Abstract
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la circulación de la sangre humana y son reclutados rápidamente a los sitios inflamatorios. El cebado es un evento crítico que mejora la funcionalidad fagocítica de los neutrófilos. A pesar de extensos estudios han revelado la existencia y la importancia de cebado de neutrófilos durante la infección y las lesiones, los medios de visualización de este proceso in vivo no han estado disponibles. El protocolo proporcionado permite la monitorización del proceso dinámico de neutrófilos cebado en animales vivos mediante la combinación de tres metodologías: 1) la señal del informador DsRed - se utiliza como una medida de cebado 2) etiquetado de neutrófilos in vivo - logrado por la inyección de antígeno anti-linfocitos fluorescencia conjugado 6G (Ly6G) anticuerpo monoclonal (mAb) y 3) la imagen confocal intravital. Varios pasos críticos están involucrados en este protocolo: la inflamación inducida por oxazolona piel de oreja de ratón, la sedación adecuada de los animales, las inyecciones repetidas de anticuerpos anti-Ly6G mAb, y prevención de la deriva de enfoque durante la exploración. Aunque se han observado algunas limitaciones, tales como el límite de tiempo de imagen continua (~ 8 horas) en un ratón y la fuga de isotiocianato-dextrano de los vasos sanguíneos en el estado inflamatorio de fluoresceína, este protocolo ofrece un marco fundamental para intravital de imágenes de comportamiento imprimada de neutrófilos y la función, que puede ser fácilmente ampliado para examen de otras células inmunes en modelos de inflamación de ratón.
Introduction
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes y de corta duración en la circulación. Ellos son reclutados rápidamente a los sitios de infección o lesión, donde sirven como fagocitos profesionales a través de la liberación de oxígeno y nitrógeno intermedios reactivos, junto con gránulos que contienen péptidos antimicrobianos y proteasas 1. Durante su reclutamiento, los neutrófilos están "preparados" por varios agentes, incluidos los productos microbianos, factores quimiotácticos y citoquinas inflamatorias, lo que resulta en la funcionalidad de los fagocitos marcadamente mejorada al llegar a un sitio de la inflamación 2. Los mecanismos de cebado de neutrófilos han sido ampliamente estudiados in vitro 3,4; Sin embargo, el seguimiento dinámico del proceso in vivo no ha sido posible hasta la fecha.
Recientemente, intravital de imágenes se ha convertido en una técnica importante para la visualización y la cuantificación de la dinámica celular de los procesos biológicos en los organismos vivos. Intravide formación de imágenes tal se puede realizar a través de microscopía de excitación de un solo fotón convencionales (por ejemplo, confocal) o microscopía multifotónica se aproxima a 5. Con el tiempo, las mejoras sustanciales se han logrado en esta técnica que permite aumentar la resolución de la imagen, la mejora de la profundidad de formación de imágenes, disminución de fotodaño del tejido, y el aumento de 6,7 estabilización de imagen. Dada su capacidad única para permitir la visualización dinámica de la migración celular y la interacción con el tiempo, la microscopía intravital se ha aplicado ampliamente a diversos campos de estudio de la inmunología 8. intravital de imágenes permite a los inmunólogos para comprender mejor y contextualizar la respuesta inmune, tanto a nivel celular y molecular en modelos animales que viven.
Los recientes avances en transgénicos, así como en ratones knock-informadores han proporcionado herramientas útiles para el seguimiento de los comportamientos dinámicos de neutrófilos en los animales vivos. La lisozima M promotor impulsado por una mayor proteína verde fluorescente knock-inlos ratones se han utilizado ampliamente para caracterizar la motilidad de los neutrófilos, monocitos y macrófagos durante diversos procesos inflamatorios, incluyendo la extravasación, infección bacteriana, y la inflamación estéril 9-15. Además, los ratones transgénicos que expresan un biosensor de resonancia de fluorescencia la transferencia de energía citoplásmica se han empleado en el estudio de las actividades de los neutrófilos mitógeno quinasa extracelular regulada y la proteína quinasa A dentro de intestino inflamado 16. Un modelo murino con una alta especificidad para la expresión de la fluorescencia de los neutrófilos es el ratón knock-in Catchup, que produce la recombinasa Cre, así como la tdTomato proteína fluorescente, que a su vez está acoplado a la expresión de antígeno de linfocitos 6G (Ly6G) 17. La visualización de los neutrófilos Ly6G deficientes a través de este modelo ha demostrado que estas células ejercen funcionalidad normal en una variedad de contextos inflamatorios in vivo estériles o infecciosas en. Los ratones transgénicos que expresan la DsRed fluorescente protein gen bajo el control del ratón interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) han sido utilizados para visualizar los comportamientos móviles de células productoras de IL-1ß - cree incluyen neutrófilos, monocitos inflamatorios, y macrófagos activados - emergente en la piel inflamada 18.
