Summary
Este artigo descreve um processo para induzir a lesão de isquemia-reperfusão da retina pela pressão intra-ocular elevada em ratos. lesão de isquemia-reperfusão da retina pela pressão intra-ocular elevada serve para modelar patologias humanas caracterizadas por oxigénio e entrega de nutrientes comprometida na retina, permitindo aos investigadores para examinar os mecanismos celulares e potenciais tratamentos para doenças humanas da unidade neurovascular da retina.
Abstract
Retinal isquemia-reperfusão (I / R) é um processo patofisiológico contribuir para os danos celulares em várias condições oculares, incluindo o glaucoma, retinopatia diabética, e oclusões vasculares retinianas. modelos de roedores de lesão de I / R estão fornecendo insights significativos em mecanismos e estratégias de tratamento para o homem I / lesão R, especialmente no que diz respeito a danos neurodegenerativa na unidade neurovascular da retina. Apresentado aqui é um protocolo para a indução de lesões retinianas I / R em ratos através da elevação da pressão intra-ocular (PIO). Neste protocolo, a câmara anterior ocular é canulada com uma agulha, por onde corre o gotejamento de um reservatório de solução salina elevada. Usando este gotejamento para elevar a PIO acima da pressão arterial sistólica, um praticante de pára temporariamente o fluxo sangüíneo da retina interna (isquemia). Quando a circulação é reposta (reperfusão) por remoção da cânula, o dano celular grave resulta, em última instância, resulta na neurodegeneração da retina. garanhão recentes demonstrar inflamação, da permeabilidade vascular, e degeneração capilar como elementos adicionais desse modelo. Em comparação com metodologias I / R retina alternativas, como a ligadura arterial da retina, retinal I / lesão R por PIO elevada oferece vantagens na sua especificidade anatómica, tractability experimental, e acessibilidade técnica, apresentando-se como uma ferramenta valiosa para examinar patogênese neuronal e terapia em a unidade neurovascular da retina.
Introduction
Retinal isquemia-reperfusão (I / R) caracteriza muitas patologias da retina humana, incluindo o glaucoma, retinopatia diabética, e oclusões vasculares retinianas 1. Na retina I / R, redução do fluxo sanguíneo (isquemia) na vasculatura retiniana cria um estado de hipersensibilidade da retina ao oxigénio e outros nutrientes, precipitando oxidativo grave e dano inflamatório quando a circulação é, subsequentemente, reposta (reperfusão) 2. A retina neural parece particularmente vulnerável a estas mudanças, a neurodegeneração da retina sendo talvez a característica mais saliente do dano induzido R I /. Apresentado aqui é um protocolo para a modelagem de lesão de I / R retinal no mouse. Esta técnica permite aos pesquisadores para examinar possíveis mecanismos e estratégias de tratamento para doenças humanas da unidade neurovascular da retina.
Foi pioneira em 1952 por cirurgiões que procuram compreender as consequências neurodegenerativas de anemia cirúrgica 3, rodent retinal I / R pela pressão intra-ocular elevada (PIO) foi restabelecida em 1991 com a finalidade de padronizar endpoints neurodegenerativas após lesão isquêmica 4. Usando o gotejamento de um reservatório de solução salina para elevar a PIO acima da pressão arterial sistólica, estes estudos demonstraram que a canulação ocular pressurizado foi suficiente para suspender a circulação da retina e desse modo iniciar a degeneração neuronal. Esforços mais recentes usando retina I / R por PIO elevada começaram a elaborar os mecanismos subjacentes I / neurodegeneração da retina induzida por R 5-12. Vários grupos têm relatado alterações patológicas adicionais, incluindo a inflamação 13,14, permeabilidade vascular 15,16, e degeneração capilar 14,17. Tomados em conjunto, estes estudos estabeleceram lesão da retina de I / R de PIO elevada como um modelo de doença retiniana neurovascular um modo mais geral.
