Abstract
Real Time Polymerase Chain Reaction også kjent som kvantitativ PCR (q-PCR) er et mye brukt verktøy i mikrobiell økologi å kvantifisere genetiske Forekomsten av taksonomiske og funksjonelle grupper i miljøprøver. Brukes i kombinasjon med en revers transkriptase reaksjon (RT-q-PCR), kan det også brukes til å kvantifisere genet transkripsjoner. q-PCR gjør bruk av svært sensitive deteksjons fluorescerende kjemikalier som tillater kvantifisering av PCR-amplikoner i løpet av den eksponensielle fase av reaksjonen. Derfor blir de skjevheter knyttet til "end-point" PCR detektert i platåfasen av PCR-reaksjonen unngås. En protokoll for å kvantifisere bakterielle 16S rRNA gener og transkripsjoner fra kystsedimenter via real-time PCR er gitt. For det første en fremgangsmåte for ko-ekstraksjon av DNA og RNA fra kyst sedimenter, inkludert de ytterligere trinnene som er nødvendig for fremstillingen av DNA-fri RNA, er angitt. For det andre, en steg-for-steg guide for kvantifisering av 16S rRNA gener og transcripts fra de utpakkede nukleinsyrer via q-PCR og RT-q-PCR er skissert. Dette inkluderer informasjon om bygging av DNA og RNA standardkurver. Viktige faktorer for bruk av RT-q-PCR-analyser i mikrobiell økologi er inkludert.
Introduction
Mikroorganismer er hjørnesteinen i biosfæren kjøre økosystem funksjon. Flertallet av mikroorganismer forbli uncultured en. Derfor molekylære baserte tilnærminger er grunnleggende for å fremme vår forståelse av mangfold og funksjon av mikroorganismer i miljøet. Sentralt til disse metodene er utvinning av nukleinsyrer fra miljøprøver og påfølgende amplifikasjon av målgener ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR).
Det første trinn i DNA / RNA-ekstraksjon som mål å lysere celleveggene i den mikrobielle fellesskap til stede, fjerne uønskede ikke-nuklein-syremolekyler (for eksempel organiske og uorganiske stoffer) og beholde DNA / RNA i oppløsning for ytterligere nedstrøms analyse. Blant flere alternativer tilgjengelig i litteraturen 2,3,4,5, inkludert en rekke kommersielle utvinning kits er Griffiths metoden seks vidt ansatt 7,8,9. Det er kostnadseffektivt og particularly vel egnet til sedimenter som den bruker en vulst ledende trinn å lysere cellene, og omfatter trinn for å minimere den ko-utvinning av PCR-inhibitorer, slik som humussyrer, mens samtidig å gjenvinne DNA og RNA.
Det andre trinnet benytter polymerase kjedereaksjon (PCR) for å amplifisere mål-gener, slik som 16S rRNA taksonomiske markør, fra de ekstraherte nukleinsyrer. Denne tilnærmingen har og fortsetter å lette utforskningen av ukarakterisert mikrobielle sorte boksen 10,11. Men end-point PCR-baserte metoder lider av ulike begrensninger som kan skjevhet karakterisering av mikrobielle samfunn 12. For nøyaktig kvantifisere gen / karakter abundances, må real-time PCR, også kjent som kvantitativ PCR (qPCR) anvendes. qPCR utnytter fluorescerende reporter fargestoff systemer som sporer amplicon akkumulering etter hver syklus av PCR. Dette er viktig fordi det betyr at kvantifisering kan forekomme i løpet av den tidlige eksponensielle fase, hellerenn endepunktet, fase av PCR-reaksjonen, når amplikonet utbyttet fremdeles er direkte proporsjonal med den initielle overflod av målgenet.
To reporter-systemer blir ofte brukt: en interkalerende nukleinsyre flekk 13 og det 5'-3'-eksonukleaseaktivitet til DNA-polymerasen 14. Siden det tidligere rapportørsystemet bindes indistinctively til alle dobbeltkjedet DNA, kan det føre til en overestimering av målsekvensen dersom uønskede ikke-spesifikke amplikonene eller primer-dimerer ved produkter oppstår. For å unngå dette, kan omfattende optimalisering av forsterkning være nødvendig. I det sistnevnte system blir mal forsterkning spores ved hjelp av en kombinasjon av en 5 'nukleaseaktivitet av Taq-polymerase som spalter en fluorofor fra en indre sonde. Dette trekk øker spesifisiteten av analysen på grunn av utnyttelsen av et fluorogent probe som binder seg bare til den komplementære target-spesifikke-sekvensene mellom primerpar. Med begge kjemi kvantifisering oppnås ved å bestemme krysningspunktet (CP) hvor akkumuleringen av PCR-amplikoner, som målt ved en økning i fluorescens, er betydelig over bakgrunnsfluorescens.
