Abstract
Tempo reale Polymerase Chain Reaction noto anche come la PCR quantitativa (q-PCR) è uno strumento ampiamente utilizzato in ecologia microbica per quantificare abbondanze gene di gruppi tassonomici e funzionali in campioni ambientali. Usato in combinazione con una reazione di trascrittasi inversa (RT-q-PCR), può anche essere impiegato per quantificare trascritti genici. q-PCR sfrutta chimiche rilevazione fluorescente altamente sensibili che consentono la quantificazione degli ampliconi PCR durante la fase esponenziale della reazione. Pertanto, i pregiudizi associati 'end-point' PCR identificati nella fase di plateau della reazione PCR sono evitati. Un protocollo per quantificare batteriche geni 16S rRNA e trascrizioni da sedimenti costieri tramite PCR in tempo reale è fornito. Innanzitutto, un metodo per la co-estrazione di DNA e RNA da sedimenti costieri, tra i passaggi aggiuntivi necessari per la preparazione di RNA privo di DNA, è delineato. In secondo luogo, una guida passo-passo per la quantificazione dei geni 16S rRNA e TRanscripts dagli acidi nucleici estratti tramite q-PCR e RT-q-PCR è delineato. Ciò include informazioni per la costruzione di curve di DNA standard e RNA. Considerazioni chiave per l'uso di saggi di RT-q-PCR in ecologia microbica sono inclusi.
Introduction
I microrganismi sono la pietra angolare della funzione biosfera ecosistema di guida. La maggior parte dei microrganismi rimangono uncultured 1. Pertanto approcci basati molecolari sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione della diversità e della funzione dei microrganismi nell'ambiente. Al centro di questi approcci è l'estrazione di acidi nucleici da campioni ambientali e la successiva amplificazione di geni bersaglio mediante Polymerase Chain Reaction (PCR).
Il primo passo di estrazione di DNA / RNA propone di lisare le pareti cellulari della comunità microbica presente, rimuovere molecole nucleico-acido non indesiderate (sostanze esempio, organici e inorganici) e mantenere DNA / RNA in soluzione per ulteriori analisi valle. Tra le diverse opzioni disponibili in letteratura 2,3,4,5, tra cui una gamma di kit di estrazione commerciale, il metodo Griffiths 6 è largamente impiegato 7,8,9. E 'conveniente e particularly ben adatto a sedimenti in quanto utilizza una fase di stallonatura battere per lisare le cellule e incorpora misure per minimizzare la co-estrazione di inibitori della PCR, come gli acidi umici, mentre recuperando contemporaneamente DNA e RNA.
La seconda fase utilizza la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare geni bersaglio, come il marcatore tassonomica 16S rRNA, dagli acidi nucleici estratti. Questo approccio ha e continua a facilitare l'esplorazione del non caratterizzato microbica scatola nera 10,11. Tuttavia, i metodi end-point PCR basato soffrono di vari limitazioni che possono influenzare la caratterizzazione delle comunità microbiche 12. Per quantificare con precisione abbondanze gene / trascrizione, real-time PCR, noto anche come la PCR quantitativa (qPCR) deve essere utilizzato. qPCR sfrutta sistemi di colorante reporter fluorescenti che traccia accumulo amplicone dopo ogni ciclo della PCR. Ciò è significativo in quanto significa che la quantificazione può verificarsi durante la fase esponenziale precoce invecerispetto al punto finale, la fase della reazione PCR, quando la resa amplicone è ancora direttamente proporzionale all'abbondanza iniziale del gene bersaglio.
Due sistemi giornalista sono comunemente utilizzati: un intercalando macchia acido nucleico 13 e il 5 attività di '3' esonucleasi della DNA polimerasi 14. Dal momento che il precedente sistema giornalista si lega indistintamente a tutto il DNA a doppia elica, può portare ad una sovrastima della sequenza di destinazione se si verificano ampliconi non specifici indesiderati o dimeri di primer di prodotti. Per aggirare questo, può essere richiesto vasta ottimizzazione di amplificazione. In quest'ultimo sistema, modello di amplificazione viene monitorato utilizzando una combinazione di attività 5 'nucleasi di Taq polimerasi che fende un fluoroforo da una sonda interna. Questa caratteristica aumenta la specificità del test dovuta all'utilizzo di una sonda fluorogenica che si lega solo al complementari SEQUENC specifico bersaglioe tra la coppia di primer. Con entrambi chimiche quantificazione si ottiene determinando il valico (Cp) se l'accumulo di ampliconi PCR, come misurato da un aumento della fluorescenza, è significativamente superiore fluorescenza di fondo.
