Abstract
I neutrofili sono i leucociti più abbondanti in circolazione del sangue umano e sono rapidamente reclutati ai siti infiammatori. L'adescamento è un evento critico che aumenta la funzionalità fagocitaria dei neutrofili. Sebbene studi approfonditi hanno svelato l'esistenza e l'importanza di neutrofili adescamento durante l'infezione e lesioni, i mezzi di visualizzare questo processo in vivo sono stati disponibili. Il protocollo fornito consente il monitoraggio del processo dinamico di neutrofili adescamento in animali viventi combinando tre metodologie: 1) Segnale giornalista DsRed - usato come misura di adescamento 2) in vivo etichettatura neutrofili - ottenuto mediante iniezione di fluorescenza coniugato antigene anti-linfociti 6G (Ly6G) anticorpo monoclonale (mAb) e 3) confocale intravitale. Diversi passaggi critici sono coinvolti in questo protocollo: Mouse infiammazione oxazolone indotta pelle orecchio, adeguata sedazione degli animali, ripetute iniezioni di anti-Ly6G mAb, e prevenzione fuoco deriva durante l'imaging. Sebbene alcune limitazioni sono stati osservati, come il limite di tempo di imaging continuo (~ 8 ore) in un mouse e la fuoriuscita di fluorescina isotiocianato-destrano dai vasi sanguigni in stato infiammatorio, questo protocollo fornisce un quadro fondamentale per l'imaging intravitale di comportamento innescato neutrofili e la funzione, che può essere facilmente ampliato per l'esame di altre cellule del sistema immunitario in modelli murini di infiammazione.
Introduction
I neutrofili sono i più abbondanti e di breve durata leucociti in circolazione. Essi stanno rapidamente reclutati per i siti di infezione o lesioni, dove servono fagociti come professionisti attraverso il rilascio di reattivi intermedi ossigeno e di azoto insieme con granuli contenenti peptidi antimicrobici e proteasi 1. Durante il loro reclutamento, i neutrofili sono "innescato" da vari agenti compresi i prodotti microbici, chemoattractants, e citochine infiammatorie, con conseguente funzionalità dei fagociti nettamente migliorata all'arrivo in un sito di infiammazione 2. I meccanismi di priming neutrofili sono state ampiamente studiate in vitro 3,4; Tuttavia, il monitoraggio dinamico del processo in vivo non è stato possibile finora.
Recentemente, l'imaging intravitale è diventata una tecnica importante per la visualizzazione e quantificare le dinamiche cellulari di processi biologici degli organismi viventi. IntraviImaging tal può essere effettuato tramite convenzionale eccitazione microscopia one-photon (ad esempio, confocale) o multiphoton microscopia avvicina 5. Nel corso del tempo, sostanziali miglioramenti sono stati raggiunti in questa tecnica che consente una maggiore risoluzione delle immagini, una maggiore profondità delle immagini, riduzione fotodanneggiamento del tessuto, e una maggiore 6,7 stabilizzazione delle immagini. Data la sua capacità unica di consentire la visualizzazione dinamica di migrazione cellulare e l'interazione con il tempo, la microscopia intravitale è stato ampiamente applicato a diverse aree di studio in immunologia 8. l'imaging intravitale consente immunologi di comprendere e contestualizzare le risposte immunitarie, sia a livello cellulare e molecolare in modelli animali vivere meglio.
I recenti progressi nella transgenici e knock-in topi reporter hanno fornito strumenti utili per il monitoraggio dei comportamenti dinamici di neutrofili negli animali viventi. Il lisozima M promotore-driven maggiore proteina fluorescente verde knock-ini topi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la motilità dei neutrofili, monociti e macrofagi durante i vari processi infiammatori tra cui stravaso, infezione batterica, e l'infiammazione sterile 9-15. Inoltre, i topi transgenici che esprimono una fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia biosensore citoplasmatica sono stati impiegati nello studio delle attività di neutrofili mitogeno chinasi extracellulare-regolamentato e la proteina chinasi A all'interno dell'intestino infiammato 16. Un modello murino con alta specificità per l'espressione di fluorescenza nei neutrofili è il mouse Catchup knock-in, che produce Cre ricombinasi, nonche la tdTomato proteina fluorescente, che si è accoppiata espressione di linfociti antigene 6G (Ly6G) 17. Visualizzazione dei neutrofili Ly6G-deficienti attraverso questo modello ha dimostrato che queste cellule esercitano funzionalità normale in una varietà di contesti infiammatori vivo sterili o infettive. topi transgenici che esprimono la DsRed fluorescente protein gene sotto il controllo del mouse interleuikin-1β (IL-1β) promotore (pIL1-DsRed) sono stati utilizzati per visualizzare i comportamenti motilità delle cellule che producono IL-1b - ritenuto includere neutrofili, monociti infiammatori e macrofagi attivati - emergente in pelle infiammata 18.