qPCR har vært mye brukt i mikrobiell økologi for å fastslå genet i hopetall i ulike miljøer 15. Videre er revers transkripsjon av RNA til cDNA kombinert med qPCR og RT-qPCR å kvantifisere genekspresjon. Derfor qPCR og RT-qPCR representerer raske og effektive metoder for kvantifisering av genet og / eller transkripsjons tall innenfor miljøprøver.
Mikroorganismer i kystnære sedimenter kjøre ulike økosystemprosesser, herunder mineralisering av organisk materiale, nedbrytning av miljøgifter og biogeokjemiske kretsløp av makronæringsstoffer som nitrogen 16,17,18. Den uttømmende forståelse av disse transformasjoner krever en omfattende regnskapst av de medvirkende mikrobielle populasjoner, inkludert kvantitative data om gen- og transkripsjon hopetall. Her introduserer vi en rekke grundig testet, strømlinjeformet og standardiserte protokoller for kvantifisering av bakterielle 16S rRNA-genet og karakterutskrift i hopetall i kystnære sedimenter. Protokollen beskriver prøvetaking, samtidig DNA og RNA ekstraksjon, DNA-fri RNA forberedelse, kvalitet kontroll av utvunnet nukleinsyrer, generering av 16S rRNA-DNA og -RNA standarder og kvantifisering av miljøprøver. Kvantitative data fra metodene som beskrives her er nødvendig for å belyse mikrobielle samfunn kjørekystnære økosystemer.
Protocol
1. DNA og RNA Utvinning fra Marine Coastal sedimenter
- Utarbeidelse av ribonuklease (RNase) -fri materiale og arbeidsområde
- Fremstille RNAse-fritt destillert vann (dH 2 O) ved behandling med 0,1% dietylpyrokarbonat (DEPC) og inkuberes ved 37 ° CO / N. Fjerne gjenværende DEPC ved autoklavering dH 2 O ved 121 ° C i 15 min. Bruk DEPC behandlet dH 2 O for å gjøre alle løsninger.
- Stek alle glass på 180 ° CO / N. Fjern plastlokk og felger, suge dem i en løsning av 2 M NaOH O / N, og skyll dem med DEPC behandlet dH 2 O før bruk.
- Forbered en CTAB-fosfatbufferløsning som per tabell 1.
- Forbered PEG-NaCl nedbør løsning som per tabell 2.
- Rengjør alle arbeidsflater (dvs. benk, mikro, røyk-hette) og mikropipetter ved hjelp av RNase-dekontaminering løsning før start. Bruk hansker under hele prosedyren. Bruk RNase-fritt plasticware sammen med mikropipette filter tips for å unngå sample krysskontaminering.
- Miljø prøvetaking og lagring
- Samle kyst sediment ved lavvann med en steril 50 ml falk rør fra toppen 2,5 cm. Samle ca 15-20 g av sedimenter. lukke lokket forsiktig etter prøvetakingen. Transport umiddelbart til laboratoriet i en kjøler ved 4 ° C for umiddelbar behandling.
- Homogenisere prøven ved å blande med en steril spatel og aliquot 0,5 g våtvekt sediment inn i et 2 ml perle vibrerende rør. Delmengde flere paralleller, flash-fryse ved å plassere i flytende nitrogen. Oppbevar alikvoter ved -80 ° C. Forsiktig: Bruk vernehansker og vernebriller ved håndtering av flytende nitrogen.
Merk: Hvis feltet området ikke ligger i nærheten av et laboratorium, delmengde 0,5 g sediment i 2 ml sterile mikrosentrifugerør på feltet nettstedet. Flash-fryse rørene ved å sette dem rett inn i lipund nitrogen og transport til laboratoriet. Oppbevar prøver ved -80 ° C inntil behandling.
- Co-Utvinning av DNA og RNA fra sedimenter
Merk: Den følgende protokoll er en modifisert versjon av den metoden Griffiths 6.- Legg 500 mL CTAB-fosfatbuffer og 500 pl fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til 2 ml perle-lysende rør inneholdende 0,5 g av sediment og snu røret 5-10 ganger for å homogenisere prøven.
