术提供了超过这些替代几个优点。只有角膜迫使极小非视网膜损伤，I / R高眼压提供了比由连接技术所提供，因此可能会吸引对特定视网膜疾病的研究人员更加有用的一个更具针对性的视网膜损伤。此外，高眼压方法比结扎或压缩模型更容易处理，使得我OP方法允许视网膜缺血快速实现以及随后的再灌注。最后，高眼压协议要求最小的手术和尖端技术等都可能是比他们更替代品普及。
视网膜我/ R损伤的高眼压并非没有挑战。前房插管需要手巧，和必须小心以保持光圈，镜头和角膜的完整性。谨慎套管插入之后也宜，因为插管可以从前房而30号管固定用胶带被拉动。
在本协议中的其他关键流程包括维持一个温暖的体温动物麻醉，及时给予助推器麻醉，并维持使用羟丙甲纤维素角膜的润滑。同样重要的是要注意鼠标应力或疾病的行为（例如，缺乏修饰的，拱起等 ）在手术前，因为这些额外的手术变量可能影响药物效力和死亡率。通过参加这些问题，可以实现视网膜I / R损伤一个高度管制的和可重复的模式。
还应当承认，视网膜我/ R损伤的高眼压只是一个模型，推算结果向特定疾病，尤其是慢性疾病时，宜慎用。虽然这些疾病在时间框架和病因起源不同，但是，视网膜我/ R损伤的高眼压仍然可以用于评估视网膜变性和恢复机制提供了一个良好平台。
视网膜是由多种形式的细胞和信令进程，以及视网膜失调的全面故事尚待阐明。目前的文献表明，不仅在研究视网膜变性过程6-8,10,12高眼压视网膜I / R损伤的效用，而且在识别用于治疗预防和干预7,9,11,12,14目标。此外，有越来越多的证据支持视网膜I / R损伤的效用由高眼压在非神经端点如视网膜炎症，血管变性和泄漏14,15,17。鉴于其特殊性解剖，实验可追踪性和可访问性技术，视网膜我/ R损伤的高眼压承诺在追求这些调查保持着领先的角色。
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Acknowledgments
（; EJD EY022383和EY022683）和Core补助（P30EY001765），成像和显微镜核心模块这项工作是由美国国立卫生研究院的研究资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | Abraxis Pharmaceutical Products | 1,000 USP/ml | |
| BSS Sterile Irrigating Solution | Alcon Laboratories, Inc. | 9007754-0212 | 500 ml |
| SC-2 kg Digital Pocket Scale | American Weigh Scales, Inc. | SC-2 kg | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1% | Bausch + Lomb | 1% (10 mg/ml) | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% | Bausch + Lomb | 0.5% (5 mg/ml) | |
| INTRAMEDIC Polyethylene Tubing | Becton Dickinson and Company | 427400 | Inner diameter: 427400 |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needles | Benton Dickinson and Company | 305106 | |
| BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8 | Benton Dickinson and Company | 309625 | |
| BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip | Benton Dickinson and Company | 309653 | |
| Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope | Carl Zeiss AG | 000000-1179-101 | |
| Sterile Syringe Filter | Corning Inc. | CLS431224 | 0.20 µm |
| Durasorb Underpads | Covidien | 1038 | 23 x 24 inches |
| Alcohol Prep | Covidien | 6818 | 2 Ply, Medium |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch | Hospira | 12672-28 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x) | Invitrogen | 10010-049 | 500 ml |
| Distilled water | Invitrogen | 15230-204 | 500 ml |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | |
| AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution | LLOYD, Inc. | 20 mg/ml | |
| Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic | MediChoice | 3-Gram Packet | |
| NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold | Navilyst Medical, Inc. | 70039355 | 5-Valve Manifold with Seven Female Ports |
| Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose | OCuSOFT, Inc. | 2.5% (25 mg/ml) | |
| Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride | Pfizer, Inc. | 100 mg/ml | |
| Trans-Pal I.V. Stand | Pryor Products | 372 | Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension |
| Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP | Vet One | 10 mg/ml | |
| V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic | VSSI | 100-4041-21 | |
| Tube Fitting Luer Male to Luer Male | Warner Instruments | 64-1579 |
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