In vivo etiquetado puede servir como un enfoque alternativo para el seguimiento de los comportamientos celulares y moleculares de los neutrófilos en los tejidos inflamados. Después de la inyección intravenosa de bajas dosis de etiqueta fluorescente-1 anti-Gr anticuerpo monoclonal (mAb), la cascada de reclutamiento de Gr-1 + neutrófilos ha sido visualizado en las lesiones de piel de ratón infectadas con Staphylococcus aureus 19. La administración in vivo de conjugados que contienen estreptavidina conjugados 705 puntos cuánticos nm y biotina anti-Ly6G mAb etiquetan específicamente neutrófilos circulantes 20. Por otra parte, la endocitosis de tales conjugados en neutrophil vesículas permite el seguimiento de la vesícula de transporte de alta velocidad en los neutrófilos que migran hacia el intersticio. In vivo etiquetado con anticuerpos de fluorescencia conjugada contra P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), la integrina αM (CD11b ) y quimiocinas (CXC motivo) del receptor 2 (CXCR2) en un modelo inflamatoria TNF inducida ha dilucidado los mecanismos de regulación en juego durante la inflamación temprana 21. neutrófilos polarizadas sobresalen urópodos PSGL-1-enriquecido para interactuar con CD62L presente en las plaquetas activadas, lo que resulta en la redistribución de CD11b y CXCR2, los receptores que dirigen la migración de neutrófilos e inician la inflamación.
IL-1β es uno de los genes de la firma que se encuentra elevado en los neutrófilos imprimados 22. En los ratones reportero pIL1-DsRed, las señales de fluorescencia DsRed (es decir., La activación del promotor de la IL-1β) se correlacionan positivamente con la IL-1β la expresión del ARNm y la producción de la proteína IL-1β. <sup> 18 para supervisar el proceso de cebado de neutrófilos, se ha desarrollado un método de microscopía intravital que implica la inducción de la inflamación de la piel con oxazolona (OX) en el modelo de ratón pIL1-DsRed siguiente etiquetado in vivo de los neutrófilos con anti-Ly6G mAb conjugados con fluoresceína. A través de este modelo, es posible estudiar el comportamiento y la función de los neutrófilos imprimadas en modelos animales de diversas enfermedades y trastornos.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Toledo.
1. Fenotipificación de pIL1-DsRed ratones
NOTA: Offspring son generadas por la cría de los ratones heterocigotos pIL1-DsRed con los ratones de tipo salvaje (WT) C57BL6. Tres a cuatro semanas de edad cachorros se consideran listo para el fenotipado. Sangrado submandibular de ratones sigue un protocolo establecido, con modificaciones menores 23.
- El aislamiento de los glóbulos blancos de la sangre entera de los perritos mouse
- Añadir 20 l de heparina a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Adquirir un cachorro de la jaula. Grabe la etiqueta de identificación del cachorro. No es necesario para anestesiar a las crías antes de la recogida de sangre de la vena submandibular.
- Mantenga las crías por pescuezo cuello y perforar la vena submandibular en THbolsa de la mejilla de correo utilizando una lanceta de 5 mm. Aplicar una fuerza adecuada para crear una pequeña punción, de modo que exudan gotas de sangre desde el punto de penetración. Use una aguja nueva para cada cachorro.
- Recoge 3 - 5 gotas de sangre por cada cachorro en un tubo de microcentrífuga que contiene heparina. Limpiar el sitio de la punción y aplicar presión para facilitar la hemostasia.
- Ponga las crías en una nueva jaula y observar durante 30 minutos antes de volver a la jaula para la instalación de animales.