Forsiktig: Utfør dette trinnet i en bruk passende verneutstyr (dvs. laboratoriefrakk, hansker og vernebriller) til alle tider røyk-hette. - Vortex i full fart for 2,5 min. Sentrifuger ved 16000 x g i 10 min ved 4 ° C.
- I en røyk-hette trekke den øverste vannlaget og overføre til en ny 1,5 ml sterilt mikrosentrifugerør. Å holde prøvene på is, tilsett 500 mL iskald kloroform: isoamylalkohol (24: 1).
- Snu flere ganger til en emulsjon er visible. Sentrifuger i 10 minutter ved 16.000 xg ved 4 ° C.
- I en røyk-hette trekke den øverste vannlaget og legg den i en ny 1,5 ml sterilt rør. Utfelle nukleinsyrer ved å tilsette to volumer av 30% PEG- NaCl-løsning og bland godt.
- Inkuber på is i 2 timer eller få prøver ved 4 ° CO / N.
- Ved slutten av inkuberingsbetingelser sentrifugeres prøvene ved 16 000 xg i 20 min ved 4 ° C.
Merk: En pellet kan være synlig på bunnen av røret. - fjern supernatanten ved hjelp av en mikropipette forsiktig, sørg for ikke å forstyrre pelleten. La i området rundt 10 pl av PEG-oppløsning i røret og tilsett 1 ml iskald 70% etanol.
- -Sentrifuge i 20 minutter ved 16.000 xg ved 4 ° C. Sakte fjerne etanol med en mikropipette pass på å ikke berøre pellet.
- Sentrifuger i 5 sek og fjerne gjenværende etanol under anvendelse av en mikropipette. La pellet for å lufttørke i ca. 5 min.
- Re-suspendere pellet i 50 mL DEPC-behandletH 2 O. Undersøke kvaliteten og utbyttet av DNA / RNA ved agarosegelelektroforese som kjører 5 ul på en 1% agarosegel 19. Fordel nukleinsyrene i to porsjoner, 15 ul av DNA og 30 pl av RNA.
- Oppbevar DNA ved -80 ° C inntil behov. Isoler RNA som beskrevet i neste avsnitt.
- Legg 500 mL CTAB-fosfatbuffer og 500 pl fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til 2 ml perle-lysende rør inneholdende 0,5 g av sediment og snu røret 5-10 ganger for å homogenisere prøven.
2. Utarbeidelse av RNA og kvalitetskontroll av DNA-frie RNA
- Fordøyelse av DNA
- Tilsett 3 mL av DNAse I-buffer og 1,5 pl DNAse I til 30 pl volum av nukleinsyrer, inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Bland DNAse Inaktive reagens ved å virvle i 30 sek. Legg 4,8 ul av oppløsningen til prøven. Inkuber ved RT i 5 min, og til å trykke på den nederste av rørene for å blande oppløsningen.
- Sentrifuger ved 10 000 xg i 90 sek ved RT, overføre supernatant (RNA) i en ny tube, tar seg ikke å overføre bunnfall som kan hemme nedstrøms reaksjoner.
- RNA kvalitetssjekk
- Tilsett 2 mL av RNA til 18 mL sterilt RNase-fritt dH 2 O for å fortynne 01:10.
- I separate PCR-reaksjoner, tilsett 1 pl ublandet eller 1:10 fortynning av RNA til et sterilt 0,5 ml PCR-rør. Legg PCR-reaksjonskomponentene for å forsterke 16S rRNA-genet i henhold til tabell 3. Inkludere en "positiv" (f.eks., DNA ekstrahert fra en ren bakteriekultur), en "PCR-inhibitor" kontroll (dvs. 1 mL av positiv ren kultur DNA og 1 mL av pen ekstrahert RNA) og en "negativ" kontroll av sterile RNase-fritt dH 2 O.
- Still thermocycler med følgende forsterker parametrene: 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 sek, 57 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min) x 35 sykluser, 72 ° C 10 min.
- Kjør 10% av PCR-produktet på en 1% agarosegel ved 85 V i 40 minutter. Gjenta DNAse I behandling hvis et PCR-produkt dannes i miljø RNEn prøver.