In vivo etichettatura può servire come un approccio alternativo per tracciare i comportamenti cellulari e molecolari di neutrofili nei tessuti infiammati. Dopo l'iniezione endovenosa di basse dosi di fluorescente anti- Gr-1-anticorpo monoclonale (mAb), la cascata reclutamento di Gr-1 + neutrofili è stata visualizzata in lesioni cutanee topo con infezioni da Staphylococcus aureus 19. Somministrazione in vivo di coniugati contenenti streptavidina coniugati 705 nm punti quantici e biotinilato anti-Ly6G mAb etichetta specificamente neutrofili circolanti 20. Inoltre, endocitosi di tali coniugati in neutrophIL vescicole permette il monitoraggio del trasporto delle vescicole ad alta velocità nei neutrofili migrano nell'interstizio. In vivo etichettatura con anticorpi fluorescenza coniugato contro P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e chemochine (CXC motivo) recettore 2 (CXCR2) in un modello infiammatoria TNF-indotta ha chiarito i meccanismi di regolazione in gioco durante l'infiammazione precoce 21. neutrofili polarizzati sporgono uropodi PSGL-1-arricchito di interagire con CD62L presenti sulle piastrine attivate, con la conseguente ridistribuzione di CD11b e CXCR2, recettori che guidano la migrazione dei neutrofili e avviano l'infiammazione.
IL-1β è uno dei geni di firma che è elevata in neutrofili innescato 22. In topi reporter pIL1-DsRed, segnali di fluorescenza DsRed (es., L'attivazione del promotore di IL-1β) correlano positivamente con IL-1β mRNA espressione e la produzione di proteine di IL-1β. <sup> 18 per monitorare il processo di neutrofili adescamento, un metodo di microscopia intravitale è stato sviluppato coinvolgendo l'induzione di infiammazione della pelle con oxazolone (OX) nel modello murino pIL1-DsRed seguente etichettatura in vivo dei neutrofili con fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb. Attraverso questo modello, è possibile studiare il comportamento e la funzione dei neutrofili innescato in modelli animali di varie malattie e disturbi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali dell'Università di Toledo.
1. Fenotipizzazione di pIL1-DsRed Mice
NOTA: Offspring sono generati da allevamento topi pIL1-DsRed eterozigoti con topi wild-type (WT) C57BL6. Da tre a quattro settimane di età cuccioli sono considerati pronti per fenotipizzazione. Sanguinamento sottomandibolare di topi segue un protocollo stabilito con piccole modifiche 23.
- Isolamento dei globuli bianchi dal sangue intero di mouse Pups
- Aggiungere 20 ml di eparina a ciascuna provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Acquisire un cucciolo dalla gabbia. Registrare il tag di identificazione del cucciolo. Non è necessario per anestetizzare i cuccioli prima raccolta di sangue dalla vena sottomandibolare.
- Tenere cucciolo dal collo collottola e perforare la vena sottomandibolare in thsacchetto guancia e con una lancetta 5 mm. Applicare la forza sufficiente per creare una piccola puntura, in modo che gocce di sangue trasudano dal punto di penetrazione. Usare un ago nuovo per ogni cucciolo.
- Raccogliere 3 - 5 gocce di sangue per cuccioli in una provetta contenente eparina. Pulire il sito di puntura e applicare una pressione per facilitare l'emostasi.
- Mettere cucciolo in nuova gabbia e osservare per 30 minuti prima di tornare alla gabbia alla struttura degli animali.
- Raccogliere il sangue da topi adulti di un fenotipo noto come controlli positivi e negativi.