- Recoger la sangre de ratones adultos de un fenotipo conocido como controles positivos y negativos.
- Añadir 500 l de tampón de lisis de glóbulos rojos a cada tubo, los tubos de vórtice, y se incuba durante 5 a 10 min en hielo.
- Añadir lentamente 400 - 500 l de suero fetal bovino (FBS) por debajo de las suspensiones de células en cada tubo. Una interfaz clara puede ser observado entre la suspensión de células de la capa superior y la capa inferior de FBS.
- tubos de cabeza y las muestras de centrifugación a 1500 × g durante 5 min.
- Repita los pasos 1.1.7 - 1.1.9 a la pielTher eliminar las células rojas de la sangre. No repetir si lisis es suficiente la primera vez. El sedimento debe ser difícil de discernir después de la centrifugación.
- El lipopolisacárido (LPS) Estimulación y Cultura
- Resuspender las células en 200 l de completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- Transferir la suspensión celular a un tubo de citometría de flujo.
- Hacer LPS solución de trabajo mediante la mezcla de 10 l de LPS solución madre (1 mg / ml) con 990 l de medio completo RPMI 1640.
- Añadir 20 l de LPS 10 g / ml de solución de trabajo de 200 l de suspensión celular.
- Tubos con tapa sin apretar y se incuban las muestras durante 4 horas a 37 ° C con 5% de CO2.
- Análisis de citometría de flujo
- Abra el programa de adquisición de datos de citometría de flujo. Configurar plantilla de adquisición antes de la adquisición de muestras.
- Haga clic en la herramienta de punto de parcelas en la paleta de herramientas. Dibuje una forward de dispersión (FSC) frente a la dispersión lateral de parcela (SSC). Establecer los parámetros de tensión FSC y SSC a escala lineal.
- Seleccionar los umbrales más bajos de FSC y SSC permitidos por el citómetro. Aplicar umbrales 200 y 50 para el FSC y SSC, respectivamente.
- Dentro del FSC frente a SSC parcela, dibujar una puerta G1 que incluye monocitos, granulocitos y células dendríticas, y excluye los desechos, las células rojas de la sangre y los linfocitos.
- Haga clic en la herramienta de histograma en la paleta de herramientas. Dibujar un histograma FL2 (canal de fluorescencia roja). Use una muestra de control negativo para establecer la línea de base de las señales de FL2 y una muestra de control positivo para dibujar una puerta para incluir todos los eventos de DsRed positivos.
- En el panel de control de fluidos del citómetro, establecer el modo fluido a "RUN" y el caudal de "HI" (aproximadamente 60 l / min). Adquirir 10.000 eventos en cada muestra.
- Determinar fenotipo pup midiendo el porcentaje de células positivas DsRed de la puerta G1.
- Anestesie ratón por inyección intraperitoneal (ip) de un cóctel anestésico que contiene 100 mg / kg de ketamina, 10 mg / kg de xilazina, y 1 mg / kg de acepromazina. los ratones anestesiados adecuadamente no muestran retirada de la pata trasera que va pizca dedo del pie.
- Aplicar la crema de depilación a la superficie dorsal de las dos orejas del ratón. Espere 30 segundos a 1 minuto. Limpiar la superficie del oído con un algodón humedecido con agua y deje que se seque al aire.
- Mida el grosor de la oreja usando micrómetro y vuelva a colocar el ratón en una jaula separada. Observe hasta que la recuperación de la anestesia (~ 15 - 30 min). Para resolver la inflamación de la piel inducido por el producto de depilación, permiten ratón para descansar durante 3 días antes de la experimentación adicional se lleva a cabo.
- Preparar 1,25% (w / v) OX disolviendo 16,7 mg de OX en 1 ml de acetona y la mezcla de 750 l de solución / acetona OX con 250 l de aceite de oliva. Preparar la solución de vehículo por mezcla de 750 l de acetona con 250 y# 181; l de aceite de oliva.
- Vuelva a anestesiar ratón mediante inyección ip de cóctel anestésico (2.1). Mida el grosor de la oreja como antes.
- Aplicar 12,5 l de 1,25% OX en cada lado de la oreja derecha. Aplicar 12,5 l de solución de vehículo de acetona / aceite de oliva en cada lado de la oreja izquierda.
