Summary
この記事では、マウスにおける高眼圧によって網膜虚血再灌流障害を誘導するための手順を説明します。高眼圧による網膜虚血 - 再灌流障害は、網膜神経血管ユニットのヒトの疾患のための潜在的な細胞機構と治療法を検討する研究者を可能にする、網膜に妥協酸素と栄養配信を特徴とするヒトの病態をモデル化するのに役立ちます。
Abstract
網膜虚血 - 再灌流（I / R）は、緑内障、糖尿病性網膜症、および網膜血管閉塞を含む複数の眼症状、内細胞損傷に寄与する病態生理学的プロセスです。 I / R傷害の齧歯類モデルは、特に網膜神経血管部における神経変性損傷に関して、人間のI / R傷害のためのメカニズムと治療戦略に重要な洞察を提供しています。ここで紹介するには、眼圧（IOP）の上昇を通じて、マウスにおける網膜のI / R傷害を誘導するためのプロトコルです。このプロトコルでは、眼の前房は、高い生理食塩水溜りの点滴を流れる針でカニューレを挿入します。収縮期動脈圧の上にIOPを発生させるために、この点滴を使用して、施術者は、一時的に内網膜の血流（虚血）を停止します。循環がカニューレの除去により（再灌流を）復活された場合、深刻な細胞の損傷は、網膜神経変性に最終的に得られ、すさまじいです。最近のスタッドIEは、このモデルの追加要素として炎症、血管透過性、および毛細血管の変性を示しています。このような網膜動脈結紮などの代替網膜のI / R方法論と比較して、上昇したIOPによって網膜のI / R損傷はにおけるニューロン病因と治療を調べるための貴重なツールとしての地位を提示し、その解剖学的特異性、実験的な従順、および技術的なアクセシビリティの利点を提供しています網膜神経血管ユニット。
Introduction
網膜虚血-再灌流（I / R）は、緑内障、糖尿病性網膜症、および網膜血管閉塞1を含む多くのヒト網膜病変を特徴づけます。循環が続いて復活されたときに網膜I / Rで、網膜血管系における血流低下（虚血）は網膜の酸素や他の栄養素に対する過敏症、重度の酸化を沈殿させ、炎症性損傷の状態を作成します（再灌流）2。神経網膜は、網膜神経変性は、I / R誘発損傷のおそらく最も顕著な特徴であることで、これらの変化に対して特に脆弱表示されます。ここで紹介するには、マウスにおける網膜のI / R傷害をモデル化するためのプロトコルです。この手法は、網膜神経血管ユニットのヒトの疾患のための潜在的なメカニズムと治療戦略を検討する研究者を可能にします。
外科的貧血3の神経変性結果を理解しようとしている外科医によって1952年に開拓し、ローデン眼内圧上昇（IOP）によるT網膜I / Rは、虚血発作4の後の神経変性のエンドポイントを標準化する目的で1991年に再確立されました。収縮期血圧の上にIOPを上昇させるために、生理食塩水リザーバの点滴を用いて、これらの研究は、加圧された眼のカニューレは、網膜循環を中断し、それによって神経変性を開始するのに十分であったことを実証しました。上昇したIOPによって網膜のI / Rを使用して、より最近の努力は、I / R誘導性の網膜神経変性5-12のメカニズムを詳しく説明し始めています。複数のグループが炎症13,14、血管透過性15,16、および毛細血管の変性14,17を含む追加の病理学的変化を報告しています。まとめると、これらの研究は、より一般的には、網膜の神経血管疾患のモデルとして上昇したIOPによって網膜のI / R傷害を確立しています。
I / R傷害のメカニズムを特徴づけることは、VAの研究のために不可欠ですscular病気。上昇したIOPによって網膜のI / R傷害は、肺18のI / R傷害を含む多くの低酸素誘導性傷害モデル、の1、心臓19、脳20、肝臓21、腎臓22、および腸23です。これらのモデルは、血管の病気の理解とその臨床的救済を進める上で最も重要でした。眼組織へのI / Rプロセスの調査を拡張することにより、上昇したIOPによって網膜のI / R損傷は、これらに関連する条件のより包括的な絵を描くのに役立ちます。
網膜における臨床神経変性状態と密接に対応して、上昇したIOPによって網膜のI / R傷害は、虚血性病因を探索に興味を持って研究者のための貴重なツールを提供します。本明細書に記載されたプロトコルは、ターゲットを絞った扱いやすい、かつアクセス可能です。このような網膜神経細胞の定量化、網膜の厚さの測定、および電気生理学rと、神経変性にエンドポイントによっても補完されます網膜神経細胞機能のecording。このモデルは、神経血管問い合わせを進める上で、その有用性を証明していて、それは視覚的な医学研究の基礎プロトコルとして地位を獲得中の約束を示しています。
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Protocol
倫理声明：すべての手順はジョンズ・ホプキンス大学施設内動物管理使用委員会によって定められたガイドラインに従って行われました。
注：他の齧歯類の株または種を用いてもよいが、撮影時に使用したマウスは、ジャクソンからC57BL / 6マウスです。他の株または種を使用する場合は、麻酔投与量および傷害のタイムラインは変更になる場合がありますのでご注意ください。株、種、および実験的変動に適応するためにI / Rの条件を適合させることが重要です。