- Aggiungere 500 ml di tampone di lisi dei globuli rossi ad ogni provetta, tubi vortex, e incubare per 5 - 10 minuti in ghiaccio.
- Aggiungere lentamente 400 - 500 ml di siero fetale bovino (FBS) sotto le sospensioni di cellule in ogni tubo. Un'interfaccia chiara può essere osservata tra la sospensione cellulare di livello superiore e quella inferiore strato di FBS.
- tubi tappo e centrifugare i campioni a 1500 g per 5 min.
- Ripetere i punti 1.1.7 - 1.1.9 alla pellicciather rimuovere i globuli rossi. Non ripetere se lisi è sufficiente la prima volta. Il pellet dovrebbe essere difficile discernere dopo centrifugazione.
- Lipopolisaccaride (LPS) Stimolazione e cultura
- Risospendere le cellule in 200 ml di completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium.
- Trasferire la sospensione cellulare ad un tubo di citometria a flusso.
- Fare LPS soluzione di lavoro mescolando 10 ml di soluzione madre LPS (1 mg / ml) con 990 ml di completo RPMI 1640 medium.
- Aggiungere 20 ml di 10 mg / LPS ml di soluzione di lavoro per 200 ml di sospensione cellulare.
- Tubi Cap liberamente e incubare campioni per 4 ore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Flusso Analisi Citometria
- Aprire il programma di acquisizione dati per la citometria a flusso. Impostare template di acquisizione prima di assaggiare acquisizione.
- Fare clic sullo strumento Dot-Plot nella palette degli strumenti. Disegnare un foscatter rward (FSC) vs lato scatter plot (SSC). Impostare i parametri di tensione FSC e SSC a scala lineare.
- Selezionare i valori limite più bassi di FSC e SSC consentite dal citometro. Applicare le soglie di 200 e 50 per FSC e SSC, rispettivamente.
- All'interno del FSC vs SSC plot, disegnare un G1 cancello che comprende monociti, granulociti e cellule dendritiche, ed esclude detriti, globuli rossi e linfociti.
- Fare clic sullo strumento Istogramma nella palette degli strumenti. Disegnare un istogramma FL2 (canale fluorescenza rossa). Utilizzare un campione di controllo negativo per impostare la linea di base dei segnali FL2 e un campione di controllo positivo per disegnare una porta per includere tutti gli eventi positivi DsRed.
- Sul pannello Fluidics controllo del citometro, impostare la modalità fluido "RUN" e la portata di "HI" (circa 60 microlitri / min). Acquisire 10.000 eventi per ciascun campione.
- Determinare pup fenotipo misurando la percentuale di cellule positive DsRed dalla porta G1.
- Anestetizzare mouse intraperitoneale (ip) iniezione di un cocktail anestetico contenente 100 mg / kg ketamina, 10 mg / kg xylazina, e 1 mg / kg acepromazine. topi anestetizzati adeguatamente non mostrano posteriore ritiro zampa a pizzico punta.
- Applicare la crema depilazione alla superficie dorsale di entrambe le orecchie del mouse. Attendere 30 sec a 1 min. Pulire la superficie orecchio con cotone bagnato di acqua e lasciare asciugare all'aria.
- Misurare lo spessore orecchio con micrometro e sostituire il mouse in una gabbia separata. Osservare fino al recupero dall'anestesia (~ 15 - 30 min). Per risolvere infiammazione cutanea indotta dal prodotto epilazione, permettono mouse per riposare per 3 giorni prima di ulteriori sperimentazioni viene effettuata.
- Preparare 1,25% (w / v) OX sciogliendo 16,7 mg di OX in 1 ml di acetone e mescolando 750 ml di soluzione / acetone OX con 250 ml di olio di oliva. Preparare la soluzione veicolo mescolando 750 ml di acetone con 250 &# 181; l di olio d'oliva.
- Re-anestetizzare il mouse mediante iniezione ip di cocktail anestetico (2.1). Misurare lo spessore dell'orecchio come prima.
- Applicare 12,5 ml di 1,25% OX su ciascun lato dell'orecchio destro. Applicare 12,5 ml di acetone / oliva soluzione veicolo olio su ciascun lato del orecchio sinistro.