- Mantener separado de ratón compañeros de jaula hasta que esté totalmente recuperado para evitar el insulto a sus oídos por otros ratones, vuelva a colocar el ratón en su jaula original y volver a la instalación de alojamiento de los animales.
NOTA: La eliminación del vello puede resultar en inflamación de la piel de menor importancia tras el cambio del grosor de la oreja. Esta inflamación menor será resuelta 3 días más tarde confirmado por grosor de la oreja normal. Después de la aplicación tópica durante 24 horas, oídos OX-tratada muestran significativa (p <0,01) en comparación con la hinchazón de solución vehículo orejas tratadas solos.
3. El etiquetado de los neutrófilos en ratones pIL1-DsRed
NOTA: En vivo etiquetado de los neutrófilos por dosis bajas de fluorescence-anticuerpo monoclonal conjugado-neutrófilos específica sigue un protocolo desarrollado recientemente 19. Inyecciones retro-orbitales se realizaron de acuerdo a un protocolo establecido con algunas modificaciones 24.
- Preparar la solución de trabajo anti-Ly6G mAb mediante la dilución de 10 l de 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647 conjugado con anti-Ly6G mAb (clon 1A8) en 90 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Transferir 100 l de solución de trabajo anti-Ly6G mAb (50 mg / ml) en una jeringa de insulina U-100 con la aguja 28 de calibre.
- Anestesiar a un adulto pIL1-DsRed ratón mediante inyección ip del cóctel anestésico previamente descrito (2.1). Coloque el abdomen del ratón anestesiado sobre una placa de trabajo limpio.
- Aplique presión hacia abajo suave a la piel dorsal y ventral de un ojo ratón para sobresalir parcialmente el globo ocular de la toma.
- Coloque con cuidado la aguja, el bisel hacia abajo, en un ángulo de aproximadamente 30 ° en el canto medial en el retro-orbitalseno.
NOTA: El operador puede sentir presión, penetración y resistencia aliviado una vez que las inserciones de aguja en el seno. - Lenta y suavemente inyectar 100 l de mAb contra Ly6G-solución (5 mg de mAb / ratón / inyección) en el ratón de trabajo. Retire la aguja rápidamente. Una pequeña cantidad de sangrado sugiere una inyección exitosa.
- Inmediatamente aplique 1,25% OX y la solución de vehículo sobre el derecho y el oído izquierdo del ratón.
- Después de 8 horas, administrar 100 l de anti Ly6G solución recién preparada mAb de trabajo (5 mg de mAb / ratón / inyección) a través de la inyección de retro-orbital en el mismo ratón.
- Para visualizar los vasos sanguíneos, inmediatamente antes de la imagen, administrar 100 l de 30 mg / ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con dextrano (150 kDa) a través de la inyección de retro-orbital.
4. intravital de imágenes de neutrófilos cebado en pil-1-DsRed ratones
- Anestesiar al ratón con la inyección ip de cóctel anestésico (2.1).0; Aplicar ungüento veterinario a los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia para la formación de imágenes.
- Preparar 1 ml de dosis media cóctel anestésico mediante la dilución de 500 l de cóctel anestésico original con un volumen igual de PBS.
- Transferir la mitad de la dosis de cóctel anestésico para jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 27 mariposa.
- Inserte la aguja de mariposa en el abdomen del ratón por vía intraperitoneal y fijar el ala de la mariposa en el abdomen con cinta adhesiva.
- Colocar un cubreobjetos de vidrio en el centro de la etapa de formación de imágenes. Cinta de los bordes del cubreobjetos para mantenerlo en su lugar.
- Colocar una gota de PBS en la superficie ventral de la oreja de ratón, así como en el cubreobjetos.
- Posición del ratón anestesiado con su oído sobre el cubreobjetos. Montar el lóbulo de la oreja, cara dorsal hacia abajo, intercalando la oreja entre el cubreobjetos y un portaobjetos de vidrio, también se mantiene en su lugar por medio de la cinta.
- Encienda un multi-láser confocal de fluorescencia y microscopio de todo lo relacionado correoquipment. Apagar las luces de las habitaciones para minimizar la exposición de luz ambiental.