- Tilsett 2 mL av RNA til 18 mL sterilt RNase-fritt dH 2 O for å fortynne 01:10.
3. Generering av First Strand cDNA fra RNA
- Tilsett reagenser som per tabell 4 til en RNase / DNAse gratis 0,2 ml PCR rør.
- Inkuber prøven ved 65 ° C 5 min. Plasser på is i minst ett min og deretter inkubert ved 25 ° C i 10 min.
- Til samme røret legge reagenser er oppført i tabell 5.
- Inkuber prøven ved 55 ° C i 50 min. Inaktivere reaksjonen ved 72 ° C i 10 min.
- Lagres cDNA ved -20 ° C inntil bruk.
4. Kvantitativ PCR
- Generering av DNA-standarder for qPCR
- Forsterke bakterielle 16S rRNA-sekvens 20 (eller en hvilken som helst annen sekvens av interesse) fra genomisk DNA ekstrahert fra ren kultur med q-PCR-primere (1369F og 1492R 21).
- Rense PCR produktet ved hjelp av et kommersielt kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Klone den rensede PCRprodukt inn i et 3'-overheng T kloningsvektor system i henhold til produsentens instruksjoner.
- Transform vektoren inneholder PCR sette inn i Escherichia coli JM109 kompetente celler i henhold til produsentens instruksjoner.
- Plate 50 ul av transformasjon ut mot ampicillin (100 ug / ml), X-gal (20 ug / ml) og IPTG (0,5 mM) Luria-Bertani-agar-plater (trypton 10 g / l, gjærekstrakt 5 g / l, NaCl 10 g / l Agar 15 g / l). Inkuber O / N ved 37 ° C.
- Velge en enkelt positiv hvit transformant fra platen. Inokulere positive transformanten i 50 ml LB-næringsløsning inneholdende 100 ug / ml ampicillin og inkuberes O / N rysting ved 250 rpm ved 37 ° C.
- Fra O / N kultur, isolere og rense plasmidet ved å bruke et kommersielt kit ifølge produsentens instruksjoner.
- Linearisere plasmidet ved hjelp av et passende restriksjonsenzym som er i stand til å kutte plasmidet en gang (for eksempel EcoRI).
- Bestemme konsentrasjonen av plasmid DNA ved absorbans ved 260 nm ved hjelp av et spektrofotometer 19.
Merk: Alternativt, kan nøyaktigheten av kvantifisering bli forbedret ved anvendelse av et fluorescerende DNA-bindende fargestoff som brukes i forbindelse med et fluorometer. - Sekvens plasmidet sette inn for å bekrefte størrelsen på målet i basene. Beregne mengden (dvs. prosent) av innsatte DNA i plasmidet (for eksempel i en 3000 bp vektor, er et 123 bp DNA-fragment på 3,9% av total DNA) og multiplisere det med konsentrasjonen oppnådd i 4.1.10, for å bestemme DNA-konsentrasjonen av målet (innsats).
- Bruk følgende formel for å beregne kopier av mål per il:
belastning / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - Beregn Target Molekylvekt (TMW) ved å multiplisere antall basepar av mål-DNA ved hjelp av den gjennomsnittlige molekylvekt av dobbeltkjedet DNA (dsDNA, 660 dalton pr basepar).
- Fortynn mål-DNA i et område fra 10 10 til 10 2 kopier ved hjelp av 2 pl av DNA og 18 pl sterilt dH 2 O. Bland hver fortynning godt og spinn ned kort før neste fortynning.
- Generering av RNA-standardkurven for qPCR
- Fra trinn 4.1.5, screene et antall hvite kolonier (ca. 5) ved koloni-PCR 19 ved hjelp av mål-revers primer (dvs. R1492) og den fremre vektorplasmidet primer M13F.
Merk: Denne kombinasjonen av primere vil forsterke innsatser klonet i den korrekte sense-orientering med en T7-promoter oppstrøms område. - Rense PCR produktet ved hjelp av et kommersielt kit etter produsentens anvisninger. Kvantifisere renset PCR pRODUKTINFORMASJON ved 260 nm ved anvendelse av et spektrofotometer.
- Tilsett 200 ng av PCR-produkt i et endelig volum på 20 ul med 7,5 mM av hver ribonukleotid, en T7-reaksjonsbuffer og en T7 polymerase enzym for in vitro transkripsjon reaksjon.