qPCR è stato ampiamente utilizzato in ecologia microbica per determinare le abbondanze di geni in diversi ambienti 15. Inoltre, la trascrizione inversa di RNA a cDNA è combinato con qPCR e RT-qPCR per quantificare l'espressione genica. Quindi, qPCR e RT-qPCR rappresentano veloci, metodi efficaci per la quantificazione del numero di geni e / o di trascrizione all'interno di campioni ambientali.
I microrganismi in sedimenti costieri auto vari processi ecosistemici, compresa la mineralizzazione della sostanza organica, la degradazione degli inquinanti e il cicli biogeochimici dei macronutrienti, come 16,17,18 azoto. La comprensione esaustiva di queste trasformazioni richiede un accoun completat dei contribuenti popolazioni microbiche, compresi i dati quantitativi sulle gene e la trascrizione abbondanze. Qui introduciamo una serie di accuratamente testati protocolli, semplificate e standardizzate per la quantificazione dei batteri di geni e la trascrizione abbondanze 16S rRNA nei sedimenti costieri. Il protocollo delinea la raccolta dei campioni, DNA simultanea e l'estrazione di RNA, la preparazione RNA privi di DNA, il controllo della qualità degli acidi nucleici estratti, generazione di 16S rRNA-DNA e gli standard -RNA e la quantificazione dei campioni ambientali. I dati quantitativi derivati dai metodi qui descritti sono necessari per far luce sulle comunità microbiche di guida ecosistemi costieri.
Protocol
1. DNA e RNA Estrazione da Marine sedimenti costieri
- Preparazione di ribonucleasi (RNasi) materiale-free e di lavoro
- Preparare acqua distillata priva di RNAsi (DH 2 O) trattando con 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC) e incubare a 37 ° CO / N. Rimuovere DEPC residua in autoclave dH 2 O a 121 ° C per 15 min. Usa DEPC trattati dH 2 O per fare tutte le soluzioni.
- Cuocere tutto in vetro a 180 ° CO / N. Rimuovere coperchi di plastica e cerchi, ammollo in una soluzione di 2 M NaOH O / N, e sciacquare con DEPC trattati dH 2 O prima dell'uso.
- Preparare una soluzione tampone CTAB-fosfato come da Tabella 1.
- Preparare la soluzione di precipitazione PEG-NaCl come da Tabella 2.
- Pulire tutte le superfici di lavoro (ad esempio, panca, microcentrifuga, fumi-cappuccio) e micropipette con RNasi-decontaminazione soluzione prima di iniziare. Indossare guanti durante l'intera procedura. Utilizzare Plasticware RNasi-free con punte di filtro micropipetta per evitare campione contaminazione incrociata.
- raccolta di campioni ambientali e di stoccaggio
- Raccogliere sedimenti costieri durante la bassa marea con una sterile tubo da 50 ml falco dalla parte superiore di 2,5 cm. Raccogliere circa 15-20 g di sedimenti. chiudere con cautela il coperchio dopo la raccolta del campione. Transport immediatamente al laboratorio in un dispositivo di raffreddamento a 4 ° C per l'elaborazione immediata.
- Omogeneizzare il campione mescolando con una spatola sterile e un'aliquota 0,5 g di peso umido sedimenti in 2 ml tubo tallone battitura. Aliquota repliche aggiuntive, flash-freeze mettendo in azoto liquido. Aliquote conservare a -80 ° C. Attenzione: Indossare guanti protettivi e occhiali di sicurezza durante la manipolazione di azoto liquido.
Nota: Se il sito campo non si trova vicino ad un laboratorio, un'aliquota 0,5 g di sedimento in 2 ml microprovette sterili presso il sito di campo. Flash-congelare i tubi mettendo immediatamente in Liazoto quid e il trasporto al laboratorio. Conservare i campioni a -80 ° C fino al trattamento.
- Co-Estrazione di DNA e RNA da sedimenti
Nota: Il protocollo che segue è una versione modificata del metodo Griffiths 6.- Aggiungere 500 microlitri tampone CTAB-fosfato e 500 microlitri fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1) al 2 ml tubo tallone-lisi contenente 0,5 g di sedimenti e invertire la provetta 5-10 volte per omogeneizzare il campione.
