Summary

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Published: June 22, 2016
doi:

Summary

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Abstract

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti in circolazione del sangue umano e sono rapidamente reclutati ai siti infiammatori. L'adescamento è un evento critico che aumenta la funzionalità fagocitaria dei neutrofili. Sebbene studi approfonditi hanno svelato l'esistenza e l'importanza di neutrofili adescamento durante l'infezione e lesioni, i mezzi di visualizzare questo processo in vivo sono stati disponibili. Il protocollo fornito consente il monitoraggio del processo dinamico di neutrofili adescamento in animali viventi combinando tre metodologie: 1) Segnale giornalista DsRed – usato come misura di adescamento 2) in vivo etichettatura neutrofili – ottenuto mediante iniezione di fluorescenza coniugato antigene anti-linfociti 6G (Ly6G) anticorpo monoclonale (mAb) e 3) confocale intravitale. Diversi passaggi critici sono coinvolti in questo protocollo: Mouse infiammazione oxazolone indotta pelle orecchio, adeguata sedazione degli animali, ripetute iniezioni di anti-Ly6G mAb, e prevenzione fuoco deriva durante l'imaging. Sebbene alcune limitazioni sono stati osservati, come il limite di tempo di imaging continuo (~ 8 ore) in un mouse e la fuoriuscita di fluorescina isotiocianato-destrano dai vasi sanguigni in stato infiammatorio, questo protocollo fornisce un quadro fondamentale per l'imaging intravitale di comportamento innescato neutrofili e la funzione, che può essere facilmente ampliato per l'esame di altre cellule del sistema immunitario in modelli murini di infiammazione.

Introduction

I neutrofili sono i più abbondanti e di breve durata leucociti in circolazione. Essi stanno rapidamente reclutati per i siti di infezione o lesioni, dove servono fagociti come professionisti attraverso il rilascio di reattivi intermedi ossigeno e di azoto insieme con granuli contenenti peptidi antimicrobici e proteasi 1. Durante il loro reclutamento, i neutrofili sono "innescato" da vari agenti compresi i prodotti microbici, chemoattractants, e citochine infiammatorie, con conseguente funzionalità dei fagociti nettamente migliorata all'arrivo in un sito di infiammazione 2. I meccanismi di priming neutrofili sono state ampiamente studiate in vitro 3,4; Tuttavia, il monitoraggio dinamico del processo in vivo non è stato possibile finora.

Recentemente, l'imaging intravitale è diventata una tecnica importante per la visualizzazione e quantificare le dinamiche cellulari di processi biologici degli organismi viventi. IntraviImaging tal può essere effettuato tramite convenzionale eccitazione microscopia one-photon (ad esempio, confocale) o multiphoton microscopia avvicina 5. Nel corso del tempo, sostanziali miglioramenti sono stati raggiunti in questa tecnica che consente una maggiore risoluzione delle immagini, una maggiore profondità delle immagini, riduzione fotodanneggiamento del tessuto, e una maggiore 6,7 stabilizzazione delle immagini. Data la sua capacità unica di consentire la visualizzazione dinamica di migrazione cellulare e l'interazione con il tempo, la microscopia intravitale è stato ampiamente applicato a diverse aree di studio in immunologia 8. l'imaging intravitale consente immunologi di comprendere e contestualizzare le risposte immunitarie, sia a livello cellulare e molecolare in modelli animali vivere meglio.

I recenti progressi nella transgenici e knock-in topi reporter hanno fornito strumenti utili per il monitoraggio dei comportamenti dinamici di neutrofili negli animali viventi. Il lisozima M promotore-driven maggiore proteina fluorescente verde knock-ini topi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la motilità dei neutrofili, monociti e macrofagi durante i vari processi infiammatori tra cui stravaso, infezione batterica, e l'infiammazione sterile 9-15. Inoltre, i topi transgenici che esprimono una fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia biosensore citoplasmatica sono stati impiegati nello studio delle attività di neutrofili mitogeno chinasi extracellulare-regolamentato e la proteina chinasi A all'interno dell'intestino infiammato 16. Un modello murino con alta specificità per l'espressione di fluorescenza nei neutrofili è il mouse Catchup knock-in, che produce Cre ricombinasi, nonche la tdTomato proteina fluorescente, che si è accoppiata espressione di linfociti antigene 6G (Ly6G) 17. Visualizzazione dei neutrofili Ly6G-deficienti attraverso questo modello ha dimostrato che queste cellule esercitano funzionalità normale in una varietà di contesti infiammatori vivo sterili o infettive. topi transgenici che esprimono la DsRed fluorescente protein gene sotto il controllo del mouse interleuikin-1β (IL-1β) promotore (pIL1-DsRed) sono stati utilizzati per visualizzare i comportamenti motilità delle cellule che producono IL-1b – ritenuto includere neutrofili, monociti infiammatori e macrofagi attivati ​​- emergente in pelle infiammata 18.