- Tenere il mouse separato dalla gabbia compagni fino alla completa guarigione per evitare insulto alle sue orecchie da altri topi, quindi sostituire il mouse nella sua gabbia originale e tornare alla struttura alloggiativa degli animali.
NOTA: la rimozione dei capelli può provocare l'infiammazione della pelle minore seguito dal cambiamento di spessore dell'orecchio. Questa infiammazione minore sarà risolta 3 giorni più tardi confermata da spessore orecchio normale. Dopo l'applicazione topica per 24 ore, le orecchie OX-trattati mostrano una significativa (p <0.01) gonfiore soluzione veicolo rispetto orecchie solo trattati.
3. Etichettatura dei neutrofili in pIL1-DsRed Mice
NOTA: In etichettatura vivo di neutrofili da una bassa dose di fluorescence-coniugato specifico per neutrofili mAb segue un protocollo sviluppato di recente 19. Iniezioni di retro-orbitale vengono eseguiti secondo un protocollo stabilito con alcune modifiche 24.
- Preparare la soluzione di lavoro anti-Ly6G mAb diluendo 10 ml di 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647 coniugato anti-Ly6G monoclonale (clone 1A8) in 90 ml di tampone fosfato (PBS).
- Trasferire 100 ml di soluzione di lavoro anti-Ly6G monoclonale (50 mg / ml) in un U-100 di insulina siringa con l'ago calibro 28.
- Anestetizzare un adulto pIL1-DsRed topo mediante iniezione ip del cocktail anestetico descritto in precedenza (2.1). Posizionare l'addome del mouse anestetizzato giù su una tavola di lavoro pulito.
- Applicare leggera pressione verso il basso dorsale pelle e ventrale un occhio mouse per sporgere parzialmente bulbo oculare dalla presa.
- posizionare accuratamente l'ago, smussare giù, con un angolo di circa 30 ° al canto mediale nel retro-orbitaleseno.
NOTA: L'operatore può sentire la pressione, la penetrazione e resistenza sollevato una volta gli inserti ago nel seno. - Lentamente e senza intoppi iniettare 100 ml di anti-Ly6G mAb soluzione (5 mg mAb / mouse / iniezione) nel mouse di lavoro. Rimuovere rapidamente l'ago. Una piccola quantità di sanguinamento suggerisce una iniezione di successo.
- Applicare immediatamente 1,25% OX e la soluzione veicolo sul orecchio sinistro destro del mouse e.
- Dopo 8 ore, somministrare 100 ml di soluzione preparata di recente anti-Ly6G monoclonale di lavoro (5 mcg mAb / mouse / iniezione) tramite iniezione retro-orbitale nello stesso mouse.
- Per visualizzare i vasi sanguigni, immediatamente prima di imaging, somministrare 100 ml di 30 mg / ml di fluoresceina isotiocianato (FITC) coniugata destrano (150 kDa) mediante iniezione retro-orbitale.
4. Imaging intravitale di neutrofili adescamento in Pil-1-DsRed Mice
- Anestetizzare il mouse con iniezione ip di cocktail anestetico (2.1).0; Applicare una pomata veterinario per gli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia per l'imaging.
- Preparare 1 ml metà dose cocktail anestetico diluendo 500 ml di cocktail anestetico originale con un volume uguale di PBS.
- Trasferimento mezza dose cocktail anestetico per 1 ml siringa con un ago calibro 27 farfalla.
- Inserire l'ago della farfalla in addome del mouse per via intraperitoneale e fissare l'ala farfalla per l'addome con nastro adesivo.
- Collocare un vetrino di vetro al centro del palcoscenico imaging. Nastro i bordi del vetrino per tenerlo in posizione.
- Mettere una goccia di PBS sulla superficie ventrale dell'orecchio del mouse nonché sul vetrino.
- Posizione anestetizzato del mouse con il suo orecchio sopra il vetrino. Montare la punta di un orecchio, lato dorsale verso il basso, dal sandwiching l'orecchio tra il vetrino e un vetrino, tenuto anche in luogo tramite nastro.
- Accendere un multi-laser confocale microscopio a fluorescenza e tutta la relativa equipment. Spegnere luci della stanza per minimizzare l'esposizione della luce ambiente.
