Summary
يوفر الغلاف الجليدي الوصول إلى الكائنات الحفاظ عليها التي لا تزال قائمة في ظل ظروف بيئية الماضية. ويرد بروتوكول لجمع وتطهير النوى الجليد السرمدي من التربة والجليد. غياب المستعمرات الخارجية والحمض النووي تشير إلى أن الكائنات الحية الدقيقة الكشف تمثل المواد، بدلا من التلوث الناجم عن الحفر أو المعالجة.
Introduction
الغلاف الجليدي (على سبيل المثال، والتربة دائمة التجمد، ملامح الجليد والثلوج الجليدية، فيرن، والجليد) تعطي لمحة عن أنواع الكائنات الحية استمرت في ظل ظروف بيئية الماضية. وبما أن هذه ركائز يمكن أن يكون عشرات ومئات الآلاف من السنين القديمة ومجتمعاتهم الميكروبية، عندما حفظت مجمدة منذ الترسيب، وتعكس الظروف البيئية القديمة. لتحليل هذه النظم الإيكولوجية بشكل مناسب واستخراج المعلومات البيولوجية ذات مغزى من التربة المجمدة والجليد، وجمع الصحيح وتجهيز العينات المجمدة من الضروري. هذا هو من أهمية قصوى كما الإسقاطات المناخية للقرن الحادي و21 تشير إلى احتمال ارتفاع درجة الحرارة وضوحا في المناطق القطبية الشمالية ومناطق القطب الشمالي الفرعية 1. على وجه التحديد، من المتوقع لتدفئة حوالي 5 درجات مئوية و 7 درجات مئوية، على التوالي بحلول عام 2100 2،3 ألاسكا الداخلية وغرينلاند. ومن المتوقع أن تؤثر بشكل كبير على التربة والمجتمعات الميكروبية المائية، وبالتالي، يرتبط هذاالعمليات البيولوجية الكيميائية. ومن المتوقع أن يبدأ تدهور الأراضي دائمة التجمد في العديد من المجالات 2-5 مما قد يؤدي إلى سمكا، إذابة موسميا (نشط) طبقة 6،7، وذوبان التربة المجمدة، وذوبان الجليد الهيئات الضخمة مثل ارتفاع درجات الحرارة وهطول الأمطار النظام تغير الجليد الأرضي، أسافين الجليد، وفصل الجليد 8. هذا من شأنه أن يحدث تغييرا هائلا في الصفات البيولوجية الكيميائية بالإضافة إلى التنوع البيولوجي للنباتات والحيوانات في هذه النظم الإيكولوجية.
الجليد الجليد وsyngenetic الرواسب دائمة التجمد والجليد ميزات قد حوصر الأدلة البيولوجية للبيئة تمثل ما عاش هناك في ذلك الوقت ملامح شكلت الكيميائية و. على سبيل المثال، في ولاية ألاسكا الداخلية، سواء Illinoisan ويسكونسن الذين تتراوح أعمارهم بين الجليد الدائم والحاضر وهذا الجليد الدائم على وجه الخصوص يوفر مواقع فريدة من نوعها تعود من الحديث إلى 150،000 سنة قبل الوقت الحاضر (YBP) التي تحتوي على الأدلة البيولوجية والجيوكيميائية من السلطة الإسرائيليةط م من التغيرات المناخية الماضية على التنوع البيولوجي. ونتيجة لذلك، توفر هذه الرواسب سجل من البيوجيوكيميائية والتنوع البيولوجي على امتداد آلاف السنين. منذ المنطقة لديها معدلات ترسيب منخفض، ولم يكن الجليدية، والعينات دون عائق يمكن الوصول إليها لجمع وتحليل، إما الحفر رأسيا في التربة أو الحفر أفقيا في الأنفاق. الأهم من ذلك، سجلات واسعة موجودة التي تبرز خصوصا الميزات البيولوجية الكيميائية الفريدة من الجليد في هذه المنطقة 9-14. على وجه التحديد، وتطبيق تحليل الحمض النووي لتقدير وجود ومدى التنوع البيولوجي في كل من عينات الجليد والتربة المتجمدة موجودة وقديمة يتيح استكشاف الربط بين الظروف البيئية القديمة والسكن للاحتلال من قبل كائنات محددة.
وقد حددت الدراسات السابقة التأثيرات المناخية على الثدييات والنباتات والكائنات الحية الدقيقة من عينات تعود إلى 50K YBP 11، 15-19، على الرغم من كل دراسة استخدمت احمنهجية الإقليم الشمالي لجمع وتطهير التربة المتجمدة أو الجليد النوى. في بعض الحالات، تم تعقيمها النوى حفر 16، 20-21، على الرغم من أن منهجية محددة لم توضح ما إذا كانت الأحماض النووية الأجنبية ألغيت أيضا من العينات. في دراسات أخرى، بكتيريا يعزل 15 (على سبيل المثال، السراتية الذابلة) وكذلك المجهرية الفلورسنت 22 استخدمت لقياس مدى فعالية إجراءات إزالة التلوث.
وكانت هذه التجربة جزءا من دراسة أكبر التحقيق المجتمعات الميكروبية من عينات التربة المتجمدة التي يعود تاريخها إلى ما يقرب من 40K YBP. وكان الهدف المحدد لهذا الجزء من الدراسة لتطهير الثلج والجليد السرمدي النوى بنجاح. على حد علمنا، لا يوجد لديه منهجية متكاملة لاستخدام حلول تهدف إلى القضاء على الأحماض النووية الأجنبية وnucleases المرتبطة من الجزء الخارجي من النوى المجمدة. هذا على الرغم من حقيقة أن هذه الحلول هي commonlذ استخدامها لتطهير معدات المختبرات لإجراء التجارب الجزيئية.