Caracterizar os mecanismos de lesão de I / R é essencial para o estudo de VAdoença scular. Lesão da retina de I / R de PIO elevada é um dos diversos modelos de lesão induzida por hipoxia, incluindo lesões de I / R em 18 de pulmão, coração, cérebro 19 20 21, fígado, rim e intestino 22, 23. Estes modelos têm sido fundamental no avanço da nossa compreensão da doença vascular e seus remédios clínicos. Ao estender a investigação de processos I / R para tecidos oculares, I da retina / lesões R por PIO elevada ajuda a pintar um quadro mais abrangente destas condições relacionadas.
Correspondente em estreita colaboração com as condições clínicas neurodegenerativas na retina, I da retina / lesões R por PIO elevada apresenta uma ferramenta valiosa para os pesquisadores interessados em explorar patogênese isquêmico. O protocolo aqui descrito é alvo, tratável, e acessível. É bem complementado por pontos de extremidade na degeneração neuronal, tais como a quantificação de neurónios da retina, a medição da espessura da retina, e R electrofisiológicoecording da retina a função do neurônio. Este modelo tem provado a sua utilidade no avanço da investigação neurovascular, e isso mostra a promessa em ganhar status como um protocolo fundamental na pesquisa da medicina visual.
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Protocol
Declaração de Ética: Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Johns Hopkins.
Nota: Os ratinhos utilizados durante a filmagem são ratinhos C57BL / 6 de Jackson, embora também possam ser utilizadas outras estirpes ou espécies de roedores. Ao utilizar outras estirpes ou espécies, estar ciente de que as doses de anestesia e cronograma lesão pode variar. É importante para adaptar as condições de I / R para acomodar estirpe, a espécie e variações experimentais.
1. Prepare o Cocktail Anestesia
- Combinar 1,25 ml de cetamina, xilazina 0,625 ml, 0,375 ml de acepromazina, e 22,75 ml de solução salina tamponada de fosfato num tubo de centrífuga de 50 ml.
NOTA: Para o restante do manuscrito, esta solução irá ser referido como o cocktail. - Filtra-se o cocktail para um novo tubo de centrífuga estéril de 50 ml usando uma seringa de 60 ml e um filtro de 0,20? M. Rótulo e data deste novo tuestar.
- Totalmente envolver o tubo de cocktail em papel de alumínio para evitar a degradação induzida pela luz do anestésico.
NOTA: O cocktail pode ser armazenada à temperatura ambiente e reutilizado até a data de expiração do seu ingrediente mais antiga expira.
2. Prepare o Anestesia impulsionador
- Num tubo de centrífuga de 50 ml, combinar 4 ml de cetamina e 16 ml de solução salina tamponada com fosfato.
NOTA: Esta solução será daqui em diante referido como o reforço. - Filtra-se o reforço para um novo tubo de centrífuga estéril de 50 ml usando uma seringa de 60 ml e um filtro de 0,20? M. Rótulo e data em que este novo tubo.
NOTA: O reforço pode ser armazenada à temperatura ambiente e reutilizado até a data de expiração do seu ingrediente mais antiga expira.
3. Prepare o centro cirúrgico
- Ajuste a temperatura ambiente entre 18 ° C e 21 ° C.
- Vire na mesa de cirurgia, e ajustar o seu calor de superfície ao highetemperatura st.
- Cobrir todas as superfícies de trabalho com underpads cirúrgicos.
- Organizar uma gaiola vazia ou outro recipiente na mesa cirúrgica para aquecer.
- Organizar uma escala e um tagger ouvido na bancada.
4. Preparar a solução de sal equilibrada com a heparina de sódio
- Adicionar 0,5 ml de heparina de sódio para um frasco de soro de 500 ml de solução salina equilibrada (HBSS).
- Insira a ponta do conjunto principal prepierced tubo Y local dentro da garrafa de 0,1% heparina sódica.
5. Configure o IV Pole
- Pendure a garrafa de 0,1% heparina sódica da extensão IV pólo, e encaixe abrir a tampa do filtro de ar no conjunto principal prepierced tubo Y-site.