- Aprire il software di acquisizione immagini. Selezionare i canali laser per la rilevazione di coloranti fluorescenti nel menu Dye List.
- Regolare il fuoco sulla pelle infiammata orecchio per l'osservazione dei segnali verdi dai vasi sanguigni e segnali rossi delle cellule + DsRed attraverso oculare.
- Eseguire una scansione veloce con velocità di scansione di 2 ms / pixel e una risoluzione di 512 × 512 pixel. Selezionare un pseudocolori per ogni canale nel menu Live View. Regolare la manopola di messa a fuoco per impostare la fine e iniziare posizione di scansione.
- Eseguire scansioni lente con velocità di scansione di 4-8 msec / pixel e risoluzione di 800 × 800 o 1.024 × 1.024 pixel. Regolare l'alta tensione, guadagno e offset su ciascun canale per massimizzare l'intensità dei segnali evitando saturazione (pixel rossi). Ci dovrebbe essere solo pochi pixel rossi in ogni canale.
- Creare set di immagini tridimensionali mediante la scansione di thla pelle e l'orecchio a partire superficialmente nello strato corneo e procedendo verso il basso con x, y, z volumi di 317 micron × 317 micron × 30 micron (obiettivo 40X), 635 micron × 635 micron × 30 micron (obiettivo 20X), o 1.270 micron × 1.270 micron × 50 micron (obiettivo 10X) a 2 micron z-passi.
NOTA: Lo strato corneo è lo strato più esterno dell'epidermide e può essere facilmente localizzati sulla forte segnale di autofluorescenza. - In esperimenti di imaging time-lapse, registrare le immagini tridimensionali ogni 2 o 4 min per un massimo di 8 ore.
- A intermittenza, come il mouse comincia a recuperare dall'anestesia, ha osservato basata sull'osservazione di baffi spasmi, somministrare 5 - 10 ml di mezza dose di anestesia cocktail con ago a farfalla.
NOTA: Siate prudenti della dose di anestesia - sovradosaggio può causare la morte del mouse. In alternativa, anestesia per inalazione in un vaso potrebbe essere applicato al mouse per anestesia breve termine econo potrebbe essere utilizzata per l'imaging a lungo termine. - Rimuovere il mouse anestetizzato dalla fase in cui l'imaging è completa. Staccare il nastro e rimuovere ago a farfalla dal ventre del mouse. Ritorna il mouse in una gabbia separata nella struttura stabulazione degli animali.
NOTA: Per l'imaging a breve termine (<1 ora), i topi riprendersi completamente dall'anestesia rapidamente in 1-3 ore. Per l'imaging a lungo termine (~ 8 ore), i topi recuperare lentamente, con un tipico periodo di recupero di 12 - 16 ore. Così, la somministrazione orale di acqua è raccomandato almeno diverse volte durante il periodo di recupero per evitare una grave disidratazione. - Processo set di dati di imaging, monitorare le singole cellule, generare percorsi migratori, e calcolare la direzionalità e la velocità di migrazione delle cellule utilizzando immagine software di analisi 25.
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Representative Results
Proiezione di topi pIL1-DsRed è effettuata sulla base del segnale di fluorescenza fenotipica DsRed prodotto dai loro leucociti del sangue periferico mediante citometria a flusso. Stimolazione LPS è nota per indurre la produzione di IL-1β in cellule mieloidi, tra cui i neutrofili, monociti e cellule dendritiche 26-28. Così, leucociti isolati vengono incubate con LPS per 4 ore prima di citometria a flusso di analisi. Avanti, gating è fissato per viene misurata in questa popolazione gated circolanti cellule mieloidi in base alle dimensioni delle cellule (FSC) e complessità interna (SSC) (Figura 1A) 29, e il segnale DsRed. Circolanti cellule mieloidi da topi WT minimamente esprimono DsRed, mentre le stesse cellule da topi pIL1-DsRed esprimono segnali DsRed distinguibili (Figura 1B). I topi pIL1-DsRed identificati da questo metodo fenotipizzazione sono utilizzati per esperimenti successivi. Va osservato che il processo fenotipizzazione completa richiede solo pochiore - molto più brevi rispetto ai metodi di genotipizzazione tradizionali, tra cui la raccolta dei tessuti, la digestione enzimatica, estrazione del DNA, PCR e l'elettroforesi.
Attivazione del promotore IL-1β è stato recentemente identificato come marcatore di neutrofili adescamento 22. Così, il processo dinamico di neutrofili adescamento può essere visualizzata e valutata in animali che vivono con i topi pIL1-DsRed. Per indurre l'infiammazione della pelle, il bue sensibilizzante della pelle viene applicato localmente sulla dell'orecchio destro di topi pIL1-DsRed e solo veicolo viene applicato sull'orecchio sinistro dello stesso animale. Per etichettare neutrofili negli animali viventi, un protocollo sviluppato di recente è effettuata somministrando una piccola quantità di fluorescente anti-Ly6G mAb immediatamente prima e 8 ore dopo l'applicazione OX. Per individuare vasi sanguigni, FITC-destrano viene iniettato immediatamente prima di imaging.
A 24 ore dopo l'applicazione OX, ungran numero di DsRed + / + Ly6G cellule si trovano nello spazio extravascolare (Figura 2A) e rappresentano innescato neutrofili. Un piccolo numero di DsRed / Ly6G + cellule si trovano anche, che molto probabilmente rappresentano neutrofili riposo. Inoltre, una piccola popolazione di DsRed + / Ly6G - si osservano cellule, che può comprendere monociti infiammatorie e macrofagi attivati. In un video time-lapse 40 min, Ly6G + neutrofili emergenti all'interno di una lesione cutanea infiammatoria mostrano tipico movimento di scansione amebe-like (Supplemental Film 1). Cellulari percorsi migratori sono tracciati per confrontare i comportamenti motilità del DsRed + / + Ly6G e DsRed - popolazioni / Ly6G + neutrofili (Figura 2B). La trama pista analisi rivelano che entrambe le popolazioni neutrofili mostrano migrazione "random" una volta lo spazio extracellulare è stato inserito (Figura 2C). È interessante notare che,DsRed + / + Ly6G neutrofili mostrano una significativamente più alta velocità rispetto ai loro DsRed - / + Ly6G controparti (Figura 2D). Questo suggerisce un'associazione tra neutrofili adescamento e la motilità accelerata nelle lesioni infiammatorie.
Per monitorare i tempi di neutrofili adescamento, una serie di video time-lapse sono stati registrati a partire in tempi diversi in seguito al trattamento OX (Supplementari Film 2 - 4). DsRed - / cellule Ly6G +, i neutrofili riposo, diventano rilevabile nello spazio extravascolare fin da 8-12 ore dopo l'applicazione OX e il loro numero rimane relativamente basso in seguito (Figura 2E, Film supplementari 3, 4). Al contrario, il numero di cellule DsRed + / + Ly6G, i neutrofili apice, aumenta progressivamente in momenti successivi, iniziando 14 - 16 ore dopo l'applicazione OX. alcuni DsRed
Figura 1:. Fenotipizzazione di topi pIL1-DsRed (A) citometria a flusso analizza dimostrare una popolazione di cellule mieloidi (G1) a base di FSC e parametri SSC circolanti. (B) istogrammi sul canale FL2 mostra la percentuale di cellule DsRed + all'interno di gate G1 delle cellule da topi pil-DsRed (rosso) o da topi WT (blu). I dati sono rappresentativi a Least tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Visualizzazione della motilità Attività di DsRed + / Ly6G + neutrofili nelle lesioni infiammatorie della pelle (A) le immagini di microscopia confocale statiche registrate 24 ore dopo lo show trattamento OX tre popolazioni leucocitarie nello spazio extravascolare, ad esempio, le cellule DsRed + / Ly6G +. (asterischi), DsRed - / + Ly6G cellule (triangoli), e DsRed + / Ly6G - cellule (frecce). Bar = 20 micron. + / + Ly6G cellule DsRed (rosso) e DsRed - cellule / Ly6G + (blu) vengono confrontati per migratopercorsi ry (B), trame di pista (C), e la velocità (D) da un 40 min time-lapse filmato registrato al microscopio confocale a partire 24 ore dopo l'applicazione OX (Supplemental Film 1). (D) barre indicano valori medi di velocità. *** P <0.001. (E) Il numero di cellule / DsRed + Ly6G + e DsRed - / + Ly6G cellule sono contate da una serie di filmati time-lapse registrate in diversi punti temporali dopo l'applicazione OX (supplementari Film da 2 a 4). I dati riportati sono i numeri di cellule / mm 2 (media ± SD) calcolati da tre immagini consecutive. (F) Le immagini statiche vengono create da un filmato time-lapse registrato 11-14,5 ore dopo la verniciatura OX (Supplemental Film 5). La freccia indica una cella Ly6G + che acquista espressione DsRed nello spazio extravascolare durante il periodo di osservazione.Bar = 50 micron. Le immagini vengono riprodotte dal riferimento 22 con il permesso (Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc.). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Supplementare Film 1: Motile Comportamento di DsRed + neutrofili nelle lesioni infiammatorie della pelle (a 24 ore dopo la verniciatura OX) immagini di microscopia confocale mostrano la motilità delle cellule DsRed + / Ly6G + (rosa) e DsRed - / Ly6G + cellule (blu) a spazio extravascolare. I vasi sanguigni sono visti in verde. Bar = 20 micron. Il video viene riprodotto dal riferimento 22 con il permesso (Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc.). Si prega di click qui per visualizzare questo video.