مرة واحدة تم تطهير النوى، تم استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام البروتوكولات التي وضعتها غريفيث وآخرون. 23 وتووي وآخرون. 24، كميا باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وتضعف مع الماء المعقم، وخالية من الحمض النووي لتحقيق 20 نانوغرام في رد الفعل. وتضخمت البكتيرية الجينات 16S الريباسي مع الاشعال 331F و797R وسبر BacTaq 25 و 16S archaeal وتضخمت الريباسي الجينات مع الاشعال قوس 349F وقوس 806R وتحقيق TM قوس 516F 26 وفقا للشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 600 ثانية تليها 45 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 57 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 25 ثانية مع التمديد النهائي عند 40 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. وأجريت جميع ردود الفعل QPCR في نسختين. شملت 20 مجلدا رد فعل ميكرولتر 20 نانوغرام الحمض النووي، و 10 ميكرومتر الاشعال، 5 ميكرومتر لجنة التحقيق، و 10 ميكرولتر من مزيج رد فعل QPCR. معايير FOص البكتيرية وarchaeal QPCR تم إعدادها باستخدام الحمض النووي الجيني من الزائفة المتألقة وملحاء عصوية ملحية، على التوالي. كانت تزرع على حد سواء لتسجيل المرحلة. أجريت التهم لوحة وتم عزل الحمض النووي من الثقافات. وكان كميا الجينوم الحمض النووي مع معمل مع افتراض واحد وستة نسخ من الجين 16S الريباسي في الجينوم له. salinarum و P. المتألقة، على التوالي 27-28. حسبت أعداد نسخة من الجينات البكتيرية وarchaeal على أساس منحنى قياسي، سجل حولت لحساب الفروق غير المتكافئة بين العلاجات، والمقررة من قبل ANOVA.
تم تحديد تكوين المجتمع من خلال تسلسل الجينات 16S الريباسي باستخدام خلايا تدفق والتكنولوجيات تضخيم الجسر وتحليل المجتمعات مع "رؤى الكمي في البيئة الميكروبية" (QIIME) 29. إلى الأمام وعكس يقرأ وانضم معا ثم تسلسل تم تصفيتها، فهرسة،وتم اختيار ممثلي ذات جودة عالية لدي نوفو الوحدات التصنيفية التشغيلية (اتو) التعيين من خلال تسلسل المحاذاة مع قاعدة بيانات مرجعية. وتمت مقارنة تسلسل الانحياز إلى قاعدة بيانات مرجعية مستقلة للتعيين التصنيفية. تم إنشاء جدول OTU مستوى الأسرة في اللغات لتحديد تكوين المجتمع العام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المعدات والجليد المستديمة مجموعة كور
- إعداد المعدات وجمع العينات الميدانية والعتاد المحافظة
- تجميع اوجير لجمع العينات عن طريق إدخال محول محرك الأقراص في أعلى للبرميل وتناوب على رافعة لقفل في مكانه. دبوس أنبوب محول على محول محرك الأقراص ويعلقون المحرك على الأنبوب محول. تضاف قطع على برميل.
- ارتداء سترات خفيفة واجب، قفازات النتريل، وأقنعة للحد من أي تلوث للعينات. ارتداء حماية الأذن وقبعة الثابت للسلامة عند دخول الجليد المستديمة نفق (الشكل 1).
- دخول النفق وحدد موقعا لجمع العينات (الشكل 1B).
ملاحظة: للحصول الرأسي أو الأفقي موقع الحفر، حدد المنطقة التي توجد المعروف دليلا على أن مادة يتم تجميد (على سبيل المثال، الثلج أو الجليد الدائم)، لا توجد أنظمة جذر كبيرة معروفة، وليس هناك الحصى معروف. حذف الكلالذين يعيشون المواد النباتية من المنطقة قبل جمع العينة. إذا الحفر رأسيا أو أفقيا، حدد المنطقة التي هي شقة نسبيا ويمكن الوصول إليها مع اوجير. - إعداد محطة العمل من قبل طبقات الأرض مع المواد البلاستيكية التي تم تعقيمها مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
- وضع 10 سم القطر البولي فينيل كلوريد (PVC) قطع أنبوب في نصف بالطول على محطة العمل لتوفير حوض لعقد النوى كما يتم إزالتها من البريمة. تطهير الأنابيب البلاستيكية مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
- بالقرب من محطة عمل، تطهير اوجير عن طريق الرش مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث. إزالة الحلول من اوجير مع القضاء.
- الثلج والجليد السرمدي جمع الأساسية والتخزين
- حدد مساحة من الجدار لعينة (انظر 1.2.1ملاحظة).
- تطهير ما يقرب من 10 قطرها سم من منطقة الجدار المجمدة من قبل القضاء عليه مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
- رفع اوجير تطهير للمنطقة من الفائدة بحيث يكون عموديا على منطقة العينة وتبدأ الحفر في الوجه وتنظيفها من الجدار (الشكل 1C، D).
- إزالة بعناية اوجير من منطقة جمع العينات. فصل اوجير من المحرك ووضع اوجير فوق الأنابيب البلاستيكية المعقمة في محطة عمل نظيفة. بعناية إمالة اوجير بحيث النوى المجمدة تنزلق على الأنابيب البلاستيكية المعقمة (الشكل 1E).
- تطهير قفازات مع 70٪ الأيزوبروبانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
- التقاط الثلج والجليد السرمدي النوى مع قفازات معقمة ووضعها في أكياس معقمة.