- Elevar a garrafa de heparina de sódio de 0,1% a 163 cm (120 mm Hg). Medir a altura da mesa para o pico do gota a gota a heparina de sódio.
- Remova as bolhas de ar na tubulação IV sacudindo manualmente o conjunto principal prepierced tubo Y-site.
6. Configure o sódio Heparina Drip
- Ligue o conjunto principal prepierced tubo Y-site para o colector de cinco válvulas.
- Ligue de calibre 30 ½ polegadas agulhas para o colector de cinco porta usando Luer macho para luer acessórios para tubos do sexo masculino.
- Introduza cada uma das agulhas de calibre 30 ½ polegadas em seu próprio segmento de 10 polegadas de tubo de calibre 30.
- Usando hemostats, quebrar as pontas das agulhas de novas de calibre 30 ½ polegadas agulhas e inserir suas extremidades sem corte no tubo de calibre 30. Esterilidade ou desinfecção das pontas de agulhas, será necessário para o passo 8.3.
- Usando fita, organizar os tubos de calibre 30 com as agulhas de tal modo que os tubos ligados às portas interiores são posicionadas na parte superior dos tubos ligados às portas exteriores. Este acordo vai evitar o enrolamento de tubos durante a punção da câmara anterior.
- Ligue o fluxo de heparina sódica 0,1% para o colector de cinco válvulas e cada porta individual.
- Certifique-se de que o 0,1%heparina sódica está fluindo fortemente para cada porta. Se uma porta está fluindo fraca, substitua o porto ou limpá-la com ar de uma seringa estéril.
- Permitir que a heparina sódica 0,1% a fluir para 2 - 3 min para remover as bolhas de ar dos tubos de calibre 30 e colector de 5 válvulas.
- Desligue todas as portas no colector de 5 válvulas.
7. Prepare os ratos para Cirurgia
- Traga os ratos para o centro cirúrgico. Fornecer garrafas de água para cada gaiola, a fim de evitar a desidratação dos animais durante a cirurgia.
- Registar o peso de cada rato.
- Injectar cada rato intraperitonealmente com 0,02 ml cocktail por peso corporal grama.
- Marcar e registrar o número de cada rato.
- Coloque todos os ratos para o recipiente vazio na mesa de cirurgia. Permitir 5-10 min para todos os ratos para alcançar profunda anesthetization como confirmado pela ausência da resposta de retirada pedal para pitada dedo do pé.
- Para cada ratinho, administrar uma gota deTropicamida em cada olho para a dilatação da pupila e lubrificação de curto prazo.
- Para cada ratinho, administrar uma gota de proximetacaína em cada olho para anestesia local e de lubrificação de curto prazo.
- Dispor os ratos na ordem de anestesia de modo que o primeiro ratinho a ser anestesiado será o primeiro rato para ser canulada.
- Permitir que cerca de 2 min para o colírio para entrar em vigor.
- Prepare pedaços de 4 polegadas rectas de fita puxando firmemente na fita. Separe um pedaço de fita para cada rato.
NOTA: Deixar de puxar firmemente na fita irá resultar na ondulação da fita.
8. canular a câmara anterior
- Organizar o primeiro mouse sob o microscópio cirúrgico, e focar o microscópio sobre a córnea preferido.
NOTA: A canulação pode ser realizada em qualquer um dos olhos. Direito à mão cirurgiões dominantes pode encontrar it mais fácil para canular o olho esquerdo, enquanto a mão esquerda cirurgiões dominantes podem preferir a direita. - Vire na primeira porta heparina sódica 0,1% no colector de cinco válvulas.
- Sob o microscópio cirúrgico, usar um par de pinças para suavemente proptose do olho. Inserir a agulha de uma cânula de calibre 30 na câmara anterior, aproximadamente, a meio caminho entre as fibras zônula e o vértice da córnea.
- Tome cuidado para evitar arranhar ou perfurar íris, lente, ou interno superfície da córnea.
- Não penetrar a córnea uma segunda vez.