- Abra el software de adquisición de imágenes. Seleccionar los canales de láser para la detección de colorantes fluorescentes en el menú Lista de tinte.
- Ajuste el enfoque en la piel de la oreja inflamada por la observación de las señales verdes de los vasos sanguíneos y las señales rojas de las células DsRed + a través del ocular.
- Realizar un análisis rápido con una velocidad de barrido de 2 microsiemens / pixel y resolución de 512 × 512 píxeles. Seleccionar un pseudocolor para cada canal en el menú Ver en vivo. Ajuste la perilla de enfoque para ajustar el inicio y final de localización de la exploración.
- Realizar escaneos lentos con velocidad de escaneo de 4 - 8 microsegundos / pixel y resolución de 800 × 800 o 1024 × 1024 píxeles. Ajuste la alta tensión, la ganancia y el offset en cada canal individual para maximizar la intensidad de las señales y evitar la saturación (píxeles rojos). No debe haber sólo unos pocos píxeles de color rojo en cada canal.
- Crear conjuntos de imágenes tridimensionales mediante el escaneo de THpiel de oreja e comenzando superficialmente en el estrato córneo y progresando hacia abajo con x, y, volúmenes z de 317 micras x 317 micras × 30 micras (objetivo 40X), 635 m x 635 m × 30 m (objetivo 20X), o 1.270 micras × 1.270 micras x 50 micras (objetivo 10X) a las 2 micras z pasos.
NOTA: La capa córnea es la capa más externa de la epidermis y puede ser fácilmente localizada basa en su fuerte señal de autofluorescencia. - En los experimentos de imagen de lapso de tiempo, grabar imágenes tridimensionales cada 2 ó 4 min para un máximo de 8 horas.
- De forma intermitente, como el ratón comienza a recuperarse de la anestesia, señaló basada en la observación de los bigotes temblorosos, administrar 5 - 10 l de media dosis cóctel de anestesia a través de la aguja de mariposa.
NOTA: Tenga cuidado con la dosis de anestesia - sobredosis puede causar la muerte del ratón. Alternativamente, la anestesia de inhalación en un frasco podría aplicarse a la del ratón para la anestesia y un corto plazocono de nariz se podría utilizar para obtener imágenes a largo plazo. - Retire el ratón anestesiado de la etapa en la que la imagen se ha completado. Separar la cinta y retire la aguja de la mariposa del abdomen del ratón. Devolver el ratón a una jaula separada en las instalaciones de alojamiento de los animales.
NOTA: Para imágenes de corta duración (<1 hora), los ratones se recuperan completamente de la anestesia rápidamente in 1 - 3 horas. Para imágenes a largo plazo (~ 8 horas), los ratones se recuperan lentamente, con un período de recuperación típico de 12 - 16 h. Así, la administración oral de agua se recomienda al menos varias veces durante el período de recuperación para prevenir la deshidratación severa. - Proceso de conjuntos de datos de imágenes, realizar un seguimiento de las células individuales, generan rutas migratorias, y calcular la dirección y con la velocidad de la migración celular utilizando el software de análisis de imagen 25.
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Representative Results
Proyección de ratones pIL1-DsRed se realiza basándose en la señal de fluorescencia fenotípica DsRed producido por sus leucocitos de sangre periférica mediante citometría de flujo. La estimulación con LPS se sabe que inducen la producción de IL-1β en las células mieloides, incluyendo neutrófilos, monocitos y células dendríticas 26-28. Por lo tanto, los leucocitos aislados se incubaron con LPS durante 4 horas antes de la citometría de flujo análisis. A continuación, gating se establece para las células mieloides basados en el tamaño celular (FSC) y la complejidad interna (SSC) (Figura 1 A) 29, y la señal de DsRed de circulación se mide en esta población cerrada. Circulantes células mieloides a partir de ratones WT mínimamente expresan DsRed, mientras que las mismas células de ratones pIL1-DsRed expresan señales distinguibles DsRed (Figura 1B). Los ratones pIL1-DsRed identificados por este método fenotipificación se utilizan para experimentos posteriores. Cabe señalar que el proceso de fenotipificación completo tarda sólo unos pocoshora - mucho más cortos que los métodos de genotipificación tradicionales, incluyendo la cosecha de tejidos, la digestión enzimática, el aislamiento de ADN, PCR y electroforesis.