1.麻酔カクテルを準備
- 50ミリリットルの遠心分離管に1.25ミリリットルのケタミン、0.625ミリリットルキシラジン、0.375ミリリットルアセプロマジン、および22.75ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を組み合わせます。
注：原稿の残りの部分については、このソリューションはカクテルと呼ぶことにします。 - 60ミリリットルの注射器および0.20μmのフィルターを使用して、新しい滅菌50ml遠心管にカクテルをフィルタリングします。ラベルや日付、この新しいTUです。
- 完全に麻酔薬の光誘起劣化を防ぐためにアルミホイルでカクテルチューブを包みます。
注：カクテルを室温で保存し、最も早い期限成分の有効期限まで再使用することができます。
2.麻酔ブースターを準備
- 50ml遠心管中を4mlケタミンおよび16 mlのリン酸緩衝生理食塩水を組み合わせます。
注：このソリューションは、以後ブースターと呼ばれます。 - 60ミリリットルの注射器および0.20μmのフィルターを使用して、新しい滅菌50ml遠心管にブースターをフィルタリングします。この新しいチューブにラベルを付け、日付。
注：ブースターは、室温で保存し、最も早い期限成分の有効期限まで再使用することができます。
3.手術室を準備します
- 18°Cと21°Cの間、室温を設定します。
- 手術テーブルをオンにして、higheにその表面の熱を調整します番目の温度。
- 手術用アンダーパッドですべての作業表面を覆います。
- 暖めるために手術台の空のケージまたは他の容器を配置します。
- 規模や調理台に耳タガーを配置します。
4.ヘパリンナトリウムとの平衡塩溶液を準備します
- 平衡塩溶液（HBSS）の500ミリリットルのIVボトルにヘパリンナトリウムの0.5ミリリットルを追加します。
- 0.1％のヘパリンナトリウムの瓶の中にY-サイトチューブprepiercedプライマリーセットの鋭い端を挿入します。
IVポールを設定する5.
- IVポールの延長から0.1％のヘパリンナトリウムのボトルをハング、そしてY-サイトチューブprepiercedプライマリーセットのエアフィルターキャップを開きスナップ。
- 163センチメートル（120ミリメートルHgの）に0.1％ヘパリンナトリウムボトルを高めます。ヘパリンナトリウム点滴のピークまでの卓上からの高さを測定します。
- 手動でY-サイトチューブprepiercedプライマリーセットをフリックすることによりIVチューブ内の気泡を除去します。
6.ヘパリンナトリウムドリップを設定します
- 5バルブマニホールドにY-サイトチューブprepiercedプライマリーセットを接続します。
- ルアーオス管継手にルアーの雄を使用して、5ポートマニホールドに30ゲージ½インチの針を接続します。
- 30ゲージチューブの独自の10インチのセグメントに30ゲージ½インチの針のそれぞれを挿入します。
- 止血剤を使用して、新しい30ゲージ½インチの針から針先端を破壊し、30ゲージのチューブに彼らの平滑末端を挿入します。針先端の無菌性や消毒は、ステップ8.3のために必要となります。
- テープを使用して、内側のポートに接続された管は外側ポートに接続されたチューブの上に配置されるように、針30ゲージチューブを配置します。この配置は、前房のカニュレーション時に配管のもつれを防ぐことができます。
- 5バルブマニホールドにし、各ポートに0.1％ヘパリンナトリウムの流れをオンにします。
- 0.1％いることを確認してくださいヘパリンナトリウムは、ポートごとに強く流れています。ポートが弱く流れている場合は、ポートを交換するか、無菌注射器から空気でそれをオフにします。
- 30ゲージ管5バルブマニホールドから気泡を除去するために3分 - 0.1％ヘパリンナトリウム2のフローを可能にします。
- 5バルブマニホールド上のすべてのポートをオフにします。
7.手術のためのマウスを準備
- 手術室にマウスを持参してください。手術中に動物の脱水を防ぐために、各ケージのために水のボトルを供給してください。
- 各マウスの体重を記録します。
- グラムの体重あたり0.02ミリリットルカクテルを腹腔内に各マウスを注入します。
- タグを付けると、各マウスの数を記録します。
- 手術テーブルの上に空の容器にすべてのマウスを置きます。つま先のピンチにペダル引っ込め応答の欠如によって確認されるように、深い麻酔を達成するために、すべてのマウスのための5-10分を許可します。
- 各マウスについての一滴を投与瞳孔拡張および短期潤滑用それぞれの目にトロピカミド。
- 各マウスについて、局所麻酔および短期の潤滑にそれぞれの目にプロパラカイン一滴を管理します。
- 麻酔された最初のマウスはカニューレを挿入する最初のマウスになるように、麻酔のためにマウスを配置します。
- 目には約2分を有効に降下することができます。
- テープにしっかりと引っ張ることにより、テープのストレート4インチ片を準備します。さておき、各マウス用テープの1枚を設定します。
注：テープにしっかりと引っ張っしないと、テープのカールになります。
8.カニューレを挿入前房
- 手術用顕微鏡下での最初のマウスを配置し、好ましい角膜に顕微鏡の焦点を合わせます。