- Usando um movimento de torção suave para vencer o atrito entre a cânula e a córnea, inserir a cânula profundamente na câmara anterior.
- Usar uma tira de fita adesiva para fixar o tubo de calibre 30 para a mesa. Para minimizar o movimento da cânula inserida, pressione o tubo de calibre 30 contra a mesa enquanto pegava a fita.
- Grave a hora de início da cirurgia.
- Utilizando o microscópio, verify que nenhum vazamento é aparente. Se a fuga está presente, o movimento do fluido será visível perto do olho.
- Visualmente confirmar distensão ocular por meio da observação de que o olho de I / R é maior do que o olho contralateral. Juntos, a ausência de fugas e a presença de distensão ocular demonstram uma elevação da pressão intra-ocular bem sucedida.
- Aplicar hipromelose para ambos os olhos. Hipromelose serve para lubrificar as microleaks córnea e de vedação. Reaplicar hipromelose, conforme necessário (aproximadamente a cada 30 min) para a lubrificação sustentado.
- Repita a Etapa 8 até todos os animais foram canulados.
9. Anesthesia Monitor de
- Use a pitada dedo do pé, observação visual dos bigodes, ou observação visual da cauda para verificar se cada rato permanece anestesiado. Se um rato demonstrar uma resposta pedal retirada, espasmos suiça, ou o movimento da cauda, proceder imediatamente à Etapa 9.2.
- Se um rato começa a despertar durante a cirurgia, elevadora cauda para injectar 0,05 ml de reforço intraperitoneal no abdômen inferior de trás do mouse. Permitir 1-2 min para o reforço entrem em vigor.
- Se um rato requer sedação adicionais, repita o Passo 9 conforme necessário.
10. Remover a cânula da câmara anterior
- Para cada animal, após 90 min de decorridos, puxe a cânula da câmara anterior.
- Untape o rato da mesa cirúrgica, tendo o cuidado para não perturbar a um tubo de cânula de animais adjacentes.
- Lubrifique ambos os olhos com gel lubrificante.
- Como cânulas subsequentes são removidos, organizar os ratos no contentor vazio na mesa cirúrgica para recuperar de uma cirurgia. Não desligue o fogo da mesa cirúrgica.
- Permitir, no mínimo, 2-3 horas para a recuperação na mesa cirúrgica aquecida. Observar os ratos com frequência até que tenham recuperado totalmente da anestesia.
11. Limpe a Equipment
- Desinfectar as cânulas usando álcool.
NOTA: Outros métodos para a desinfecção ou esterilização, tais como esterilização em autoclave, pode ser substituído. - Expulsar 0,1% de sódio de heparina a partir do colector de 5-válvula, agulhas de calibre 30, tubos de calibre 30, e cânulas usando uma seringa de 60 ml cheia com ar.
- Lavar o colector de 5 válvulas, agulhas de calibre 30, tubos de calibre 30, e cânulas usando um de 60 ml cheia com água destilada.
- Expelir a água destilada a partir do colector de 5-porta, agulhas de calibre 30, tubos de calibre 30, e cânulas usando uma seringa de 60 ml cheia com ar.
- Após a desinfecção das cânulas e enxaguar o aparelho de tubulação, armazenar este equipamento para reutilização.
- Loja, descarte ou desligue todos os outros equipamentos. Deixar o calor da mesa cirúrgica em.
12. Retorno Todos os ratos para suas gaiolas
- Após os ratos despertar de uma cirurgia (após 2-3 horas), retornar cada animal à sua gaiola. Fornecer alimentos gel para cada gaiola. Retornar todas as gaiolas para seus quartos designados.
- Desligue o fogo da mesa cirúrgica. Descarte todos os resíduos, e limpar a sala de cirurgia.
13. Realizar Avaliação Retinal
- Conforme o caso, recolher retinas para análise histológica ou ratos adaptar escuro para gravação eletrorretinograma.