- وضع النوى في غرفة برودة أو باردة حتى يتم شحنها أو معالجتها.
- الشيخالملكية الفكرية النوى المجمدة باستخدام الثلج الجاف للحفاظ عليها عند درجة حرارة أقل من 0 درجة مئوية.
- على الفور تخزين النوى في -80 درجة مئوية.
2. الجليد المستديمة والجليد المعالجة الأساسية
- تحضير المواد
- إعداد عقيمة، النووي حمض الحرة الثقيلة رقائق الألومنيوم، ورفوف معدنية، والأواني الزجاجية، الملقط المعدني، والصوف الزجاجي من الخبز في الفرن على 450 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. نقض هذه المواد حتى استخدامها.
- تعقيم 95٪ من الإيثانول والماء عالى النقاء عن طريق تمرير الحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
- حل الإيثانول مخزن في -20 درجة مئوية والمياه في 4 درجات مئوية.
- تعقيم حاكم البلاستيك عن طريق الرش مع الايثانول 70٪، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وحل ريبونوكلياز إزالة التلوث والقضاء على الفور بعد كل حل.
- إعداد الثقافة البكتيرية
- إعداد مرق ولوحات لزراعة السراتية الذابلة.
- للمرق، والجمع بين 5 ز المحاولةptone، 1 غرام جلوكوز، 5 ز خلاصة الخميرة، و 1 غرام فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة، والماء ثم يضاف المقطر ليصل إلى 1 L. لجعل لوحات، إضافة 15 غراما من أجار إلى المزيج أعلاه. للمرق ولوحات، وضبط درجة الحموضة إلى 7 والأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إعداد 1X الفوسفات مصقول المالحة حل (PBS) من خلال الجمع بين 8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام من كلوريد البوتاسيوم، 1.44 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم، و 0.24 غرام البوتاسيوم الفوسفات أحادي القاعدة وإضافة الماء المقطر لتصل إلى 800 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وإضافة الماء المقطر ليصل إلى 1 L. الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة.
- تطعيم مرق مع حلقة عقيمة عن طريق غمس في س. ثقافة marcescens الذي سبق تخزينها في المجمد -80 درجة مئوية. تحت ظروف معقمة، مخفف المسلسل الثقافة عن طريق إضافة 1 مل من ثقافة إلى 9 مل من برنامج تلفزيوني ويدويا عكس الحل. إضافة 1 مل من هذا التخفيف إلى 9 مل من برنامج تلفزيوني ويدويا عكس الحل. كرر ثماني مرات أكثر حتى 10 -9 diluيتم التوصل إلى نشوئها.
- نشر 10 -6 و 10 -7 و 10 -8، و 10 -9 حلول على لوحات أجار عن طريق توزيع 1 مل من مرق على لوحة ونشر مع رش الخلية. هل هذا في ثلاث نسخ في التخفيف. تخزين الثقافة الأصلية في 4 درجات مئوية.
- احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. حساب عدد من المستعمرات لحساب عدد الخلايا في الثقافة الأصلية. ملاحظة: إن عدد من المستعمرات في الثقافة الأصلية تعتمد على معدل نمو البكتيريا.
- الماصة 250 ميكرولتر من الثقافة الأصلية في العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. تمييع الثقافة الأصلية بإضافة حجم ما يكفي من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على ما يقرب من 10 9 خلية / مل على النحو الذي يحدده عدد مستعمرة في الخطوة السابقة. بيليه الخلايا في أنبوب microcentrifuge بواسطة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: إن حجم برنامج تلفزيوني 1X تختلف تبعا لمعدل نمو البكتيريا. - في biohood عقيمة، الماصة قبالة مرق و resuspend الخلايا في 1 مل 1X العازلة في برنامج تلفزيوني. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها أو ما يقرب من شهرين.
- في يوم من المعالجة، يخفف من س. ثقافة marcescens من الخطوة 2.2.7 عن طريق إضافة 1 مل من S. الأصلي ثقافة marcescens إلى 39 مل 1X العازلة في برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
- إعداد مرق ولوحات لزراعة السراتية الذابلة.
- إعداد مساحة الغرفة الباردة لنواة معالجة ومعدات المحافظة
- قبل تقشعر لها الأبدان الغرفة الباردة، والجدران نظيفة، والأرضيات، وطاولة معدنية مع محلول التبييض 1٪.
- درجة الحرارة مجموعة من غرفة باردة إلى حوالي -11 درجة مئوية.
- مرة واحدة وصلت الى غرفة باردة إلى درجة الحرارة المطلوبة، وارتداء ملابس خفيفة واجب، قفازات النتريل، وأقنعة للحد من أي تلوث إلى الغرفة الباردة والعينات.
ملاحظة: يرجى ملء اثنين من أفراد يرتدون بشكل صحيح لهذا الإجراء. - جلب المواد المعقمة (على سبيل المثال، رقائق الألومنيوم، ورفوف معدنية، والأواني الزجاجية، علبة، S. ثقافة marcescens، وميلشفرة crotome) والعينات في غرفة باردة ومكان على الطاولة العقيمة.
- دائمة التجمد ومعالجة لب الجليد في منشأة الغرفة الباردة
- وضع نواة الجليد الدائم على، ورقة الحمض النووي معقمة خالية من رقائق الألومنيوم.
- تطعيم بخفة خارج النواة مع ثقافة مخفف من س. marcescens باستخدام رغوة المكونات معقمة (الشكل 2B).