注：カニューレ挿入は、いずれかの眼の上で実行することができます。右側の支配的な外科医は私を見つけることができます左側の支配的な外科医が右を好むかもしれないが、左目にカニューレを挿入するためにトンが最も簡単。 - 5バルブマニホールドの最初の0.1％ヘパリンナトリウムポートをオンにします。
- 手術用顕微鏡下で、静かに目をproptoseするためにピンセットを使用しています。小帯繊維と角膜の頂点の間のほぼ中間に前房内に30ゲージのカニューレ針を挿入します。
- アイリス、レンズ、または内側の角膜表面を傷や刺さないように注意してください。
- 角膜をもう一度貫通することは避けてください。
- カニューレと角膜との間の摩擦を克服するために穏やかなひねり運動を使用して、前房に深くカニューレを挿入します。
- テーブルに30ゲージのチューブを固定するためにテープのストリップを使用してください。テープに手を伸ばしながら、挿入されたカニューレの動きを最小限に抑えるために、卓上に対して30ゲージのチューブを押してください。
- 手術の開始時間を記録します。
- VERIF、顕微鏡を用いて漏れが見られないのy。漏れがある場合は、流体の動きは、目の近くに表示されます。
- 視覚的にI / Rの眼は反対側の眼よりも大きいことを観察することにより、眼の膨満を確認します。一緒に、漏れの有無および眼の膨満の存在は、眼圧の正常な上昇を示しています。
- 両眼にヒプロメロースを適用します。ヒプロメロースは、角膜とシールmicroleaksを潤滑するのに役立ちます。持続的な潤滑用（約30分ごとに）必要に応じてヒプロメロースを再適用します。
- すべての動物がカニューレを挿入されるまで、手順8を繰り返します。
9.モニター麻酔
- つま先のピンチを使用して、ウィスカー、または尾の目視観察の目視観察では、各マウスは麻酔をかけたままであることを確認します。マウスはペダル引っ込め応答、ウィスカーけいれん、または尾の動きを示すべき、9.2のステップにすぐ進みます。
- マウスは、手術、リフト中目覚め始めた場合マウス後ろから腹腔内に下腹部に0.05ミリリットルブースターを注入する尾。ブースターを有効にするために2分 - 1を許可します。
- マウスは、必要に応じて追加の鎮静、繰り返し手順9を要求する必要があります。
10.前房からカニューレを削除します
- 各動物について、90分が経過した後、静かに前房からカニューレを引き出します。
- 隣接する動物のカニューレチューブを乱さないように注意しながら、手術台からマウスをUntape。
- ゼリーを潤滑に両眼を潤滑。
- その後のカニューレが除去されるように、手術から回復するために手術台に空の容器にマウスを配置します。手術台の熱をオフにしないでください。
- 加熱された手術台に回復のために3時間 - 2、最低でも、許可します。彼らは完全に麻酔から回復するまで頻繁にマウスを観察します。
11.クリーン式uipment
- アルコール綿を使用してカニューレを駆除。
注：例えば、オートクレーブのような消毒または滅菌のための他の方法は、置換されていてもよいです。 - 空気で満たさの60mLシリンジを用いて5バルブマニホールド、30ゲージ針、30ゲージチューブ、及びカニューレから0.1％のヘパリンナトリウムを放出します。
- 蒸留水で満たされたの60mLシリンジを用いて5バルブマニホールド、30ゲージ針、30ゲージチューブ、及びカニューレをすすぎます。
- 空気で満たさの60mLシリンジを用いて5ポートマニホールド、30ゲージ針、30ゲージチューブ、及びカニューレから蒸留水を追い出します。
- カニューレを消毒し、チュービング装置を洗浄した後、再使用のためにこの装置を格納します。
- ストア、破棄、または他のすべての機器の電源を切ってください。上の手術台の熱を残します。
12.戻るホームケージにすべてのマウス
- マウスは（2後 - 3時間）手術から目覚めた後、そのホームケージに各動物を返します。各ケージ用のゲル食品を提供します。その指定された部屋にすべてのケージを返します。
- 手術台の熱をオフにします。すべての廃棄物を捨てて、手術室を拭いてください。
13.網膜評価を実施
- 必要に応じて、電記録用の組織学的分析や暗い適応マウス用の網膜を収集します。
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Representative Results
上昇したIOPによって網膜のI / Rの神経変性作用は、一般に、2つの標準的なアプローチを用いて評価されています。ニューロン核のNeuNの免疫標識は、I / R傷害（ 図1）以下の重要な神経細胞の損失を明らかにしました。 I / Rが、パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞マーカーのNeuNで標識され、そして全マウントした後に簡単に説明すると、目が7日を摘出します。画像は、共焦点顕微鏡を用いて撮影し、そしてのNeuNで標識された細胞11を計数することによって定量しました。神経節細胞層のニューロン数の減少は、I / R誘導性細胞死を示します。
網膜神経細胞の機能の障害が電図（ 図2）を使用して文書化されています。簡単に言えば、7日間I / R後、暗所視電図は、複数のフラッシュ強度で記録しました。 A及びB波の振幅は、画像解析ソフトウェアを用いて定量しました。 