- Inkuber reaksjonsblandingen i 4 timer ved 37 ° C. Legg til en enhet av RNase-fri DNase I til reaksjons, inkuber i 15 min ved 37 ° C for å fjerne DNA-templat.
- Gjenopprette in vitro transkribert RNA ved etanolfelling 19 og kvantifisere RNA avkastning ved hjelp av en fluorimeter eller ved absorbans ved 260 nm.
- Beregn transkripsjon antall per ul RNA. Legg antall basepar i mål-RNA (f.eks, 123 baser) og lengden av T7-promoter (153 baser) og multipliseres med den midlere molekylvekt av RNA, 340 dalton per base.
- Legg 500 ng av tallfestet target RNA i en revers transkriptase (RT) reaksjon som beskrevet i avsnitt 3. serielt fortynnet cDNA som beskrevet i 4.1.13 for bruksom standardkurven.
- Fra trinn 4.1.5, screene et antall hvite kolonier (ca. 5) ved koloni-PCR 19 ved hjelp av mål-revers primer (dvs. R1492) og den fremre vektorplasmidet primer M13F.
- Real-Time PCR
- Tine miljø DNA / cDNA prøver, standarder og qPCR reagenser på is. Beskytt det fluorogene probe mot lys.
- Fortynne standarder for standardkurven som beskrevet i 4.1.14. Gjør 1:10 fortynninger av miljø DNA / cDNA fra ryddig til 10 -3 ved å legge 2 ul prøve til 18 mL sterilt dH 2 O.
- Foreta en masterblanding reaksjon for det totale antall reaksjoner pluss 10% i henhold til tabell 6 (primere og probe) og tabell 7 (reaksjonsblanding). Bland godt og kort sentrifugering.
- Legg 19 ul masterblanding og 1 ul templat (standard, omgivelsesprøve eller vannet for negativ kontroll) til hver brønn i en 96-brønners plate optisk qPCR. Utføre hver reaksjon (standarder, miljøprøver og negative kontroller) i tre eksemplarer.
- Dekk til 96-brønns plate med en q-PCR optisk deksel. Sentrifuger platen kort. Last innplate i varmeblokk av den qPCR maskinen og lukke lokket.
- Åpne qPCR manager programvare. Klikk på "protokollen fanen", klikk på "opprett ny", legge til følgende forsterkning vilkår: 3 min 95 ° C, (10 sek 95 ° C, 30 sek 60 ° C) x 40 sykluser. Sett prøvevolumet til 20 mL, klikk på "OK" og lagre protokollen.
- Klikk på "Plate" -kategorien. Under "Edit valgt" klikk "valg fluorophore", legger rapporten fargestoff for riktig sonde, f.eks fluorescein. Klikk på "OK".
- Marker brønner som inneholder standardene, velg "standard" fra "prøvetype" -menyen. Klikk "replikere serien" for å endre "replikere size" til 3, klikk "Apply". Klikk "fortynning serien" for å legge beregnede utgangskonsentrasjon for standard 1, indikerer fortynningsfaktoren (10), velg "redusere" eller "øke" avhengig av rekkefølgen standardkurven ble lagttil platen. Klikk på "Apply".
- Marker vel stillinger som inneholder ukjente prøver, velg "ukjent" fra "prøvetype" drop down menyen. Klikk "gjenskape serien", og endre "replikere size" til 3. Klikk "Apply". Rediger prøve navn under "sample navn". Gjenta prosedyren for templat-kontroller (NTC) brønner.
- Klikk på "OK" på plate redaktør boksen og lagre filen. Klikk "Start run".
- Ved fullføring av kjøringen, vil dataanalyse vinduet åpent. Klikk på "kvantifisering fanen" for å vise standardkurven, standardkurve beskrivelsene (tabell 8) og forsterkning plott.
- Klikk på "kvantifisering data" tab for Cp verdier og tilsvarende utgangs mengde genet (SQ) av ukjente prøver. Eksporter tabell til regneark programvare hvis nødvendig.
- Multipliser genet abundances fra ukjente prøver med fortynningsfaktoren, mengde sediment extracted fra og det totale volumet nukleinsyrer ble eluert i å skaffe genkopier pr gram våtvekt sediment.
Merk: Eluer DNA fra 0,5 g sediment i 50 ul, fortynne 1/10, tilsett 1 mL som mal til en q-PCR reaksjon; beregne genkopier g -1 sediment ved å multiplisere: genkopier ul DNA x fortynningsfaktoren x elueringsvolum x 2.