Attenzione: Eseguire questo passaggio in un fumi-cappuccio indossare adeguato equipaggiamento protettivo (vale a dire, camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza) in ogni momento. - Vortex a tutta velocità per 2,5 min. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- In un fumi-cappa estrarre lo strato acquoso superiore e trasferire in una nuova 1,5 ml provetta sterile. Mantenere i campioni sul ghiaccio, aggiungere 500 ml di cloroformio ghiacciata: alcool isoamilico (24: 1).
- Capovolgere varie volte fino un'emulsione è visibLe. Centrifugare per 10 min a 16.000 xg a 4 ° C.
- In un fumi-cappa estrarre lo strato acquoso superiore e inserirlo in un nuovo 1,5 ml provetta sterile. Precipitare gli acidi nucleici con l'aggiunta di due volumi di soluzione al 30% di NaCl PEG e mescolare bene.
- Incubare in ghiaccio per 2 ore o lasciare i campioni a 4 ° CO / N.
- Alla fine di centrifugare i campioni una incubazione a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C.
Nota: Un pellet può essere visibile nella parte inferiore del tubo. - Rimuovere delicatamente il surnatante con una micropipetta, fare attenzione a non disturbare il pellet. Lasciare circa 10 ml di soluzione di PEG nel tubo e aggiungere 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%.
- Centrifugare per 20 minuti a 16.000 xga 4 ° C. Rimuovere lentamente etanolo con una micropipetta facendo attenzione a non toccare il pellet.
- Centrifugare per 5 secondi e rimuovere l'etanolo residuo utilizzando una micropipetta. Lasciare il pellet asciugare all'aria per circa 5 minuti.
- Risospendere il pellet in 50 microlitri DEPC trattatiH 2 O. Esaminare la qualità e la resa di DNA / RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio in esecuzione 5 microlitri su un gel di agarosio 1% 19. Dividere gli acidi nucleici in due aliquote, 15 microlitri per DNA e 30 microlitri per l'RNA.
- Conservare il DNA a -80 ° C fino al momento dell'uso. Isolare RNA come descritto nella sezione successiva.
- Aggiungere 500 microlitri tampone CTAB-fosfato e 500 microlitri fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1) al 2 ml tubo tallone-lisi contenente 0,5 g di sedimenti e invertire la provetta 5-10 volte per omogeneizzare il campione.
2. Preparazione di RNA e di verifica della qualità di RNA privi di DNA
- Digestione del DNA
- Aggiungere 3 ml di DNAsi I buffer e 1,5 ml di DNAsi I volume 30 microlitri di acidi nucleici, incubare a 37 ° C per 30 min.
- Mescolare il reagente DNAsi inattivazione vortexando per 30 sec. Aggiungere 4,8 ml di soluzione al campione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, occasionalmente toccare il fondo dei tubi per miscelare la soluzione.
- Centrifugare a 10.000 xg per 90 sec a RT, trasferire il surnatante (RNA) in una nuova provetta, facendo attenzione a non trasferire precipitato che può inibire reazioni a valle.
- controllo di qualità RNA
- Aggiungere 2 ml di RNA a 18 ml di sterile dH RNasi-free 2 O per diluire 1:10.
- Nelle reazioni di PCR separati, aggiungere 1 ml di puro o diluizione 1:10 di RNA ad uno sterile 0,5 ml provetta PCR. Aggiungere componenti di reazione PCR per amplificare il gene 16S rRNA come da Tabella 3. Includere un (per es., DNA estratto da una coltura batterica pura), un "inibitore PCR" controllo "positivo" (cioè, 1 ml di DNA positivo coltura pura e 1 ml di RNA estratto ordinata) e un controllo "negativo" di sterili dH RNasi-free 2 O.
- Impostare il termociclatore con i seguenti parametri di amplificazione: 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 sec, 57 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min) x 35 cicli, 72 ° C 10 min.
- Eseguire il 10% del prodotto di PCR su un gel di agarosio 1% a 85 V per 40 min. Ripetere il trattamento DNAsi I se un prodotto PCR è formata nella RN ambientaleA campioni.
- Aggiungere 2 ml di RNA a 18 ml di sterile dH RNasi-free 2 O per diluire 1:10.
3. Generazione di First Strand cDNA da RNA
- Aggiungere i reagenti come da Tabella 4 ad un RNAsi / DNAsi libera 0,2 ml provetta PCR.
- Incubare il campione a 65 ° C 5 min. Mettere in ghiaccio per almeno 1 min e poi incubare a 25 ° C per 10 min.
- Per lo stesso tubo di aggiungere i reagenti elencati nella Tabella 5.
- Incubare il campione a 55 ° C per 50 min. Inattivare la reazione a 72 ° C per 10 min.
- Conservare cDNA a -20 ° C fino al momento dell'uso.
4. PCR quantitativa
- Generazione di standard di DNA per qPCR
- Amplificare batterica sequenza 16S rRNA 20 (o qualsiasi altra sequenza di interesse) da DNA genomico estratto da colture pure con primers q-PCR (1369F e 1492R 21).
- Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore.
- Clonare il purificato PCRprodotto in una sporgenza 3'-T sistema vettore di clonazione in base alle istruzioni del produttore.
- Trasformare il vettore contenente la PCR inserto in Escherichia coli JM109 cellule competenti in base alle istruzioni del produttore.
- Piatto 50 ml di trasformazione Onto ampicillina (100 ug / ml), X-gal (20 ug / ml) e IPTG (0,5 mM) Luria Bertani piastre di agar (triptone 10 g / L, estratto di lievito 5 g / L, NaCl 10 g / L, Agar 15 g / L). Incubare O / N a 37 ° C.
- Selezionare un singolo trasformante bianco positivo dalla piastra. Seminare trasformante positivo in 50 ml di brodo LB contenente 100 mg / ml di ampicillina e incubare O / N agitazione a 250 rpm a 37 ° C.
- Dalla cultura O / N, isolare e purificare il plasmide utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore.
- Linearizzare il plasmide con un enzima di restrizione adeguato che è in grado di tagliare il plasmide volta (per esempio, EcoRI).
- Determinare la concentrazione di DNA plasmidico da assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro 19.
Nota: In alternativa, la precisione di quantificazione può essere migliorata mediante l'uso di un colorante legante il DNA fluorescente usato in congiunzione con un fluorimetro. - Sequenza plasmide inserto confermare il formato del bersaglio in basi. Calcolare la quantità (cioè, percentuale) di DNA dell'inserto nel plasmide (ad esempio, in un vettore 3.000 bp, un frammento di DNA 123 bp è 3,9% del DNA totale) e moltiplicarlo per la concentrazione ottenuta in 4.1.10, per determinare la concentrazione di DNA del target (inserto).
- Utilizzare la seguente equazione per calcolare le copie del bersaglio per ml:
carico / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - Calcolare l'obiettivo Peso molecolare (TMW) moltiplicando il numero di coppie di basi del DNA bersaglio per il peso molecolare medio del DNA a doppio filamento (dsDNA, 660 Daltons per coppia di basi).
- Diluire il DNA bersaglio in un intervallo da 10 a 10 10 2 copie utilizzando 2 ml di DNA e 18 ml di dH sterile 2 O. Mescolare ogni ben di diluizione e spin down brevemente prima di effettuare la successiva diluizione.
- Generazione di curva standard RNA per qPCR
- Dal punto 4.1.5, schermo un numero di colonie bianche (circa 5) dalla colonia PCR 19 utilizzando il contrario di fondo di destinazione (ad esempio, R1492) e l'attaccante plasmide vettore fondo M13F.
Nota: Questa combinazione di primer amplificherà inserti clonati nel corretto orientamento senso con un sito promotore T7 a monte. - Purificare il prodotto di PCR utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. Quantificare il purificato PCR product a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro.
- Aggiungere 200 ng del prodotto di PCR in un volume finale di 20 ml con 7,5 mM di ogni ribonucleotide, tampone di reazione 1 e T7 polimerasi T7 1 enzimatico per la reazione di trascrizione in vitro in.
- Incubare la reazione per 4 ore a 37 ° C. Aggiungere 1 unità di RNase-free DNasi I alla reazione, incubare per 15 minuti a 37 ° C per rimuovere DNA stampo.
- Recuperare in vitro RNA trascritto da precipitazione in etanolo 19 e quantificare le rese di RNA utilizzando un fluorimetro o assorbanza a 260 nm.