- وضع الأساسية على رف معدني معقم ويجلس فوق الدرج.
- تعقيم شفرة الفولاذ مشراح مع 70٪ من الإيثانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
- هل لديك الفردية والنتريل قفازات نظيفة مع الايثانول 70٪، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث وعقد الأساسية في زاوية 45 درجة فوق الدرج.
- يكون الفرد ب كشط بلطف حوالي 5 ملم من خارج الأساسية بالكامل، بما في ذلك الغايات، باستخدام شفرة معقمة بينما الفرد ويتحول جوهر بعد كل كشط (
- يكون الفرد ب صب فلتر تعقيم 95٪ من الإيثانول على جوهر بعناية وبسرعة، في حين الفردية ويحول الأساسية كما هو سكب محلول (أرقام 2D، 3C).
- يكون الفرد ب شطف فورا الأساسية مع المياه فلتر تعقيم.
- استبدال رف معدني المستخدمة في علبة مع رف معدني معقم الجديد.
- يكون الفرد وتنظيف له أو لها قفازات النتريل مع 70٪ من الإيثانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث وعقد جوهر بزاوية 45 درجة فوق الدرج.
- يكون الفرد ب رش الأساسية كامل مع محلول الحمض النووي إزالة التلوث.
- يكون الفرد ب شطف فورا الأساسية مع المياه فلتر تعقيم.
- يكون الفرد ب رش الأساسية كامل مع ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
- هل لديك Individuآل B شطف فورا الأساسية مع المياه فلتر تعقيم.
- وضع الأساسية على ورقة معقمة من رقائق الألومنيوم والتفاف على محمل الجد.
- اللب الخارجي ذوبان
- وضع رف معدني معقم على طبق زجاجي معقم في biohood العقيمة مع تدفق الصفحي.
- وضع اثنين من لوحات أجار محددة لس. marcescens في طبق زجاجي تحت رف معقم لجمع السائل من جوهر (الشكل 2E).
- وضع الأساسية على رف معدني معقم.
- سمحت تقريبا 2-5 ملم من السطح الخارجي الأساسية لذوبان الجليد في 23 ° C (في المتوسط، وهذا سوف يحدث في حوالي 10 دقيقة). تحويل جوهر ما يقرب من 90 درجة في كل دقيقة 2.
- مسحة كامل سطح الأساسية باستخدام ملقط معقم وصوف زجاجي معقم وتطعيم اثنين من لوحات أجار الخاصة S. marcescens عن طريق المسح هذه المواد على سطح اللوحات. تطعيم اثنين من لوحات جديدة مع الثقافة الأصلية المستخدمة لمخدر خارجالأساسية، التي تعرضت لدرجات حرارة منخفضة من الغرفة الباردة.
- قياس الأبعاد الخارجية للالأساسية أسطواني إذابة عن طريق وضع حاكم عقيم القريب، ولكن لا لمس الأساسية.
- وضع الأساسية في كيس معقم كبيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- تحقق للنمو
- احتضان لوحات أجار في 23 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
- دراسة لوحات أجار لنمو س. المستعمرات marcescens.
- إذا لم تكن هناك مستعمرات واضحة على لوحة، انتقل إلى الخطوة 2.5.3.
- إذا المستعمرات تظهر على لوحة، كرر من الخطوة 2.1.1 في قسم 2 "الجليد المستديمة ومعالجة لب الجليد".
- الحصول على جوهر من الفريزر وجو معقم و مطهر نقلها إلى كيس معقم.
- تخزين الأساسية في كيس معقم عند 4 درجة مئوية لمدة حوالي 24-48 ساعة لذوبان الجليد جوهر بأكمله.
3. الحصول على عينة فرعية للحمض النووي استخراج من النوى الثلج والجليد المستديمة
- استخراج الحمض النووي من العينات الجليدية
- خلط المواد المذابة من صميم الجليد اثارة بلطف كيس (الشكل 2G).
- صب المواد المذابة في وعاء معقم مع مرشح 0.22 ميكرون في ظل فراغ لجمع الكائنات الحية الدقيقة.
- جو معقم و مطهر إزالة عامل التصفية مع ملقط معقم ووضعه في 2 مل أنبوب حبة السيراميك معقم (1.4 ملم).
- تخزين مرشح في -80 درجة مئوية.
- استخراج الحمض النووي من عينات التربة المتجمدة
- خلط المواد المذابة من صميم الجليد السرمدي من عجين بلطف الحقيبة.
- بعد التجمد وقد يمزج جيدا، للحصول على عينة فرعية من حوالي 0.5 جم تربة الجزء الأكبر مع سكوبولا معقمة ووضعه في العقيمة 2 مل أنبوب السيراميك حبة المسمار الحد الأقصى tared (1.4 ملم) أن يجلس منتصبا على التوازن.
- تخزين العينات الفرعية في -80 درجة مئوية.
- الحصول على المحتوى المائي الوزني من العينات.
- قياس 10 غرام من الجليد الدائم مع STERILالبريد سكوبولا ومكان في القصدير tared على التوازن. قياس كتلة رطبة من الجليد الدائم والقصدير.
- احتضان الجليد في فرن وضعت في درجة حرارة 105 مئوية لمدة 24 ساعة. قياس الكتلة الجافة الجليد والقصدير.
- حساب المحتوى المائي الجاذبية عن طريق طرح الكتلة الرطبة من التربة المتجمدة من قبل الكتلة الجافة من التجمد وقسمة كتلة جافة الجليد.
- متجر دائمة التجمد في -80 درجة مئوية.