図1. 網膜のI / Rは、神経節細胞層（GCL）における神経細胞死を誘導する。制御およびIからの代表的な網膜像を/ Rの目はスケールバーが100μmを表すで示されています。 （A）GCL中のNeuN陽性細胞の数が有意に対照（B）と比較して、I / Rの目に低減されます。 n = 9、エラーバー：標準誤差、*** P <0.0001 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
網膜I / IOPの上昇によってR損傷はげっ歯類の網膜神経血管ユニット内の細胞の損傷や機能障害、特に神経変性を、モデリングにおけるその有用性を証明してきました。この手順では、ロバスト制御の組織を提供し、技術的な洗練の面で簡単にアクセス可能です。なお、この、圧力および虚血の持続時間を増加させることは、損傷の重大度24を増加させることができる他のI / R傷害モデルにおいて注目されています。このため、一部の医師は、ここ4,6-10,12提示されたものとは異なる虚血圧と期間を使用することを選択しています。それは自分の特定の実験の目標に対応するために、1は、外科手術用のパラメータを調整することを可能にするという点で、そのため上昇したIOPによって網膜のI / R損傷は、代替網膜のI / Rの技術に勝る利点を提供しています。
それにもかかわらず、代替技術は、げっ歯類の網膜I / R傷害を誘導するために使用されてきました。視神経の束25,26の連結27は、一時的に、網膜血流を阻止するために使用されています。全身状態のため、同様の戦略は完全にそれを妨げることなく、血流を減少させるために脳動脈28または橈側動脈29の連結を必要としていました。一つのまれな方法論は、円周方向に30の両端に重み付けされたスレッドを使用して網膜地球を圧縮することを含みます。そのような戦略が成功した網膜における低酸素誘導神経血管変化の理解に貢献してきたが、本明細書に記載の技術は、これらの選択肢に比べていくつかの利点を提供しています。唯一の角膜に最小限の非網膜の損傷を必要と、私は/ IOPの上昇によって、Rは、連結技術によってもたらされるので、網膜特異的疾患に興味を持つ研究者にとってより有用である可能性がより特異的に標的網膜損傷を提供します。また、上昇したIOPの方法は、ライゲーションまたは圧縮モデルよりも扱いやすいですように私はそのOP方法は、網膜虚血を迅速に達成だけでなく、その後の再灌流を可能にします。最後に、上昇したIOPプロトコルは、最小限の外科的および技術的な洗練を必要とするので、より広くアクセス彼らの選択肢よりもすることができます。
上昇したIOPによって網膜のI / R損傷は、その課題がないわけではありません。前房のカニュレーションは、手先の器用さを必要とし、注意を絞り、レンズ、および角膜の完全性を維持するために注意しなければなりません。 30ゲージのチューブはテープで固定されているカニューレは前房から引き出すことができるように注意はまた、カニューレを挿入した後をお勧めします。
このプロトコルの他の重要なプロセスは、麻酔した動物のための暖かい体温を維持し、タイムリーにブースター麻酔を投与し、およびヒプロメロースを使用して角膜の潤滑を維持含まれています。ハンチング、例えば、（グルーミングの欠如をマウスのストレスや病気の行動を注意することも重要です、 等 ）は、これらの余分な外科的変数は、薬物の効力および死亡率に影響を及ぼし得るように、外科手術の前に。これらの問題に出席することにより、網膜のI / R傷害のための高度に制御及び再現モデルを達成することができます。
また、上昇したIOPによって網膜のI / R損傷は唯一のモデルであることを認められるべきであり、特定の疾患、特に慢性症状に結果を外挿するときに注意が助言されます。時間枠や病因の起源にこれらの疾患は異なるが、しかし、上昇したIOPによって網膜のI / R損傷は、それにもかかわらず、網膜変性および回復のメカニズムを評価するための健全なプラットフォームを提供することができます。
網膜は多形細胞およびシグナル伝達過程で構成され、網膜の調節不全の総合的な話はまだ解明されていません。現在の文献は、だけでなく、網膜変性過程6-8,10,12を調べるに上昇したIOPによって網膜のI / R傷害の有用性を実証しますしかし、治療の予防と介入7,9,11,12,14のための標的を同定するインチまた、このような網膜炎症、血管変性、および漏れ14,15,17などの非神経エンドポイントで上昇したIOPによって網膜のI / R傷害の有用性をサポートするために成長している証拠があります。その解剖学的特異性、実験的な従順、および技術のアクセシビリティを考えると、上昇したIOPによって網膜のI / R損傷は、これらの問い合わせを追求する中で主導的な役割を維持することを約束します。
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Acknowledgments