- Calcolare il numero trascrizione per ml di RNA. Aggiungere il numero di coppie di basi in RNA bersaglio (ad esempio, 123 basi) alla lunghezza del promotore T7 (153 basi) e moltiplicare per il peso molecolare medio di RNA, 340 Daltons per base.
- Aggiungere 500 ng di RNA quantificato obiettivo di una reazione della trascrittasi inversa (RT), come descritto nella sezione 3. In serie diluire il cDNA come indicato in 4.1.13 per l'usocome la curva standard.
- Dal punto 4.1.5, schermo un numero di colonie bianche (circa 5) dalla colonia PCR 19 utilizzando il contrario di fondo di destinazione (ad esempio, R1492) e l'attaccante plasmide vettore fondo M13F.
- Real-Time PCR
- Scongelare il DNA ambientale / campioni di cDNA, standard e reagenti qPCR su ghiaccio. Proteggere la sonda fluorogenica dalla luce.
- Diluire gli standard per la curva standard come indicato in 4.1.14. Fare 1:10 diluizioni del DNA ambientale / cDNA da pulito per 10 -3 con l'aggiunta di 2 ml di campione a 18 ml di dH sterili 2 O.
- Fare una reazione master mix per il numero totale di reazioni più il 10% come da Tabella 6 (primer e sonda) e Tabella 7 (miscela di reazione). Mescolare bene e centrifugare brevemente.
- Aggiungere 19 ml di master mix e 1 ml di modello (Standard, campioni ambientali o acqua per il controllo negativo) in ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti ottica qPCR. Eseguire ogni reazione (standard, campioni ambientali e controlli negativi) in triplice copia.
- Coprire la piastra a 96 pozzetti con una copertura ottica q-PCR. Centrifugare brevemente la piastra. caricare ilpiastra nel blocco di riscaldamento della macchina qPCR e chiudere il coperchio.
- Aprire il software di gestione qPCR. Fare clic sulla scheda "protocollo", fai clic su "Crea nuovo", aggiungere le seguenti condizioni di amplificazione: 3 min 95 ° C, (10 sec 95 ° C, 30 sec a 60 ° C) x 40 cicli. Impostare il volume del campione di 20 microlitri, fare clic su "OK" e salvare il protocollo.
- Fare clic sulla scheda "Plate". In "Modifica selezionati" click "selezionare fluoroforo", aggiungere il colorante rapporto per la sonda del caso, ad esempio, fluoresceina. Fai clic su "OK".
- Evidenziare pozzetti contenenti gli standard, selezionare "standard" dal menu "tipo campione". Fai clic su "replicare serie" per cambiare "replicare dimensioni" a 3, su "Apply". Fai clic su "serie di diluizioni" per aggiungere concentrazione iniziale calcolata per lo standard 1, indicare il fattore di diluizione (10), selezionare "diminuendo" o "crescente" a seconda dell'ordine è stata aggiunta la curva standardalla piastra. Fai clic su "Applica".
- Evidenziare la posizione contenenti i campioni sconosciuti, selezionare "sconosciuto" dal "tipo campione" menu a discesa. Fai clic su "replicare serie", e cambiare "replicare dimensioni" a 3. Fare clic su "Applica". Modifica nomi dei campioni in "nome del campione". Ripetere la procedura per controlli Template pozzi (NTC).
- Fai clic su "OK" nella finestra editor di piastra e salvare il file. Fai clic su "Start Esegui".
- Al termine della corsa, si aprirà la finestra di analisi dei dati. Fare clic sulla scheda "quantificazione" per visualizzare la curva standard, descrittori standard di curva (tabella 8) e le trame di amplificazione.
- Fare clic sulla scheda "Dati quantificazione" per i valori Cp e corrispondente di partenza quantità di gene (SQ) di campioni sconosciuti. tavolo Esporta in un foglio di calcolo, se necessario.
- abbondanze gene Moltiplicare da campioni sconosciuti per il fattore di diluizione, la quantità di sedimenti estrata da e volume totale di acidi nucleici sono stati eluiti in ottenere copie del gene per grammo di sedimento peso umido.
Nota: Eluire il DNA da 0,5 g di sedimento in 50 ml, diluire 1/10, aggiungere 1 ml come modello per una reazione di q-PCR; calcolare copie del gene g -1 sedimenti moltiplicando: copie del gene ml di DNA x diluizione del volume fattore x eluizione x 2.