4. استخراج الأحماض النووية من الجليد المستديمة والجليد النوى
- الإعداد المادي
- إعداد قارورة العنبر لعقد حلول عن طريق التعامل مع 0.1٪ diethylpyrocarbonate (DEPC)، احتضان O / N عند 37 درجة مئوية، والتعقيم.
- إعداد 240 ملي فوسفات البوتاسيوم حل العازلة. إضافة 2. 5 غرام من البوتاسيوم الفوسفات أحادي القاعدة و38،7 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم. ضبط الحجم النهائي إلى 500 مل بإضافة الماء المعقم.
- إعداد بروميد hexadecyltrimethylammonium (CTAB) استخراج BUFفر عن طريق إذابة 4.1 جم كلوريد الصوديوم في 80 مل من الماء وإضافة ببطء 10 ز CTAB أثناء تسخين واثارة. ضبط الحجم النهائي إلى 100 مل بإضافة الماء المعقم.
- إضافة وحدات متساوية من حل العازلة الفوسفات وCTAB العازلة وتصفية تعقيم مع فلتر 0.22 ميكرون. تغطية زجاجة مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في RT.
- تحضير 1.6 M محلول كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) من خلال الجمع بين 9.35 جم كلوريد الصوديوم و 100 مل ماء معقم. إضافة 10 غرام البولي ايثيلين جلايكول 8000 إلى 1.6 M كلوريد الصوديوم حل وتصفية تعقيم. تخزينها في 4 درجات مئوية.
- استخراج النووي حامض وفقا لنسخة معدلة من غريفيث وآخرون. 22 وتووي وآخرون. 23
- ارتداء سترات خفيفة واجب، قفازات النتريل، والأقنعة. مساحة المختبر نظيفة وpipets مع 70٪ من الإيثانول، محلول الحمض النووي لإزالة التلوث، وريبونوكلياز الحل إزالة التلوث.
- إزالة عينة فرعية (فلتر من قلب الجليد أو عينة التربة دائمة التجمد) في 2 مل حبة السيراميك المسمار كاليفورنياأنبوب ص من -80 درجة مئوية الفريزر وذوبان الجليد في RT.
- إضافة 0.5 مل من بروميد hexadecyltrimethylammonium (CTAB) استخراج العازلة ودوامة لفترة وجيزة.
- إضافة 0.5 مل من الكحول الفينول كلوروفورم-أيزو أميلي (25: 24: 1) (درجة الحموضة 8) ويهز أنابيب أفقيا لمدة 10 دقيقة باستخدام محول المسطحة على vortexer.
- وبعد حبة الضرب، وأنابيب الطرد المركزي في 16100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة الطبقة المائية لالعقيمة أنبوب 1.5 مل جديد وتخلط مع حجم مساو من الكحول الكلوروفورم-أيزو أميلي (24: 1). أجهزة الطرد المركزي في 16100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة الطبقة المائية لالعقيمة أنبوب 1.5 مل جديد وإضافة مجلدين من 30٪ البولي ايثيلين جلايكول 8000 و 1.6 M كلوريد الصوديوم. احتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي في 16100 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- غسل بيليه الحمض النووي مع ما يقرب من 500 ميكرولتر من الجليد الباردة الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 16100 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- الهواء الجاف بيليه في biohood عقيمة لمدة 2 ساعة. resuspend في 50 ميكرولتر الدناز العازلة TE / ريبونوكلياز خالية (8.0 درجة الحموضة). الحمض النووي هو على استعداد لتقديم الطلبات المصب مثل PCR وQPCR.
- تحديد تركيز الحمض النووي مع معمل.
- تخفيف الحمض النووي مع الماء المعقم، وخالية من الحمض النووي لتحقيق 20 نانوغرام في رد الفعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن استخدام طريقة عرض لتطهير العينات المجمدة التي تم جمعها من مختلف البيئات الغلاف الجليدي، من الجليد الجليدية في الجليد السرمدي. هنا، نقدم البيانات التي تم جمعها خصيصا من عينات الجليد والتربة المتجمدة التي تم جمعها من بحوث الهندسة البحوث والتنمية - المناطق الباردة البحوث ومختبر الهندسة (ERDC-CRREL) الجليد المستديمة نفق يقع في فوكس، حزب العدالة والتنمية (الشكل 1A و 1B). على الجليد المستديمة نفق يمتد نحو 110 متر إلى جانب وادي Goldstream ويوفر الوصول إلى الجليد الطمي الغني والطمي 30-31. عينات من إسفين الجليد والتربة المتجمدة جمعت بعناية في ثلاث نسخ من جدران النفق في 24 تشرين الأول 2014. وفي الوقت أخذ العينات، وكانت درجة الحرارة من جدار الجليد السرمدي -2.9 درجة مئوية. تم جمع عينات من ميزة إسفين الجليد حوالي 27 متر من بوابة النفق، والتربة المتجمدة في 35 م و 60 م منالبوابة النفق (الشكل 1C و1D). واتخذت رعاية خاصة أثناء جمع العينات للحد من تلوث العينات الجليدية والجليد الدائم (الشكل 1E). تم التعامل مع النوى المجمدة وفقا لدينا بروتوكول تطهير (الشكل 2)، ونقل على الثلج الجاف إلى CRREL ميكروبيولوجيا التربة مختبر في هانوفر، NH للمعالجة.