. Supplementare Movie 2: Motile Comportamento di DsRed + neutrofili nelle lesioni infiammatorie della pelle (a 4 ore dopo la verniciatura OX) immagini al microscopio confocale mostrano cellule DsRed + / Ly6G + (rosa) e DsRed - cellule / Ly6G + (blu) nello spazio extravascolare . I vasi sanguigni sono visti in verde. Autofluorescenza è presente e associati a follicoli piliferi. Bar = 100 micron. Il video viene riprodotto dal riferimento 22 con il permesso (Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc.). Clicca qui per visualizzare questo video.
Film supplementare 3: Motile Comportamento dei DsRed + neutrofili in Inf. Le lesioni cutanee lammatory (a 8 ore dopo la verniciatura OX) immagini al microscopio confocale mostrano cellule DsRed + / Ly6G + (rosa) e DsRed - / + Ly6G cellule (blu) nello spazio extravascolare. I vasi sanguigni sono visti in verde. Autofluorescenza è presente e associati a follicoli piliferi. Bar = 100 micron. Il video viene riprodotto dal riferimento 22 con il permesso (Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc.). Clicca qui per visualizzare questo video.
Film supplementare 4: Motile Comportamento di DsRed + neutrofili nelle lesioni infiammatorie della pelle (a 11-19 ore dopo la verniciatura OX) immagini al microscopio confocale mostrano cellule DsRed + / Ly6G + (rosa) e DsRed - cellule / Ly6G + (blu) nel. extravaspazio scular. I vasi sanguigni sono visti in verde. Autofluorescenza è presente e associati a follicoli piliferi. Bar = 100 micron. Il video viene riprodotto dal riferimento 22 con il permesso (Copyright 2015. L'associazione americana degli immunologi, Inc.). Clicca qui per visualizzare questo video.
Film supplementare 5: acquisizione dei segnali DsRed da Ly6G + neutrofili Dal film time-lapse mostrato in supplementare Video 4, il video più alto ingrandimento mostra il processo in cui una cella Ly6G + (indicato con una freccia) acquisisce espressione DsRed nel extravascolare. spazio durante il periodo di osservazione (11-14,5 ore dopo la verniciatura OX). Bar = 50 micron. Il video viene riprodotto dal riferimento 22 con il permesso (Copyright 2015. L'American Association of Immunologists, Inc.). Cliccate qui per vedere il video.
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Discussion
Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una tecnologia per il monitoraggio del processo di neutrofili adescamento in animali viventi, che non è stata ancora soddisfatte dalle tecniche attualmente disponibili. Per raggiungere questo obiettivo, tre metodologie consolidate vengono eseguiti: 1) induzione di infiammazione della pelle in topi reporter DsRed promotore-driven IL-1b come misura di priming, 2) in vivo etichettatura dei neutrofili con basse dosi di fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb, e 3) confocale microscopia intravitale. La combinazione di questi tre metodi consente la visualizzazione delle attività motilità dei neutrofili innescato (DsRed + / Ly6G +) a lesioni cutanee infiammatorie. La direzione della migrazione e la velocità dei neutrofili apice è ulteriormente quantificati tramite monitoraggio percorso migratorio. Con la registrazione di una serie di video time-lapse, la cinetica in tempo reale di emersione dei neutrofili innescato è monitorato a sito infiammatorio e l'acquisizione di espressione DsRed da ineutrofili ndividual si osserva anche nello spazio extravascolare. Così, il processo dinamico di neutrofili priming è stata visualizzata con successo negli animali viventi per la prima volta utilizzando la tecnologia qui presentata.