Representative Results
L'estrazione di DNA buona qualità e RNA da sedimenti è il primo passo per la quantificazione dei geni e la trascrizione abbondanze. Un successo rese di estrazione chiare DNA e RNA fasce come indicato in figura 1 per il campione AC, dove taglienti bande 23S e 16S rRNA sono visibili oltre al alto peso molecolare banda DNA genomico.
Figura 1. DNA / RNA estrazione. I risultati tipici di estrazione di DNA / RNA da triplice copia (ABC) 0,5 g sedimenti costieri. 5 ml di DNA / RNA è stato eseguito su un agarosio 1,4% a 85 V per 40 min. Un marcatore molecolare nell'intervallo 10,037-200 bp è stato utilizzato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Un protocollo reazione qPCR è delineato rivolge 16S rRNA DNA. Per 16S rRNA trascrizioni sostituiscono il cu serieRVE e modello con cDNA. Come campioni incogniti vengono quantificati contro la curva standard, è indispensabile per garantire che la curva standard è di buona qualità. La Figura 2 mostra la preparazione di (A), curve standard e diluizioni di DNA ambientale, (B), l'amplificazione della curva standard e campioni ambientali (C) conversione di curva standard di una regressione lineare e calcolo del numero di copie di geni. Quando una serie di diluizione di 10 volte è correttamente preparato e amplificato la differenza 3.3 ciclo tra ogni diluizione standard è visto (ci vogliono 3,3 cicli per un aumento di dieci volte in modello a efficienza di amplificazione 100%) (Figura 2BI). Le curve standard descrittori, tra cui i valori di R 2 di 0.99 e l'efficienza della PCR all'interno della gamma da 90 a 110% (Figura 2C) sono desiderati. È importante segnalare valori Cp dal alcun controllo template (NTC) se presente. In questo caso un cutoff Cp per gli standard ed i campioni 3,3 cicli (<em> cioè, un log volte) superiore al valore Cp del NTC è imposto 20 (Figura 2Cii). Modello Unknown estratto dal DNA sedimento è stato quantificato da pulito, 10 -1, 10 -2 e -3 10 diluizioni (B). Il campione puro non amplificare, i valori Cp di 10 -1 a 10 -3 diluizioni erano 24.12, 26.02 e 28.40 rispettivamente. La NTC Cp era 30,5, è stato imposto un taglio del NCT del 27,2. Conversione abbondanze gene per g -1 bagnato sedimenti peso portato a 2,5 x 10 7 e 7.1 x 10 7 per 10 -1 e -2 10, rispettivamente, per la gamma di diluizione. 10 -3 diluizione Cp era al di sotto del valore soglia NTC, e pertanto non è stato utilizzato. In questo caso il 10 -2 è stato selezionato come la diluizione modello ottimale.
Figura 2. 16S rRNA gene QPCR amplificazione del DNA standard e ambientale estratto da sedimenti costieri. Preparazione di (A) i) curva standard DNA e ii) diluizioni di DNA ambientale per qPCR amplificazione, (B) qPCR amplificazione di i) curva standard DNA e ii) campioni ambientali, Cp per ogni campione sono mostrati. (C) i) di regressione lineare della curva standard con descrittori curva standard; ii) il calcolo delle abbondanze gene da campioni ambientali. NTC:. Controllo modello negativo Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Quantità |
| CTAB | 5 g |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2.58 g |
| KH 2 PO 4 | 0,1 g |
| NaCl | 2,05 g |
| dH 2 O | fino a 100 ml |
Tabella 1. Preparazione di tampone CTAB-fosfato.
| Reagente | Quantità |
| PEG 6000 | 30 g |
| NaCl | 9.35 g |
| dH 2 O | fino a 100 ml |
| Nota: aggiungere PEG 6000 lentamente sotto un moderato riscaldamento e agitazione di 50 ml di dH 2 O. | |
Tabella 2. Preparazione della soluzione precipitazioni PEG-NaCl.
| Reagente | Quantità |
| RNA non diluito / 01:10 RNA diluito | 1,0 ml |
| 10x PCR Buffer | 5.0 ml |
| dNTP 10 mM | 1,0 ml |
| 63F primer forward | 1,0 ml |
| CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC | |
| 518R primer reverse | 1,0 ml |
| ATT ACC GCG GCT GCT GG | |
| Taq polimerasi | 0,4 ml |
| DH RNasi-free 2 O | 40,6 ml |
Tabella 3. qualità RNA Master Mix di controllo PCR senza DNA.