تم تجهيز جميع النوى باستخدام بروتوكول وصفها في القسم 2 باستخدام شفرات العقيمة مشراح والحلول (الشكل 3A، B، و C). وكان الهدف من هذه الدراسة لاستخراج بنجاح الأحماض النووية الذاتية من العينات المجمدة لتحديد المجتمعات الميكروبية الحالية في الوقت الذي تم فيه إيداع المواد. وجرى تقييم بروتوكول إزالة التلوث عن طريق المنشطات النوى مع ثقافة مخفف من السراتية الذابلة ثم فحص لوحات بيتري للالخلف النمووعولج إيه النوى 31. غياب س. وأشارت المستعمرات marcescens أن الكائنات الحية الدقيقة خارجية أزيلت بشكل صحيح من الجزء الخارجي من جوهر. ومع ذلك، فإن عدم وجود المستعمرات لا تشير إلى ما إذا تمت إزالة الحمض النووي الخارجية من الجزء الخارجي من جوهر. ولذلك، فإننا التسلسل عينات من لب الجليد للتحقق من الحمض النووي من السراتية ليرة سورية. لأن كانت وفرة الميكروبية في إسفين الجليد على الأرجح أقل بكثير مما كانت عليه في التربة المتجمدة، كنا العينات الجليدية لتحديد ما إذا كان الحمض النووي من س. سوف marcescens تكون موجودة بعد بروتوكول إزالة التلوث. إذا لم تكن تطهير النوى بشكل صحيح، ثم تسلسل المتعلقة س. ومن المتوقع marcescens أن يكون حاضرا في العينات. ويبين الشكل (4) والتنوع البكتيري منخفض داخل نواة الجليد من 16S الريباسي نتائج التسلسل الجيني. تسلسل تتصل الزائفة س.، من الأسرة في اللغات Gammaproteobacteria، سيطرت على sampl الدراسي الجليدوفاق. وكان أعضاء المتعلقة Planctomycetia الحاضر في الجليد، ولكن بدرجة أقل أيضا. من الجدير بالذكر هو غياب السراتية س. في نتائج التسلسل، مما يشير إلى أن البروتوكول التطهير إزالة بما فيه الكفاية الحمض النووي الخارجية.
وعلاوة على ذلك، هناك مخاطر إضافية من التلوث أثناء استخراج الأحماض النووية. استخدمت الفراغات استخراج السلبية للكشف عن التلوث من الأحماض النووية خارجية. تم تضخيم الحمض النووي من العينات والضوابط السلبية باستخدام QPCR. وأظهرت البيانات QPCR أن السرمدي تؤوي البكتيريا، ولكن أنه لم يتم اكتشافها العتيقة في التجمد (الجدول 1). إزالة التلوث ناجحة ومما يدل على مزيد من عدم وجود amplicons البكتيرية أو archaeal في الفراغات الاستخراج، بالتزامن مع التضخيم الإيجابي للضوابط، الزائفة المتألقة وملحاء عصوية ملحية (الجدول 1). وabundكشفت قياسات تعصب أنه لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في وفرة البكتيرية بين النوى التي تم جمعها في 35 متر من البوابة بالمقارنة مع 60 م النوى (الجدول 1). وتجرى البحوث الجارية لتحديد ما إذا كان تكوين المجتمع الميكروبي مختلفة بين النوى.
الشكل 1. المواقع عينة قرب فيربانكس، حزب العدالة والتنمية. (A) خريطة فيربانكس، حزب العدالة والتنمية (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html)، (ب) ERDC-CRREL الجليد المستديمة نفق، (ج) جمع النوى الجليد الدائم باستخدام اوجير SIPRE، (D) نظرا لاوجير دخول دائمة التجمد الجدار، و (E) إعداد الأساسية للأرشفة. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الاصدارسيون من هذا الرقم.
تتم معالجة الشكل 2. رسم تخطيطي للتطهير المواد المجمدة. (A) المواد المجمدة (على سبيل المثال، لب الجليد أو الأساسية السرمدي) في غرفة باردة. (ب) ملوثة هادف ومع ثقافة البكتيرية. وحلق (C) جوهر بشفرة معقمة مشراح لإزالة مم الجزء الخارجي 5. وتطبق (D) سلسلة من الحلول لزيادة تطهير الجزء الخارجي من العينة. DDS يشير محلول الحمض النووي لإزالة التلوث وRDS يشير ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث. (E) عن طريق وضع الأساسية في biohood عقيمة الذي عقد في RT، والخارجي 2-5 ملم من المواد يذوب. يتم جمع السائل الذي يقطر من الثلج أو الجليد في لوحات بيتري وممسوح الأساسية ومطلي للتأكد من أن تم تطهير الأساسية بشكل صحيح. (F و G) إذا لم يتم الكشف عن نمو البكتيريا، ثم يتم إذابة قلب في 4 درجات مئوية في حاوية معقمة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. إزالة التلوث من النوى الجليد في غرفة باردة تحت ظروف معقمة. (A) إزالة الطبقة الخارجية من صميم الجليد الدائم مع شفرة مشراح المعادن عن طريق كشط. (ب) وجهة نظر أقرب من كشط. (C) الحل شطف لتطهير الطبقة الخارجية من جوهر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. تسلسل الميكروبية من العينات إسفين الجليد. شريط بيانيا يوضح متوسط الوفرة النسبية للمن الكائنات الحية البكتيريا الموجودة في العينات إسفين الجليد مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. وفرة البكتيرية في التربة المتجمدة. النتائج QPCR يظهر وفرة من البكتيريا في عينات التربة المتجمدة وما يرتبط بها من الفراغات الاستخراج. وذكرت الأرقام الواردة في الجدول كما يعني ± الخطأ المعياري. ن هو