Questa tecnologia è impiegata in vari passaggi critici. In primo luogo, i tessuti della pelle sono le parti del corpo più convenienti per l'imaging intravitale. L'applicazione topica di OX sull'orecchio del mouse permette la visualizzazione diretta dei comportamenti delle cellule del sistema immunitario in pelle infiammata al microscopio confocale. In secondo luogo, il mouse deve essere sedato costantemente durante l'imaging che rende necessario ripetere le iniezioni di anestetico. Tuttavia, over-sedazione può causare die mouse durante l'imaging. Per evitare il sovradosaggio, basse dosi di anestetico (a metà o un terzo della dose totale) sono raccomandati per l'imaging a lungo termine. Terzo, specifici neutrofili mAb fluorescenza coniugato deve essere iniettato intermittenza a causa della breve durata di neutrofili murini (emivita di 8-10 ore 30). Ultimo, dr fuocoIFT è una questione importante durante il time-lapse imaging, che potrebbero essere causati da molteplici fattori, tra cui le variazioni di temperatura, il movimento del corpo del mouse, l'orecchio gonfiore nel corso del tempo, e le vibrazioni derivanti dal funzionamento dello strumento 31. Diversi metodi sono stati sviluppati per prevenire deriva, come la somministrazione di una dose costante di sedazione durante l'imaging, che fissa l'orecchio mouse in posizione con nastro adesivo un vetrino su di esso sulla scena, l'installazione di una camera ambientale per fornire ossigeno e calore al sedato organismo oltre che da ricreare manualmente focalizzando l'ambito ove necessario 32,33.
E 'altrettanto importante stabilire i limiti di questo protocollo. In primo luogo, una ripresa lenta del mouse (12 - 16 ore) dopo un periodo di 8 ore di immagini di lunghezza si osserva a causa della sedazione continua, indicando che questo protocollo non può essere adatto per questi lunghi esperimenti. Un approccio alternativo è quello di utilizzare diversi topi in sequenza lungo il periodo di imaging piuttosto che ucantare una sola. In secondo luogo, si osserva una graduale perdita di circolazione FITC-destrano durante l'imaging nel corso del tempo, che è probabilmente causato da un aumento della permeabilità dei vasi sanguigni della pelle nello stato infiammatorio 34. Così, la visualizzazione dei vasi sanguigni è notevolmente compromessa dato ridotta fluorescenza in circolazione nelle fasi successive di imaging. In alternativa, si può usare lectine coniugate fluorescenza come isolectin B4 per contrassegnare vasi sanguigni come queste aderire alle cellule endoteliali vascolari 35.
In aggiunta alla visualizzazione del processo di neutrofili priming nelle lesioni infiammatorie cutanee, la tecnologia qui descritto può essere applicato anche in molte altre impostazioni sperimentali. In combinazione con Windows Imaging sviluppati di recente, la microscopia intravitale delineando i comportamenti dei neutrofili innescato potrebbe essere valutato in tessuti profondi e organi compreso il cervello, ghiandole mammarie, polmoni, e gli organi addominali 36-39. Inoltre, la visualizzazione di priming / attivazione di altri tipi cellulari, quali monociti e macrofagi potrebbe essere realizzato utilizzando topi pIL1-DsRed insieme etichettatura in vivo tramite fluorescenza coniugato mAb specifici per il tipo cellulare di interesse. Nel loro insieme, non solo questa tecnologia fornisce un quadro di riferimento fondamentale per l'imaging intravitale del processo di adescamento dei neutrofili negli animali viventi, ma svela anche nuovi approcci per studiare il comportamento e la funzione delle altre cellule del sistema immunitario in vari stati infiammatori che si svolgono in diversi tessuti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
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