| Reagente | Quantità |
| RNA | 0,5-5 mg |
| dNTP 10 mM | 1 ml |
| Reverse Primer 10 micron / a caso hexamers 50 micron | 1 ml |
| DEPC-H 2 O | Fino a 13 ml |
Tabella 4. cDNA mix reazione di sintesi A.
| Reagente | Quantità |
| Buffer 5x | 4 pl |
| digitale terrestre | 1 ml |
| RNase Inhibitor | 1 ml |
| Trascrittasi inversa | 1 ml |
Tabella 5. cDNA mix reazione di sintesi B.
| Bersaglio | nome Primer | Sequenza | Ricottura T (° C) | Riferimento |
| batteri 16S rRNA | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TCY CGG | 56 | Suzuki et al. 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (sonda) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| Reagente | Quantità |
| 2x Master Mix | 10 microlitri |
| Primer Forward (10 micron) | 0,8 ml |
| primer reverse (10 micron) | 0,8 ml |
| Probe (10 micron) | 0,4 ml |
| acqua | 7,0 ml |
| Volume finale | 19 ml |
Tabella 7. tempo reale miscela di reazione PCR.
| descrittore | Importanza |
| Coefficiente di correlazione (R 2) | Una misura della linearità della curva standard. Idealmente dovrebbe essere R 2 = 1. Valore di R 2 = 0,98-0,99 sono accettabili. |
| Slope (α) | Una misura dell'efficienza di reazione. Idealmente, esso dovrebbe essere equivalente a -3,32. Valore nell'intervallo compreso tra -3,58 e -3,1. |
| Efficienza (= 10 (-1 / pendenza) -1) | Se è al 100%, i modelli raddoppia dopo ogni ciclo termico durante l'amplificazione esponenziale. Una buona gamma efficienza è tra il 90 e il 110%. |
| Y Intercept (β) | Il limite teorico di rilevazione della reazione. Anche se non utilizzato per quantificare la sensibilità di reazione, è importante quando si confrontano diverse curve standard dello stesso bersaglio. |
Tabella 8. QPCdescrittori di reazione r.
Discussion
La combinazione di DNA di estrazione / RNA con qPCR fornisce un metodo rapido, preciso, relativamente conveniente per la quantificazione sensibile del gene e la trascrizione abbondanze da una serie di campioni ambientali, come ad esempio sedimenti costieri.
L'estrazione degli acidi nucleici iniziale è il passo fondamentale per garantire un quadro rappresentativo della comunità microbica presente si ottiene 22. Un certo numero di limitazioni devono essere considerati per il protocollo di estrazione: a) la realizzazione di lisi cellulare totale, b) co-estrazione di composti inibitori (ad esempio, acidi umici o polyphenolics), c) DNA contaminante nella frazione RNA, d) rapida degradazione degli acidi nucleici estratti se conservato. Precauzioni devono essere prese al fine di aggirare queste limitazioni. Ad esempio, particolare attenzione deve essere presa per assicurare che l'estrazione degli acidi nucleici è ottimizzato per il tipo di campione (ad esempio, sedimenti, suoli, acque di scarico, ecc). Miglioramenti significativi di resa di acido nucleico e la qualità sia per DNA e RNA possono essere realizzati effettuando esperimenti preliminari 23. Per ridurre al minimo l'effetto di composti inibitori su applicazioni basate sulla PCR 24, testare una serie di diluizioni del DNA estratto e RNA. Per aggirare la rapida degradazione del DNA / RNA estratto da più cicli di gelo-disgelo ed evitare la possibile perdita di informazioni genetiche, memorizzare più piccole aliquote di volume a -80 ° C.