عدد العينات. ND يشير إلى عدم الكشف عنها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر الغلاف الجليدي الوصول إلى الكائنات الحفاظ عليها التي لا تزال قائمة في ظل ظروف بيئية الماضية. على الرغم من أن الأصناف تعافى قد لا تمثل المجتمع التاريخي الكامل، وتلك المستخرجة من تحليل عينات الجليد والتربة المتجمدة الجليدية يمكن أن تسفر عن معلومات تاريخية قيمة عن تحديد الفترات الزمنية 15-16. على سبيل المثال، فقد تم استخلاص المعلومات البيولوجية ذات مغزى من الدراسات الجليد التحقيق النشاط اللاهوائي في الغطاء الجليدي في غرينلاند 20 و الدراسات دائمة التجمد التحقيق العمليات الدراجات الكربون نتيجة لذوبان الجليد 33 وقدمت نظرة ثاقبة التنوع الفطري من الجليد في بيرنجيا 16. يجب أن يحدث جمع العينات المناسبة وإزالة التلوث قبل إجراء المصب تحليلات للتحقيق في المجتمعات البيولوجية في هذه المواد المجمدة. على الرغم من هذه الخطوات لها آثار كبيرة على تفسير البيانات، العديد من الدراسات لا تقدم تفاصيل محددة بشأن كيفية العينات ثيحرث جمعها ومعالجتها أو صور تظهر كيفية التعامل مع المواد المجمدة. على سبيل المثال، قد مخدر الدراسات السابقة في الجزء الخارجي من النوى مع المجهرية الفلورسنت أو البكتيريا المعروفة 15، على الرغم من عدم وصفها تركيزات الدقيقة لهذه المواد. وقد وصفت دراسات أخرى بروتوكولات إزالة التلوث في التفاصيل، ولكن لم تطبق إنتاجية عالية تحليلات لاختبار فعالية منهجية 15، 32. لذلك، تم استخدام فحص مفصل من البكتيريا سليمة والحمض النووي الخارجية من خلال نمو على لوحات بيتري وQPCR لتحديد ما إذا كان كان جمع العينات، والحفظ، والإجراءات التحليلية العقيمة بما فيه الكفاية لتحديد المجتمعات الميكروبية الموجودة في المواد المجمدة.
تم تعديل هذا البروتوكول لبنجاح عزل المادة الوراثية من الاهتمام من النوى القديمة. رعاية مثل ارتداء معدات محددة وتطهير إمدادات يجب أن تؤخذ خلال جمع ومعالجة واستخراجيمكن أن تحدث أيون من النوى منذ تلوث في أي خطوة. وعلاوة على ذلك، والشحن النوى مع الثلج الجاف أو وكيل التبريد مقارنة لا بد أنه إذا ذوبان الجليد النوى أثناء العبور، ثم هناك أكثر ميلا إلى أن الملوثات من المنطقة الخارجية للقلب قد تهاجر إلى الجزء الداخلي من جوهر. لمزيد من تقليل احتمال تلوث، أن تنظر في جمع النوى أكبر مع اوجير الآلية بدلا من نواة دفع. وجدنا أن النوى دفعة صغيرة للغاية لتطهير صحيح في الخطوة كشط. بدلا من ذلك، يمكن استخراج حجم أكبر من عينة من النوى أكبر، وهو أمر مهم خاصة بالنسبة للعينات مع وفرة منخفضة من المواد البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، فإن حجم أكبر يتيح مجالا أوسع للخطأ بحيث إذا تم الكشف عن السراتية الذابلة المستعمرات على لوحات، ثم قلب كبير بما فيه الكفاية لتتم معالجتها مرة أخرى.
تم اختبار الإمدادات المختلفة لتحديد الأكثر كفاءةطريقة لتطهير النوى. على سبيل المثال، معقم رقائق الألومنيوم، بدلا من أطباق الزجاج أو البلاستيك، سمح للقلب لتوضع على سطح عقيمة بسرعة وسهولة. أيضا، أثبتت الإمدادات غير التقليدية مثل رف معدني وصينية أن يكون مفيدا للسماح للمواد الخارجية كشط تتراكم بعيدا عن القلب، ويقلل من خطر تلويث إعادة النوى. في التكرار السابقة من البروتوكول، حدث تجريف على سطح مستو، والتي زادت من مخاطر التلوث. وأخيرا، أكياس معقمة، بدلا من أطباق الزجاج وجدت، أن تفضي إلى خلط وتخزين العينات.
استهدف هذا البروتوكول للقضاء على الكائنات الحية الدقيقة والأحماض النووية على الجزء الخارجي من النوى المجمدة. في حين الأيسوبروبانول والايثانول والمطهرات الفعالة، فإنها لا إزالة الأحماض النووية. لذلك، تم استخدام الحلول التي تعمل على إزالة الأحماض النووية والأنزيمات المرتبطة من الجزء الخارجي من النوى. هذه المحاليلوتستخدم عادة ستعقد لإزالة الأحماض النووية وnucleases المرتبطة من الإمدادات والمعدات المختبرية. عند اختبار فعاليتها على أسطح المختبرات، وإزالة حل RNA تطهير المزيد من المواد الخارجية من الحمض النووي تطهير حل 34. باستخدام nucleases لتطهير الجزء الخارجي من جوهر قد لا يكون دائما هو الأسلوب المفضل لأن المواد الوراثية من الفائدة يمكن أيضا إزالة من العينات مع وفرة منخفضة لكائن معين. على وجه الخصوص، المواد الوراثية المخزونة في التربة المتجمدة والجليد لفترات طويلة من الوقت الخسف. لأن الكائنات الدقيقة في وفرة عالية في هذه العينات في ألاسكا، وتقلص إلى حد كبير القلق من أن الحلول من شأنه أن يزيل نسبة عالية من المواد الجينية الذاتية. ومع ذلك، ينبغي اتخاذ الحذر عند استخدام الحلول التي تحتوي على nucleases للتأكد من أن الأحماض النووية التي كانت متدهورة بشدة أو هي من الكائنات الحية في وفرة منخفضة لا تحذف من قبلوnucleases.