In vivo etichettatura può servire come un approccio alternativo per tracciare i comportamenti cellulari e molecolari di neutrofili nei tessuti infiammati. Dopo l'iniezione endovenosa di basse dosi di fluorescente anti- Gr-1-anticorpo monoclonale (mAb), la cascata reclutamento di Gr-1 + neutrofili è stata visualizzata in lesioni cutanee topo con infezioni da Staphylococcus aureus 19. Somministrazione in vivo di coniugati contenenti streptavidina coniugati 705 nm punti quantici e biotinilato anti-Ly6G mAb etichetta specificamente neutrofili circolanti 20. Inoltre, endocitosi di tali coniugati in neutrophIL vescicole permette il monitoraggio del trasporto delle vescicole ad alta velocità nei neutrofili migrano nell'interstizio. In vivo etichettatura con anticorpi fluorescenza coniugato contro P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e chemochine (CXC motivo) recettore 2 (CXCR2) in un modello infiammatoria TNF-indotta ha chiarito i meccanismi di regolazione in gioco durante l'infiammazione precoce 21. neutrofili polarizzati sporgono uropodi PSGL-1-arricchito di interagire con CD62L presenti sulle piastrine attivate, con la conseguente ridistribuzione di CD11b e CXCR2, recettori che guidano la migrazione dei neutrofili e avviano l'infiammazione.

IL-1β è uno dei geni di firma che è elevata in neutrofili innescato 22. In topi reporter pIL1-DsRed, segnali di fluorescenza DsRed (es., L'attivazione del promotore di IL-1β) correlano positivamente con IL-1β mRNA espressione e la produzione di proteine ​​di IL-1β. <sup> 18 per monitorare il processo di neutrofili adescamento, un metodo di microscopia intravitale è stato sviluppato coinvolgendo l'induzione di infiammazione della pelle con oxazolone (OX) nel modello murino pIL1-DsRed seguente etichettatura in vivo dei neutrofili con fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb. Attraverso questo modello, è possibile studiare il comportamento e la funzione dei neutrofili innescato in modelli animali di varie malattie e disturbi.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali dell'Università di Toledo. 1. Fenotipizzazione di pIL1-DsRed Mice NOTA: Offspring sono generati da allevamento topi pIL1-DsRed eterozigoti con topi wild-type (WT) C57BL6. Da tre a quattro settimane di età cuccioli sono considerati pronti per fenotipizzazione. Sanguinamento s…

Representative Results

Proiezione di topi pIL1-DsRed è effettuata sulla base del segnale di fluorescenza fenotipica DsRed prodotto dai loro leucociti del sangue periferico mediante citometria a flusso. Stimolazione LPS è nota per indurre la produzione di IL-1β in cellule mieloidi, tra cui i neutrofili, monociti e cellule dendritiche 26-28. Così, leucociti isolati vengono incubate con LPS per 4 ore prima di citometria a flusso di analisi. Avanti, gating è fissato per viene misurata in questa pop…

Discussion

Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una tecnologia per il monitoraggio del processo di neutrofili adescamento in animali viventi, che non è stata ancora soddisfatte dalle tecniche attualmente disponibili. Per raggiungere questo obiettivo, tre metodologie consolidate vengono eseguiti: 1) induzione di infiammazione della pelle in topi reporter DsRed promotore-driven IL-1b come misura di priming, 2) in vivo etichettatura dei neutrofili con basse dosi di fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb, e 3) con…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

Heparin sodium APP Pharmaceuticals NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer Lonza 10-548E
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0926
Lipopolysaccharides Sigma-Aldrich L4391
Ketamine hydrochloride Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine LLOYD Laboratory NADA #139-236
Acepromazine Boehringer Ingelheim ANADA 200-361
Hair-removal cream Church & Dwight
Acetone Fisher Scientific A16P4
Oxazolone Sigma-Aldrich E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody BioLegend 127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle BD 329461
FITC-CM-Dextran, 150 Kda Sigma-Aldrich 74817
Butterfly infusion set (27 G needle) BD 387312
FACSCalibur cytometer BD
CellQuest Pro software BD
Confocal microscope Olympus FV1000
Metamorph Software Universal Imaging

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Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A. Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice. J. Vis. Exp. (112), e54070, doi:10.3791/54070 (2016).

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