Quando accuratamente progettato, qPCR è un metodo robusto, altamente riproducibile e sensibile. In particolare, i metodi per l'amplificazione e la costruzione curva standard descritte in questo protocollo può essere adattato per qualsiasi bersaglio gene di interesse, compresi gli altri marcatori filogenetici (vale a dire, archeali 16S rRNA, 18S rRNA fungine) o geni coinvolti in funzioni importanti per l'ambiente. Limitazioni nell'uso di qPCR sono: a) la generazione di riproducibile alta qualità sCurva tandard per la quantificazione assoluta, b) la scelta di primer / sonde e ottimizzazione delle condizioni di saggio q-PCR, c) l'uso di bassa qualità / acidi nucleici tranciate, d) la scelta della diluizione di lavoro di DNA / RNA per evitare l'inibizione . Inoltre, si deve considerare che la tecnica qPCR fornisce abbondanze gene / trascrizione che non può equiparare alla cella conta: questo è particolarmente vero quando i geni 16S e 18S rRNA sono mirati, come i microrganismi hanno diversi numero di copie del gene ribosomiale nel loro genoma 25.
curve standard di qualità poveri si tradurrà in quantificazione imprecisa del gene di interesse. E 'buona norma conservare uno stock di elevati standard di concentramento in piccole aliquote da cui curve standard freschi possono essere fatte. Non conservare le curve standard, sempre fare diluizioni fresche da uno stock di la più alta concentrazione di volta in volta. Per precisa quantificazione dei campioni ambientali assicurare la gamma di concentrazioni della stanCurva Dard abbraccia i valori Cp attesi dei campioni sconosciuti. Quando quantificazione trascrizioni, costruire la curva standard da RNA non DNA a doppio filamento. Quando possibile, la quantificazione dei campioni da confrontare direttamente dovrebbe essere completata entro un singolo test per evitare variabilità inter-saggio 20. Questo potrebbe non essere sempre possibile. Pertanto, per confrontare abbondanze di geni che si generano tra test è consigliabile avere un sotto-insieme casuale di campioni replicati tra i saggi. Un'ampia selezione di primer e sonda set sono attualmente disponibili per il targeting qPCR taxa microbica e gruppi funzionali è necessario 15. Una particolare attenzione nella scelta di questi al fine di garantire sia la copertura massima e specificità per il gruppo target. Se l'efficienza di reazione di un dosaggio qPCR non è soddisfacente, la risoluzione dei problemi inizia con test differenti condizioni di ciclo termico (come tempo di ricottura e / o temperatura) e / o condizioni di reazione, ad esempio, variando le concentrazioni primer sonda. OSNO le condizioni di analisi e di reazione q-PCR sono ottimizzati, effettuare sempre un test iniziale di una serie di diluizioni di DNA / cDNA per determinare la concentrazione modello appropriato. Selezionare l'intervallo di diluizione conseguente numero di copie più alto come la diluizione modello ottimale per ulteriori analisi.
Attualmente, le tecnologie di sequenziamento di prossima generazione capannone in modo efficiente luce sulla struttura delle comunità microbiche e funzioni in una pletora di ambienti 26,27,28. Tuttavia, questi insiemi di dati sono spesso basate su end-point PCR librerie ampliconi e quindi forniscono solo valutazioni semi-quantitative della abbondanza dei taxa particolare. Quindi, la capacità di tempo reale PCR basato a bersaglio specifici marcatori tassonomici (da alto dominio fino al livello di deformazione) permette la validazione efficace dei risultati ottenuti dal sequenziamento di prossima generazione. Inoltre, qPCR è stato utilizzato con successo in combinazione con altri metodi molecolari ecologia microbica quali ISO stabiletope sondare (SIP) o microarray filogenetici / funzionali. In combinazione con l'ex strumento, qPCR può essere utilizzato per quantificare la comunità metabolicamente attiva 29,30. In combinazione con l'analisi di microarray, qPCR fornisce chiave di interpretazione quantitativa dei marcatori-based e funzionale del gene filogenetici indagini ambienti 31,32.
Pertanto, utilizzato da solo o in combinazione con altri (spesso basate sui processi) valutazioni della funzione degli ecosistemi, la PCR quantitativa è uno strumento essenziale per ecologisti microbici nell'esplorazione del legame sfuggente tra le comunità microbiche e le funzioni dell'ecosistema.
Acknowledgments
Questa pubblicazione ha emanato da una ricerca condotta con il sostegno finanziario del Natural Environment Research Council (NERC) con il numero concessione NERC NE / JO11959 / 1 e Science Foundation Ireland e la Marie-Curie Azione COFUND sotto Concessione Numero 11 / SIRG / B2159awarded a CJS e il Consorzio di ricerca accademica Orientale (ARC orientale).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
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