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Representative Results
Os efeitos neurodegenerativos da retina de I / R de elevada pressão intra-ocular são geralmente avaliadas utilizando duas abordagens convencionais. NeuN imunomarcação dos núcleos neuronais revelou perda de células neuronais significativa após I / R insulto (Figura 1). Em resumo, os olhos enucleados 7 dias após I / R, foram fixadas em paraf ormaldeído, marcado com o marcador da célula neuronal NeuN, e todo-montado. As imagens foram capturadas usando microscopia confocal, e as células marcadas com NeuN foram quantificados por contagem 11. Diminui em ganglionares camada de células neuronais contagens indicam que a morte celular / induzido-R.
Deficiências na retina a função dos neurônios foram documentados utilizando eletrorretinografia (Figura 2). Resumidamente, sete dias após I / R, eletrorretinogramas escotópicas foram registrados em várias intensidades de flash. Amplitudes dos a- e b-ondas foram quantificados usando software de análise de imagem 
Figura 1. Retinal I / R induz a morte celular neuronal na camada Ganglion celular (GCL). Imagens da retina representativos de controle e I / olhos R são mostrados com barras de escala denotando 100 mm. (A) O número de células NeuN positivos no GCL é significativamente reduzida em olhos de I / R, tal como comparado com os controlos (B). n = 9, bar de erro: erro padrão, *** p <0,0001 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Retinal I / R Prejudica Retinal Neuron Function. Diminuiu a- e amplitudes de ondas b indicam prejudicada fisiologia da membrana em células neuronais seguintes I / R. n = 6, barra de erro: erro padrão, * p <0,05 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
I retina / lesões R por PIO elevada provou a sua utilidade na modelagem de danos celulares e disfunção, especialmente neurodegeneração, na unidade neurovascular da retina de roedores. Este procedimento fornece um tecido de controle robusto e é facilmente acessível em termos de sofisticação técnica. Tem-se observado neste e em outros modelos de lesão I / R que o aumento da pressão e da duração da isquemia pode aumentar a gravidade da lesão 24. Por esta razão, alguns profissionais têm optado por usar pressões isquêmicos e durações diferentes daquelas aqui 4,6-10,12 apresentado. Portanto retina I / R lesão por PIO elevada oferece uma vantagem em relação às técnicas de I / R da retina alternativos em que ela permite ajustar parâmetros cirúrgicos para acomodar seus objetivos experimentais particulares.
No entanto, técnicas alternativas têm sido utilizados para induzir lesão de I / R da retina em roedores. Ligadura do pacote nervo óptico 25,26 27 por si só tem sido utilizado para prender o fluxo sanguíneo da retina temporariamente. Estratégias semelhantes para condições sistêmicas têm exigido ligadura da artéria cerebral 28 ou artéria cefálica 29 para reduzir o fluxo de sangue sem obstruir totalmente. Uma metodologia mais raro envolve circunferencialmente comprimindo o globo da retina usando um segmento que é ponderado em ambas as extremidades 30. Embora estas estratégias têm contribuído com êxito para uma compreensão das alterações neurovasculares induzida por hipoxia na retina, a técnica aqui descrita oferece várias vantagens em relação a estas alternativas. Necessitando de danos não-retinal mínima apenas para a córnea, I / R por PIO elevada fornece uma lesão da retina mais especificamente orientado que a proporcionada por técnicas de ligação e por isso pode ser mais útil para pesquisadores interessados em doenças específicas da retina. Além disso, os métodos de PIO elevada são mais tratáveis do que ou ligadura de compressão de modelos, de tal modo que o IOP método permite a realização rápida de isquemia da retina, bem como reperfusão subsequente. Finalmente, protocolos PIO elevada exigir o mínimo de sofisticação cirúrgica e tecnológica e por isso pode ser mais amplamente acessível do que suas alternativas.
lesão da retina I / R por PIO elevada não é sem seus desafios. A canulação da câmara anterior requer destreza manual, e deve ser tomado cuidado para conservar a integridade da íris, cristalino, córnea e. Atenção também é aconselhável, após a inserção da cânula, como a cânula pode ser puxado a partir da câmara anterior, enquanto o tubo de calibre 30 é fixa com fita adesiva.