La activación del promotor IL-1β se ha identificado recientemente como un marcador de neutrófilos cebado 22. Por lo tanto, el proceso dinámico de cebado de neutrófilos puede ser visualizado y evaluado en animales vivos usando ratones pIL1-DsRed. Para inducir la inflamación de la piel, el buey sensibilizador de la piel se aplica tópicamente sobre la oreja derecha de los ratones pIL1-DsRed y vehículo solo se aplica en la oreja izquierda del mismo animal. Para etiquetar los neutrófilos en los animales vivos, un protocolo recientemente desarrollado se lleva a cabo mediante la administración de una pequeña cantidad de marcado con fluorescencia contra Ly6G-mAb inmediatamente antes y 8 horas después de la aplicación OX. Para localizar los vasos sanguíneos, FITC-dextrano se inyecta inmediatamente antes de la imagen.
A las 24 h después de la aplicación OX, unagran número de DsRed + / + Ly6G células se encuentran en el espacio extravascular (Figura 2A) y representan los neutrófilos cebado. Un pequeño número de DsRed / Ly6G + también se encuentran células, lo que muy probablemente representan los neutrófilos en reposo. Por otra parte, una pequeña población de DsRed + / Ly6G - se observan células, que puede comprender los monocitos y macrófagos activados inflamatorias. En un vídeo de lapso de tiempo de 40 minutos, los neutrófilos Ly6G + emergentes dentro de una lesión inflamatoria de la piel exhiben lento movimiento como una ameba típica (Película Suplementaria 1). Rutas migratorias de células se realiza un seguimiento para comparar los comportamientos móviles de la DsRed + / + y DsRed Ly6G - poblaciones / Ly6G + neutrófilos (Figura 2B). La gráfica de tracks análisis revelan que tanto las poblaciones de neutrófilos muestran la migración "al azar" una vez que el espacio extracelular ha sido introducido (Figura 2C). Curiosamente,DsRed + Ly6G + neutrófilos / exhiben una velocidad significativamente mayor en comparación con sus DsRed - / + homólogos Ly6G (Figura 2D). Esto sugiere una asociación entre el cebado de neutrófilos y la motilidad acelerado en las lesiones inflamatorias.
Para controlar el tiempo de cebado de neutrófilos, una serie de vídeos con lapso de tiempo se registraron a partir de las diferentes momentos después del tratamiento OX (Películas Suplementarios 2 - 4). DsRed - / + células Ly6G, los neutrófilos en reposo, se hacen detectables en el espacio extravascular tan pronto como el 8 - 12 horas después de la aplicación OX y su número sigue siendo relativamente baja a partir de entonces (Figura 2E, Películas Suplementarios 3, 4). Por el contrario, el número de células DsRed + / + Ly6G, los neutrófilos imprimados, aumentar progresivamente en puntos de tiempo posteriores, a partir de 14 a 16 hr después de la aplicación OX. algunos DsRed
Figura 1:. Fenotipificación de ratones pIL1-DsRed (A) La citometría de flujo análisis demuestran una población de células mieloides (G1) sobre la base de FSC y SSC parámetros de circulación. (B) Histogramas en el canal FL2 muestran el porcentaje de células DsRed + dentro de la puerta G1 de las células de ratones pil-DsRed (rojo) o de los ratones WT (azul). Los datos son representativos de al least tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Visualización de Motile Actividades de DsRed + / Ly6G + neutrófilos en las lesiones inflamatorias de la piel (A) Imágenes de microscopía confocal estáticas registradas 24 horas después de tratamiento muestran OX tres poblaciones de leucocitos en el espacio extravascular, es decir, células DsRed + / Ly6G +. (asteriscos), DsRed - / + células Ly6G (triángulos), y DsRed + / Ly6G - células (flechas). Bar = 20 micras. DsRed + / + células Ly6G (rojo) y DsRed - células / Ly6G + (azul) se comparan para migratocaminos ry (B), las parcelas de pista (C) y (D) la velocidad de una película de lapso de tiempo de 40 minutos grabado por microscopía confocal a partir de 24 horas después de la aplicación OX (Película Suplementaria 1). (D) Las barras indican los valores de velocidad media. *** P <0,001. (E) El número de células DsRed + / + y DsRed Ly6G - / + Ly6G células se cuentan a partir de una serie de películas a intervalos grabadas desde diferentes puntos de tiempo después de la aplicación OX (Películas Suplementarios 2 a 4). Los datos mostrados son el número de células / mm 2 (medias ± DE) calculados a partir de tres imágenes consecutivas. (F) Las imágenes estáticas que se crean a partir de una película de lapso de tiempo registrado 11 a 14,5 horas después de la pintura OX (Película Suplementario 5). La flecha indica una célula Ly6G + que adquiere expresión DsRed en el espacio extravascular durante el período de observación.Bar = 50 micras. Las imágenes se reproducen a partir de la referencia 22 con permiso (Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc.). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Película Suplementaria 1: comportamiento de la movilidad de DsRed + neutrófilos en las lesiones inflamatorias de la piel (a las 24 horas después de la pintura OX) Imágenes de microscopía confocal muestran la motilidad de las células DsRed + / Ly6G + (rosa) y DsRed - / Ly6G + células (azul) en el espacio extravascular. Los vasos sanguíneos se observan en verde. Bar = 20 micras. El vídeo se ha reproducido de la referencia 22 con permiso (Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc.). Por favor, click aquí para ver el vídeo.
. Película 2 suplementario: comportamiento de la movilidad de DsRed + neutrófilos en las lesiones inflamatorias de la piel (a las 4 horas después de la pintura OX) Imágenes de microscopía confocal muestran DsRed + células / Ly6G + (rosa) y DsRed - células / Ly6G + (azul) en el espacio extravascular . Los vasos sanguíneos se observan en verde. Autofluorescencia está presente y asociado a los folículos pilosos. Bar = 100 micras. El vídeo se ha reproducido de la referencia 22 con permiso (Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc.). Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
Película suplementario 3: comportamiento de la movilidad de DsRed + neutrófilos en Inf. Las lesiones cutáneas lammatory (a las 8 horas después de la pintura OX) Imágenes de microscopía confocal muestran DsRed / Ly6G células + + (rosa) y DsRed - / + células Ly6G (azul) en el espacio extravascular. Los vasos sanguíneos se observan en verde. Autofluorescencia está presente y asociado a los folículos pilosos. Bar = 100 micras. El vídeo se ha reproducido de la referencia 22 con permiso (Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc.). Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
Película suplementario 4: comportamiento de la movilidad de DsRed + neutrófilos en las lesiones inflamatorias de la piel (a las 11 - 19h después de la pintura OX) Imágenes de microscopía confocal muestran DsRed + células / Ly6G + (rosa) y DsRed - células / Ly6G + (azul) en el. extravascular espacio. Los vasos sanguíneos se observan en verde. Autofluorescencia está presente y asociado a los folículos pilosos. Bar = 100 micras. El vídeo se ha reproducido de la referencia 22 con permiso (Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc.). Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
Película suplementario 5: Adquisición de Señales DsRed por Ly6G + neutrófilos de la película de lapso de tiempo se muestra en suplementario Video 4, este video mayor aumento muestra el proceso en el que una célula Ly6G + (indicado con una flecha) adquiere expresión DsRed en el extravascular. espacio durante el período de observación (11 a 14,5 horas después de la pintura OX). Bar = 50 micras. El vídeo se ha reproducido de la referencia 22 con permiso (Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de Immunologists, Inc.). Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
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Discussion
El objetivo de este estudio es desarrollar una tecnología para el seguimiento del proceso de cebado de neutrófilos en los animales vivos, que aún no ha sido cumplido por las técnicas disponibles en la actualidad. Para lograr este objetivo, se realizan tres metodologías establecidas: 1) la inducción de la inflamación de la piel en ratones reportero DsRed promotor impulsado por IL-1 como una medida de cebado, 2) etiquetado in vivo de los neutrófilos con dosis bajas de fluorescencia de conjugado anti-Ly6G mAb, y 3) de formación de imágenes de microscopía confocal intravital. La combinación de estos tres métodos permite la visualización de las actividades móviles de neutrófilos imprimados (DsRed + / Ly6G +) en las lesiones inflamatorias de la piel. La dirección de la migración y la velocidad de los neutrófilos imprimados se cuantifica adicionalmente a través de seguimiento de ruta migratoria. Mediante el registro de una serie de vídeos con lapso de tiempo, la cinética en tiempo real de aparición de neutrófilos imprimado se controla en lugar de la inflamación y la adquisición de expresión DsRed por ineutrófilos ndividual se observa también en el espacio extravascular. Por lo tanto, el proceso dinámico de cebado de los neutrófilos se ha visualizado con éxito en animales vivos por primera vez el uso de la tecnología que aquí se presenta.