غياب س. قدمت المستعمرات marcescens على لوحات بيتري الثقة بأن خلايا سليمة وإزالتها من الجزء الخارجي من النوى الجليد الدائم. وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل العينات الجليدية التي خضعت لنفس البروتوكول لا تسلسل اكتشافها المتعلقة س. marcescens. وكشفت النتائج تسلسل التي تم الكشف عنها فقط الزائفة في هذه العينات، حتى على الرغم من كل س الزائفة. والسراتية ليرة سورية. ضمن الطبقة Gammaproteobacteria. معا، وغياب س. وتشير المستعمرات marcescens على لوحات بيتري وعدم وجود amplicons الحمض النووي من QPCR أن النوى المجمدة تم تطهير بنجاح. ولذلك، فإن الكائنات الحية الدقيقة الكشف عن والأرجح جزءا لا يتجزأ من المواد المجمدة، بدلا من التلوث الناجم عن الحفر أو معالجة النوى. وتشمل تقنيات الحفر الأخرى الحفر الهيدروليكي لاختراق التربة أو الجليد في أعماق أكبر. رغم أن هذا الأسلوب عواد يكون مفيدا للتحقيق وفرة منخفضة الميكروبية في هذه البيئات قليل التغذية، فإنه لا يكشف ما إذا كانت سوائل الحفر سيتم إزالة بنجاح. وعلاوة على ذلك، إذا عالية التسلسل الإنتاجية ليست جزءا من التحليل المصب، وردود الفعل PCR محددة تستهدف س. وينبغي أن تستخدم marcescens لتضخيم الحمض النووي المستخرج.
أظهرت النتائج من مثالنا مجموعة البيانات التي الحمض النووي الجيني سليمة تم استخراج بنجاح من المواد المجمدة. وعلاوة على ذلك، فإن كلا من التربة المتجمدة والثلج إسفين آوى البكتيريا، كما يتضح من QPCR وتسلسلها، على التوالي. التجمد متقطعة في ألاسكا من هذه الدراسة على أرقام البكتيرية مماثلة الجليد في المنطقة القطبية العالية الكندي 35، على الرغم من أن عينات ألاسكا احتوت على أمر من حجم أقل البكتيريا من الجليد الدائم من هضبة التبت في مقاطعة تشينغهاي، الصين 36 ونشطة التربة طبقة / السرمدي من نونافوت، كندا 37. تشبه إلى طإسفين م جمعها في نونافوت، كندا 37، تسلسل المتعلقة Gammaproteobacteria، وتحديدا الزائفة، التي هي مشتركة بين التربة ومتنوعة عملية الأيض، وهيمنت إسفين الجليد في ألاسكا في هذه الدراسة. في الواقع، كاتاياما وآخرون. 11 البكتيريا المعزولة داخل من الكائنات الحية شعاويات، العصيات، وGammaproteobacteria من واحدة من أسافين الجليد من ERDC-CRREL الجليد المستديمة نفق. هذه الدراسات تثبت ما كشف عن Gammaproteobacteria في هذه الدراسة. تم الكشف عن Planctomycetia، التي هي مشتركة بين عينة المائية، وأيضا في إسفين الجليد. تم العثور على هذه الكائنات الحية في التربة الطبقة النشطة فوق الجليد في شمال شرق سيبيريا 38، بالإضافة إلى الجليد في هضبة التبت فى تشينغهاى، والصين 39.
وقد حقق العديد من الدراسات وجود العتيقة، لا سيما methanogens، في السرمدي، مع فكرة أن كما يذوب الجليد الدائم، وmethanogens المرجح أن تصبح أكثر نشاطا، contributing إلى هروب رأس المال من غاز الميثان في الغلاف الجوي 21، 33-34. والمثير للدهشة، لم يتم اكتشاف العتيقة في إسفين الثلج أو الجليد السرمدي عينات ألاسكا حتى ولو تم العثور على حد سواء عتائق عريضة وعتائق مصدرية في التربة المتجمدة من ارتفاع 17 في القطب الشمالي الكندي وعثر على methanogens في عينات الجليد السرمدي من التندرا في القطب الشمالي في روسيا 21.
المواد المجمدة تؤوي الكائنات الحية الدقيقة القديمة، وتوفير سجل من العمليات البيولوجية الكيميائية التي وقعت عدة آلاف من السنين. هذا التنوع البيولوجي هو من مصلحة كبيرة في ظل النظام الاحترار المناخي الحالي بسبب الكائنات الحية الدقيقة التي كانت ممنوعة مرة واحدة في بيئة الغلاف الجليدي قد تصبح المحررة عند ذوبان الجليد المواد المجمدة. من أجل تحديد بثقة التنوع البيولوجي آوى في هذه المواد المجمدة، والتربة المجمدة وعينات الجليد يجب التعامل معها بشكل صحيح وتطهير. هنا، نقدم بروتوكول لإزالة الخلايا الغريبة والحمض النووي من العينات المجمدة لensuإعادة بأن الكائنات الحية الدقيقة الكشف كانت من المواد، بدلا من التلوث الناجم عن الحفر أو معالجة النوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
- Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