Outros processos críticos neste protocolo incluem a manutenção de uma temperatura do corpo quente para animais anestesiados, administrar anestesia reforço em tempo hábil, e sustentação de lubrificação da córnea utilizando hipromelose. Também é importante notar estresse mouse ou doença comportamentos (por exemplo, falta de higiene, curvando, Etc.) antes da cirurgia, uma vez que estas variáveis extra-cirúrgica que podem influenciar a potência do fármaco e da mortalidade. Ao assistir a estas questões, pode-se conseguir um modelo altamente regulado e reprodutível para lesão de I / R da retina.
Também deve ser reconhecido que a lesão da retina I / R por PIO elevada é apenas um modelo, e recomenda-se cautela ao extrapolar resultados para doenças específicas, em particular doenças crónicas. Embora diferindo destas doenças no período de tempo e de origem etiológico, no entanto, eu retina / lesões R por PIO elevada pode, contudo, fornecer uma plataforma sólida para avaliar os mecanismos de degeneração e recuperação da retina.
A retina é composta por células multiforme e processos de sinalização, e uma história completa de desregulação da retina continua por ser elucidado. A literatura actual demonstra a utilidade de lesão da retina de I / R de PIO elevada não só em examinar processos degenerativas da retina 6-8,10,12,mas também na identificação de alvos para a prevenção e intervenção 7,9,11,12,14 terapêutico. Além disso, há cada vez mais provas para apoiar a utilidade de lesão da retina de I / R de PIO elevada em terminais não-neuronais tais como a inflamação da retina, degeneração vascular, e vazamento 14,15,17. Dada a sua especificidade anatómica, tractability experimental, e acessibilidade técnica, retinal lesão de I / R por PIO elevada promete manter um papel de liderança na prossecução destes inquéritos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação dos Institutos Nacionais de Saúde (EY022383 e EY022683; EjD) e concessão do núcleo (P30EY001765), imagiologia e Microscopia Core Module.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | Abraxis Pharmaceutical Products | 1,000 USP/ml | |
| BSS Sterile Irrigating Solution | Alcon Laboratories, Inc. | 9007754-0212 | 500 ml |
| SC-2 kg Digital Pocket Scale | American Weigh Scales, Inc. | SC-2 kg | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1% | Bausch + Lomb | 1% (10 mg/ml) | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% | Bausch + Lomb | 0.5% (5 mg/ml) | |
| INTRAMEDIC Polyethylene Tubing | Becton Dickinson and Company | 427400 | Inner diameter: 427400 |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needles | Benton Dickinson and Company | 305106 | |
| BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8 | Benton Dickinson and Company | 309625 | |
| BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip | Benton Dickinson and Company | 309653 | |
| Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope | Carl Zeiss AG | 000000-1179-101 | |
| Sterile Syringe Filter | Corning Inc. | CLS431224 | 0.20 µm |
| Durasorb Underpads | Covidien | 1038 | 23 x 24 inches |
| Alcohol Prep | Covidien | 6818 | 2 Ply, Medium |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch | Hospira | 12672-28 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x) | Invitrogen | 10010-049 | 500 ml |
| Distilled water | Invitrogen | 15230-204 | 500 ml |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | |
| AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution | LLOYD, Inc. | 20 mg/ml | |
| Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic | MediChoice | 3-Gram Packet | |
| NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold | Navilyst Medical, Inc. | 70039355 | 5-Valve Manifold with Seven Female Ports |
| Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose | OCuSOFT, Inc. | 2.5% (25 mg/ml) | |
| Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride | Pfizer, Inc. | 100 mg/ml | |
| Trans-Pal I.V. Stand | Pryor Products | 372 | Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension |
| Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP | Vet One | 10 mg/ml | |
| V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic | VSSI | 100-4041-21 | |
| Tube Fitting Luer Male to Luer Male | Warner Instruments | 64-1579 |
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