Representative Results
Utvinning av god kvalitet DNA og RNA fra sedimenter er første skritt i å kvantifisere genet og karakterutskrift hopetall. En vellykket Ekstraksjonsutbyttene store DNA- og RNA-bånd som er angitt i figur 1 for prøve AC, hvor skarpe 23S og 16S rRNA bånd er synlige i tillegg til den høye molekylvekt genomisk DNA båndet.
Figur 1. DNA / RNA-ekstraksjon. Typiske resultater fra DNA / RNA ekstraksjon fra tre eksemplarer (ABC) 0,5 g kyst sedimenter. 5 ul av DNA / RNA ble kjørt på en 1,4% agarose ved 85 V i 40 minutter. En molekylær markør i 10,037-200 bp serien ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En qPCR reaksjon protokollen er skissert rettet mot 16S rRNA DNA. For 16S rRNA transkripsjoner erstatte standard cuRVE og mal med cDNA. Som ukjente prøver blir kvantifisert mot standardkurven, er det viktig å sikre at standardkurven er av god kvalitet. Figur 2 viser fremstillingen av (A), standardkurver og miljø DNA-fortynninger, (B), forsterkning av standardkurven og miljøprøver (C) omdannelse av standardkurven til en lineær regresjon og beregning av genet kopiantall. Når en 10 gangers fortynning serien er riktig forberedt og forsterket en 3,3 syklus forskjell mellom hver standard fortynning er sett (det tar 3,3 sykluser for en tidobling i malen på 100% forsterkning effektivitet) (figur 2Bi). Standardkurver deskriptorer, herunder R 2 verdier på 0,99 og PCR effektivitet innen området på 90 til 110% (figur 2C) er ønsket. Det er viktig å rapportere Cp-verdier fra ikke-templat-kontroll (NTC) hvis tilstede. Hvis dette skjer en Cp cutoff for standarder og ukjente prøver 3.3 sykluser (<em> dvs. en log ganger) høyere enn den Cp verdien av NTC pålegges 20 (figur 2Cii). Ukjent mal hentet fra sediment DNA ble kvantifisert fra ryddig, 10 -1, 10 -2 og 10 -3 fortynninger (B). Den nette prøven ikke forsterke, Cp verdier på 10 -1 til 10 -3 fortynninger var 24.12, 26.02 og 28.40 henholdsvis. NTC Cp var 30,5, en NCT cutoff på 27,2 ble pålagt. Konvertering genet abundances å g -1 våtvekt sediment resulterte i 2,5 x 10 7 og 7,1 x 10 7 for 10 -1 og 10 -2 henholdsvis for fortynning serien. 10 -3 fortynning Cp var under den NTC cutoff, og ble derfor ikke anvendt. I dette tilfellet er 10 -2 ble valgt som den optimale templat fortynning.
Figur 2. 16S rRNA-genet QpcR forsterkning av standarder og miljø DNA ekstrahert fra kystsedimenter. Fremstilling av (A) i) DNA-standardkurve, og ii) miljømessige DNA-fortynninger for qPCR amplifikasjon, (B) qPCR forsterkning av i) DNA standard kurve og ii) miljøprøver, er Cp for hver prøve er vist. (C) i) Lineær regresjon av standard kurve med standardkurven deskriptorer, ii) beregning av genet abundances fra miljøprøver. NTC. Negativ Mal Kontroll Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| reagens | Beløp |
| CTAB | 5 g |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2,58 g |
| KH 2 PO 4 | 0,1 g |
| NaCl | 2,05 g |
| dH 2 O | opp til 100 ml |
Tabell 1. Fremstilling av CTAB-fosfatbuffer.
| reagens | Beløp |
| PEG 6000 | 30 g |
| NaCl | 9,35 g |
| dH 2 O | opp til 100 ml |
| Merk: legg PEG 6000 sakte under moderat oppvarming og omrøring av 50 ml dH 2 O. | |
Tabell 2. Utarbeidelse av PEG-NaCl nedbør løsning.
| reagens | Beløp |
| Ufortynnet RNA / 01:10 utvannet RNA | 1,0 mL |
| 10x PCR Buffer | 5,0 mL |
| dNTP 10 mm | 1,0 mL |
| 63F fremover primer | 1,0 mL |
| CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC | |
| 518R revers primer | 1,0 mL |
| ATT ACC GCG GCT GCT GG | |
| Taq polymerase | 0,4 mL |
| RNase-fritt dH 2 O | 40,6 mL |
Tabell 3. DNA-fri RNA kvalitetssjekk PCR mester mix.
