Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Summary

Questo protocollo attuale impiega reporter fluorescenti, marcatura in vivo e tecniche di imaging intravitale per consentire il monitoraggio del processo dinamico di priming dei neutrofili negli animali viventi.

Abstract

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti in circolazione del sangue umano e sono rapidamente reclutati ai siti infiammatori. L'adescamento è un evento critico che aumenta la funzionalità fagocitaria dei neutrofili. Sebbene studi approfonditi hanno svelato l'esistenza e l'importanza di neutrofili adescamento durante l'infezione e lesioni, i mezzi di visualizzare questo processo in vivo sono stati disponibili. Il protocollo fornito consente il monitoraggio del processo dinamico di neutrofili adescamento in animali viventi combinando tre metodologie: 1) Segnale giornalista DsRed - usato come misura di adescamento 2) in vivo etichettatura neutrofili - ottenuto mediante iniezione di fluorescenza coniugato antigene anti-linfociti 6G (Ly6G) anticorpo monoclonale (mAb) e 3) confocale intravitale. Diversi passaggi critici sono coinvolti in questo protocollo: Mouse infiammazione oxazolone indotta pelle orecchio, adeguata sedazione degli animali, ripetute iniezioni di anti-Ly6G mAb, e prevenzione fuoco deriva durante l'imaging. Sebbene alcune limitazioni sono stati osservati, come il limite di tempo di imaging continuo (~ 8 ore) in un mouse e la fuoriuscita di fluorescina isotiocianato-destrano dai vasi sanguigni in stato infiammatorio, questo protocollo fornisce un quadro fondamentale per l'imaging intravitale di comportamento innescato neutrofili e la funzione, che può essere facilmente ampliato per l'esame di altre cellule del sistema immunitario in modelli murini di infiammazione.

Introduction

I neutrofili sono i più abbondanti e di breve durata leucociti in circolazione. Essi stanno rapidamente reclutati per i siti di infezione o lesioni, dove servono fagociti come professionisti attraverso il rilascio di reattivi intermedi ossigeno e di azoto insieme con granuli contenenti peptidi antimicrobici e proteasi ^1. Durante il loro reclutamento, i neutrofili sono "innescato" da vari agenti compresi i prodotti microbici, chemoattractants, e citochine infiammatorie, con conseguente funzionalità dei fagociti nettamente migliorata all'arrivo in un sito di infiammazione ^2. I meccanismi di priming neutrofili sono state ampiamente studiate

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali dell'Università di Toledo.

1. Fenotipizzazione di pIL1-DsRed Mice

NOTA: Offspring sono generati da allevamento topi pIL1-DsRed eterozigoti con topi wild-type (WT) C57BL6. Da tre a quattro settimane di età cuccioli sono considerati pronti per fenotipizzazione. Sanguinamento sottomandibolare di topi segue un protocollo stabilito con piccole modifiche ^23.

1. Isolamento dei globuli bianchi dal sangue....

Results

Proiezione di topi pIL1-DsRed è effettuata sulla base del segnale di fluorescenza fenotipica DsRed prodotto dai loro leucociti del sangue periferico mediante citometria a flusso. Stimolazione LPS è nota per indurre la produzione di IL-1β in cellule mieloidi, tra cui i neutrofili, monociti e cellule dendritiche ^26-28. Così, leucociti isolati vengono incubate con LPS per 4 ore prima di citometria a flusso di analisi. Avanti, gating è fissato per viene misurata in questa popolazi.......

Discussion

Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una tecnologia per il monitoraggio del processo di neutrofili adescamento in animali viventi, che non è stata ancora soddisfatte dalle tecniche attualmente disponibili. Per raggiungere questo obiettivo, tre metodologie consolidate vengono eseguiti: 1) induzione di infiammazione della pelle in topi reporter DsRed promotore-driven IL-1b come misura di priming, 2) in vivo etichettatura dei neutrofili con basse dosi di fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb, e 3) confo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eparina sodica	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
tampone di lisi ACK	Lonza	10-548E
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolisaccaridi	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamina cloridrato	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xilazina	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazina	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Crema depilatoria	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-topo Anticorpo Ly6G	BioLegend	127610
Siringa da insulina U-100 con ago da 28 G	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Set per infusione a farfalla (ago da 27 G)	BD	387312
FACSCalimetro	BD
CellQuest Pro software	BD
Microscopio confocale	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging