利用IL-1β启动子驱动的DsRed报告小鼠进行中性粒细胞活化的活体成像

摘要

本实验方案采用荧光报告基因、体内标记和活体成像技术，以实现对活体动物中中性粒细胞预激活动态过程的监测。

摘要

中性粒细胞是人体血液循环中最丰富的白细胞，可迅速被募集至炎症部位。启动（priming）是增强中性粒细胞吞噬功能的关键事件。尽管已有大量研究揭示了中性粒细胞启动在感染与损伤过程中的存在及其重要性，但可视化这一过程的方法仍有限。 体内 一直无法获得。本方案通过结合三种方法，实现了在活体动物中监测中性粒细胞预激活的动态过程：1）DsRed 报告信号——用于评估预激活水平；2） 体内 中性粒细胞标记——通过注射荧光标记的抗淋巴细胞抗原6G（Ly6G）单克隆抗体（mAb）实现，以及3）活体共聚焦成像。本方案包含多个关键步骤：氧化唑酮诱导的小鼠耳部皮肤炎症、动物的适当麻醉、重复注射抗Ly6G单克隆抗体，以及成像过程中防止焦平面漂移。尽管观察到一些局限性，例如单只小鼠连续成像时间有限（约8小时）以及在炎症状态下异硫氰酸荧光素-葡聚糖从血管中渗漏，该方案仍为活体成像观察致敏中性粒细胞的行为与功能提供了基本框架，且可轻松扩展应用于小鼠炎症模型中其他免疫细胞的研究。

引言

中性粒细胞是循环中最丰富且寿命最短的白细胞。它们可迅速被募集至感染或损伤部位，通过释放活性氧和氮中间产物，以及含有抗菌肽和蛋白酶的颗粒，发挥专职吞噬细胞的功能。¹在募集过程中，中性粒细胞是 "预处理" 由多种因子（包括微生物产物、趋化因子和炎性细胞因子）诱导，导致吞噬细胞到达炎症部位后其功能显著增强²中性粒细胞预激活的机制已被广泛研究 体外^3,4；然而，该过程的动态监测 体内 迄今为止尚无法实现。

近年来，活体成像已成为可视化和量化活体生物体内细胞动态过程的重要技术。活体成像可通过传统的单光子激发显微镜（例如，共聚焦显微镜）或多光子显微镜技术实现⁵。随着时间推移，该技术取得了显著进步，实现了更高的图像分辨率、更深的成像深度、更少的组织光损伤以及更优的图像稳定性^6,7。由于其能够长时间动态观察细胞迁移与相互作用，活体显微镜已被广泛应用于免疫学的多个研究领域⁸。活体成像使免疫学家能够在活体动物模型中更深入地理解并阐明免疫反应在细胞和分子水平上的机制。

转基因和基因敲入报告小鼠的最新进展为在活体动物中监测中性粒细胞的动态行为提供了有用的工具。溶菌酶M启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白基因敲入小鼠已被广泛用于表征中性粒细胞、单核细胞和....

方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的指南进行，并经托莱多大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. pIL1-DsRed 小鼠的表型分析

注意：后代小鼠通过将杂合子 pIL1-DsRed 小鼠与野生型（WT）C57BL6 小鼠交配获得。3 至 4 周龄的幼鼠即可用于表型分析。小鼠下颌下出血操作遵循已有方案，仅作轻微修改²³。

1. 从小鼠幼崽全血中分离白细胞
   1. 向每个 1.5 ml 微量离心管中加入 20 µl 肝素。
   2. 从笼中取出一只幼崽，记录幼崽的标识标签。采集下颌静脉血液前无需对幼崽进行麻醉。
   3. 抓住幼崽颈部皮肤，使用 5 mm 采血针刺穿颊囊中的下颌静脉。施加适当力度形成小穿刺口，使血液从穿刺点渗出成滴。每只幼崽使用新的采血针。
   4. 将每只幼崽的 3–5 滴血液收集至含肝素的微量离心管中。清洁穿刺部位并施加压力以促进止血。
   5. 将幼崽放入新笼中，观察 30 分钟后再送回动物房。
   6. 采集已知表型的成年小鼠血液作为阳性和阴性对照。
   7. 向每管中加入 500 µl 红细胞裂解缓冲液，涡旋混匀，并在冰上孵育 5–10 分钟。
   8. 在每管细胞悬液下方缓慢加入 400–500 µl 胎牛血清（FBS）....

结果

pIL1-DsRed 小鼠的筛选基于其外周血白细胞通过流式细胞术检测到的表型 DsRed 荧光信号。已知 LPS 刺激可诱导髓系细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）产生 IL-1β^26-28。因此，在进行流式细胞术分析前，分离的白细胞需先与 LPS 共孵育 4 小时。随后，根据细胞大小（FSC）和内部复杂性（SSC）对循环中的髓系细胞设门（图 1A）²⁹，并在该设门群体中检测 DsRed 信号。来自野生型（WT）小鼠的循环髓系细胞几乎不表达 DsRed，而来自 pIL1-DsRed 小鼠的相同细胞则表现出可区分的 DsRed 信号（图 1B）。通过此表型鉴定方法确认的 pIL1-DsRed 小鼠将用于后续实验。需要注意的是，整个表型鉴定过程仅需数小时，远短于传统的基因分型方法（包括组织采集、酶消化、DNA 提取、PCR 及电泳）。

I.......

讨论

本研究旨在开发一种用于在活体动物中监测中性粒细胞启动过程的技术，而目前现有的技术尚未实现这一目标。为实现该目标，采用三种已建立的方法：1）在由IL-1β启动子驱动的DsRed报告基因小鼠中诱导皮肤炎症，以评估启动状态；2）使用低剂量荧光标记的抗Ly6G单克隆抗体对中性粒细胞进行体内标记；3）活体共聚焦显微成像。这三种方法的结合使得启动态中性粒细胞（DsRed⁺/Ly6G⁺）在炎症性皮肤病灶中的运动行为得以可视化。通过迁移路径追踪，进一步量化启动态中性粒细胞的迁移方向和速度。通过记录一系列延时视频，可实时监测炎症部位启动态中性粒细胞的出现动力学，并观察到单个中性粒细胞在血管外空间获得DsRed表达的过程。因此，利用本研究提出的技术，首次成功实现了在活体动物中对中性粒细胞启动动态过程的可视化。

该技术应用于多个关键步骤。首先，皮肤组织是活体成像中最方便的部位。将OX外用于小鼠耳部，可在共聚焦显微镜下直接观察炎症皮肤中免疫细胞的行为。其次，成像过程中必须持续对小鼠进行镇静，因此需要重复注射麻醉剂。然而，过度镇静可能导致小鼠在成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肝素钠	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK裂解缓冲液	Lonza	10-548E
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F0926
脂多糖	Sigma-Aldrich	L4391
盐酸氯胺酮	Hospira	NDC 0409-2051-05
赛拉嗪	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
乙酰丙嗪	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
脱毛膏	Church & Dwight
丙酮	Fisher Scientific	A16P4
氧化唑酮	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly6G 抗体	BioLegend	127610
U-100 胰岛素注射器（带28G针头）	BD	329461
荧光素异硫氰酸酯-羧基甲基-葡聚糖（FITC-CM-Dextran），150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
蝶形输液套件（27G针头）	BD	387312
FACSCalibur 流式细胞仪	BD
CellQuest Pro 软件	BD
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000
Metamorph 软件	Universal Imaging