| reagens | Beløp |
| RNA | 0,5-5 mikrogram |
| dNTP 10 mm | 1 mL |
| Omvendt primer 10 mm / Random heksamer 50 M | 1 mL |
| DEPC-H 2 O | Opp til 13 mL |
Tabell 4. cDNA syntese reaksjonsblanding A.
| reagens | Beløp |
| buffer 5x | 4 pl |
| DTT | 1 mL |
| RNase Inhibitor | 1 mL |
| revers transkriptase | 1 mL |
Tabell 5. cDNA syntese reaksjonsblanding B.
| Mål | primer navn | Sekvens | Gløding T (° C) | Henvisning |
| 16S rRNA-bakterier | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TCY CGG | 56 | Suzuki et al. 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (probe) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| reagens | Beløp |
| 2x Master Mix | 10 ul |
| Forward primer (10 mm) | 0,8 mL |
| Revers primer (10 mm) | 0,8 mL |
| Probe (10 mm) | 0,4 mL |
| Vann | 7,0 mL |
| sluttvolum | 19 mL |
Tabell 7. sanntid PCR reaksjon mix.
| descriptor | Betydning |
| Korrelasjonskoeffisient (R2) | Et mål på linearitet av standardkurven. Ideelt sett bør det være R 2 = 1. Verdien av R 2 = 0,98 til 0,99 er akseptabelt. |
| Slope (α) | Et mål på reaksjonseffektivitet. Ideelt sett bør det være tilsvarende -3,32. Verdi i området mellom -3,58 og -3,1. |
| Effektivitet (= 10 (-1 / skråning) -1) | Hvis det er 100%, de maler dobles etter hvert termisk syklus under eksponentiell forsterkning. En god effektivitet utvalg er mellom 90 og 110%. |
| Y Intercept (β) | Den teoretiske grensen for deteksjon av reaksjonen. Selv om det ikke brukes til å kvantifisere reaksjons følsomhet, er det viktig når man sammenligner forskjellige standardkurver for det samme mål. |
Tabell 8. QpcR reaksjons beskrivelsene.
Discussion
Kombinasjonen av DNA / RNA ekstraksjon med qPCR gir en rask, nøyaktig, relativt kostnadseffektiv metode for sensitiv kvantifisering av genet og karakterutskrift Forekomsten av en rekke miljøprøver, for eksempel kystsedimenter.
Den opprinnelige nukleinsyre ekstraksjon er det kritiske trinn for å sikre et representativt riss av den mikrobielle fellesskap liggende oppnås 22. En rekke begrensninger må tas i betraktning for utvinning protokoll: a) oppnåelse av total cellelysering, b) ko-ekstraksjon av inhiberende forbindelser (f.eks humussyrer eller polyphenolics), c) kontaminerende DNA på RNA-fraksjon, d) rask nedbrytning av utvunnet nukleinsyrer ved lagring. Forholdsregler må tas for å omgå disse begrensningene. For eksempel må tas særlig hensyn til at utvinning av nukleinsyrer er optimalisert for prøvetype (for eksempel sedimenter, jord, avløp, etc.). Betydelige forbedringer i nukleinsyre utbytte og kvalitet for både DNA og RNA kan bli oppnådd ved å utføre preliminære eksperimenter 23. For å minimere effekten av hemmende forbindelser i PCR-baserte applikasjoner 24, teste en rekke fortynninger fra det ekstraherte DNA og RNA. For å omgå den raske nedbrytning av det ekstraherte DNA / RNA fra flere fryse-tine-sykluser og unngå mulig tap av genetisk informasjon, kan lagre flere små volum alikvoter ved -80 ° C.
Når nøye utformet, qPCR er en robust, meget reproduserbar og følsom metode. Spesielt kan de metoder for forsterkning og standardkurve konstruksjon som er skissert i denne protokollen tilpasses ethvert gen mål av interesse, inkludert andre fylogenetiske markører (dvs. archaeal 16S rRNA, sopp 18S rRNA) eller gener som er involvert i viktige funksjoner i miljøet. Kjente begrensninger i bruken av qPCR er: a) generering av reproduserbar høy kvalitet standard kurve for absolutt mengdebestemmelse, b) valg av primer / prober og optimalisering av q-PCR-analysebetingelser, c) bruk av lav kvalitet / skåret nukleinsyrer, d) valg av arbeids fortynning av DNA / RNA for å unngå inhibering . Videre må det tas i betraktning at qPCR teknikk gir genet / karakterhopetall som ikke kan likestille til celle teller: Dette er særlig tilfelle når 16S og 18S rRNA gener er målrettet, som mikroorganismer har ulike kopiantall av ribosom gen i sitt genom 25.