Esta tecnología se emplea en varios pasos críticos. En primer lugar, los tejidos de la piel son las partes del cuerpo más convenientes para intravital de imágenes. La aplicación tópica de OX en la oreja de ratón permite la visualización directa de los comportamientos de células inmunes en la piel inflamada con microscopía confocal. En segundo lugar, el ratón debe estar sedado constantemente durante la exploración que hace necesario repetir las inyecciones de anestésico. Sin embargo, la sedación excesiva puede causar la matriz del ratón durante la exploración. Para evitar la sobredosis, se recomiendan dosis bajas de anestésico (un medio o un tercio de la dosis completa) para formación de imágenes a largo plazo. Tercera mAb-neutrófilos específica, la fluorescencia conjugado debe ser inyectado de forma intermitente debido a la corta vida útil de neutrófilos murinos (vida media de 8-10 hr 30). Por último, el dr enfoqueIFT es un problema importante cuando se toman imágenes de lapso de tiempo, lo que podría ser causada por múltiples factores tales como las variaciones de temperatura, el movimiento del cuerpo del ratón, inflamación de la oreja con el tiempo, y las vibraciones que surgen de funcionamiento del instrumento 31. Varios métodos han sido desarrollados para evitar la deriva, como la administración de una dosis constante de la sedación durante la proyección de imagen, la fijación de la oreja de ratón en su lugar con cinta adhesiva una lámina de vidrio sobre ella en el escenario, la instalación de una cámara ambiental para proporcionar oxígeno y calor a la sedado organismo, así como por manualmente reorientar el alcance cuando sea necesario 32,33.
Es igualmente importante señalar las limitaciones de este protocolo. En primer lugar, una lenta recuperación de ratón (12 - 16 h) después de un período de 8 horas de imágenes de longitud se observa debido a la sedación continua, lo que indica que este protocolo puede no ser adecuado para tales experimentos prolongados. Un enfoque alternativo es utilizar varios ratones en secuencia durante el período de formación de imágenes en lugar de ucantar una sola. En segundo lugar, se observa una fuga gradual de circulación de FITC-dextrano durante la exploración con el tiempo, lo que probablemente es causada por aumento de la permeabilidad de los vasos sanguíneos de la piel en el estado inflamatorio 34. Por lo tanto, la visualización de los vasos sanguíneos se ve marcadamente reducida en peligro dada la fluorescencia en circulación en etapas posteriores de formación de imágenes. Alternativamente, se puede utilizar lectinas conjugados con fluorescencia tales como B4 isolectina para marcar los vasos sanguíneos ya que estos se adhieren a las células endoteliales vasculares 35.
Además de la visualización del proceso de cebado de neutrófilos en las lesiones inflamatorias de la piel, la tecnología descrita aquí también se puede aplicar en muchos otros parámetros experimentales. En combinación con las ventanas de imagen se han desarrollado recientemente, la microscopía intravital delinear los comportamientos de los neutrófilos con imprimación se pudo evaluar en los tejidos profundos y órganos, incluidos el cerebro, glándulas mamarias, los pulmones y los órganos abdominales 36-39. Por otra parte, la visualización de la primING / activación de otros tipos de células tales como monocitos y macrófagos podría lograrse utilizando ratones pIL1-DsRed junto con etiquetado in vivo a través de la fluorescencia conjugado mAb específicos para el tipo de célula de interés. Tomados en conjunto, no sólo esta tecnología proporciona un marco fundamental para la imagen intravital del proceso de cebado de los neutrófilos en los animales vivos, sino que también da a conocer nuevos enfoques para el estudio del comportamiento y la función de otras células inmunes en varios estados inflamatorios que se desarrollan en diferentes tejidos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
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