（; EJD EY022383とEY022683）とコアグラント（P30EY001765）、イメージングおよび顕微鏡コアモジュールこの作品は、国立衛生研究所から研究助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | Abraxis Pharmaceutical Products | 1,000 USP/ml | |
| BSS Sterile Irrigating Solution | Alcon Laboratories, Inc. | 9007754-0212 | 500 ml |
| SC-2 kg Digital Pocket Scale | American Weigh Scales, Inc. | SC-2 kg | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1% | Bausch + Lomb | 1% (10 mg/ml) | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% | Bausch + Lomb | 0.5% (5 mg/ml) | |
| INTRAMEDIC Polyethylene Tubing | Becton Dickinson and Company | 427400 | Inner diameter: 427400 |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needles | Benton Dickinson and Company | 305106 | |
| BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8 | Benton Dickinson and Company | 309625 | |
| BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip | Benton Dickinson and Company | 309653 | |
| Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope | Carl Zeiss AG | 000000-1179-101 | |
| Sterile Syringe Filter | Corning Inc. | CLS431224 | 0.20 µm |
| Durasorb Underpads | Covidien | 1038 | 23 x 24 inches |
| Alcohol Prep | Covidien | 6818 | 2 Ply, Medium |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch | Hospira | 12672-28 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x) | Invitrogen | 10010-049 | 500 ml |
| Distilled water | Invitrogen | 15230-204 | 500 ml |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | |
| AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution | LLOYD, Inc. | 20 mg/ml | |
| Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic | MediChoice | 3-Gram Packet | |
| NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold | Navilyst Medical, Inc. | 70039355 | 5-Valve Manifold with Seven Female Ports |
| Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose | OCuSOFT, Inc. | 2.5% (25 mg/ml) | |
| Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride | Pfizer, Inc. | 100 mg/ml | |
| Trans-Pal I.V. Stand | Pryor Products | 372 | Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension |
| Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP | Vet One | 10 mg/ml | |
| V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic | VSSI | 100-4041-21 | |
| Tube Fitting Luer Male to Luer Male | Warner Instruments | 64-1579 |
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