Dårlig kvalitet standardkurver vil resultere i unøyaktig kvantifisering av genet av interesse. Det er god praksis å lagre en aksje med høy konsentrasjon standarder i små porsjoner som ferske standardkurver kan gjøres. Ikke lagre standardkurver, alltid ferske fortynninger fra et lager av den høyeste konsentrasjonen hver gang. For nøyaktig kvantifisering av miljøprøver sikre en rekke konsentrasjoner av de standard kurve spenner de forventede Cp verdiene av de ukjente prøvene. Når kvantifisere transkripsjoner, konstruere standardkurve fra RNA ikke doble DNA. Når det er mulig, bør kvantifisering av prøver å bli direkte sammenlignet være fullført innen en enkelt analyse for å unngå inter-assay variasjon 20. Dette kan ikke alltid være mulig. Derfor, for å sammenligne genet abundances generert mellom analysene er det lurt å ha en tilfeldig sub-sett av prøvene replikeres mellom analyser. Et bredt utvalg av primer og sonde sett er for tiden tilgjengelig for qPCR målretting mikrobiell taxa og funksjonelle grupper 15. Nøye vurdering er nødvendig når du velger disse for å sikre både maksimal dekning og spesifisitet for målgruppen. Dersom reaksjonen effektiviteten av en qPCR-analyse er ikke tilfredsstillende, begynner feilsøking med å teste forskjellige termiske sykluser værforhold (annealing tid og / eller temperatur) og / eller reaksjonsbetingelser, for eksempel varierende primer-probe konsentrasjoner. ONCE Q-PCR-analyse og reaksjonsbetingelser er optimalisert, alltid gjennomføre en innledende test av en rekke DNA / cDNA fortynninger for å bestemme passende mal konsentrasjon. Velge den fortynning område som resulterer i den høyeste kopitallet som den optimale fortynning templat for ytterligere analyser.
Foreløpig neste generasjons sekvensering teknologi effektivt belyse mikrobiell samfunnsstruktur og funksjoner i en mengde miljøer 26,27,28. Imidlertid er disse datasettene ofte basert på endepunkts PCR fragment biblioteker og derfor gir bare halv kvantitative vurderinger av overflod av spesielle taxa. Derfor, for å evnen til Real Time PCR-basert teknikk målrette bestemte taksonomiske markører (fra høyere domene ned til stammenivå) gir effektiv validering av resultatene oppnådd av neste generasjons sekvensering. Videre qPCR har blitt brukt i kombinasjon med andre mikrobiell økologi molekylære metoder slik som stabil isotope sondering (SIP) eller fylogenetiske / funksjonelle mikromatriser. Kombinert med den tidligere verktøyet, kan qPCR brukes til å kvantifisere metabolsk aktive fellesskap 29,30. Når det kombineres med microarray analyse, gir qPCR nøkkelen kvantitativ tolkning av fylogenetiske markør-basert og funksjonelle genet kartlegging av miljøene 31,32.
Derfor brukes alene eller i kombinasjon med andre (ofte prosessbasert) vurdering av økosystem funksjon, er kvantitativ PCR et viktig verktøy for mikrobielle økologer i utforskningen av den unnvikende koblingen mellom mikrobielle samfunn og økosystemfunksjoner.
Acknowledgments
Denne publikasjonen har strømmet ut fra forskning utført med økonomisk støtte fra Natural Environment Research Council (NERC) under tilskuddet antallet NERC NE / JO11959 / 1 og Science Foundation Irland og Marie-Curie Handling COFUND henhold Grant Number 11 / SIRG / B2159awarded til CJS og den østlige akademisk forskning Consortium (Eastern ARC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
- Epstein, S. S.
- Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
- Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
- Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
- Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
- Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
- Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
- Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
- Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
- Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
- Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
- Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
- Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205 (2001).
- Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
- Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
- Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
- Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
- Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
- Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
- Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
- Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
- Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
- Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
- He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).
