Summary
Криосфера предлагает доступ к сохранившимся организмов, которые сохранялись при прошлых условиях окружающей среды. Протокол представлен для сбора и обеззаразить вечной мерзлоты ядер почв и льда. Отсутствие экзогенного колоний и ДНК предполагают, что микроорганизмы, обнаруженные представляют Интернете, а не загрязнение от сверления или обработки.
Introduction
Криосферы (например, вечномерзлых грунтов, особенности льда, ледниковые снег, фирна и льда) предлагает заглянуть в какие типы организмов сохранялась при прошлых условиях окружающей среды. Так как эти подложки могут быть от десятков до сотен тысяч лет, их микробных сообществ, при сохранившейся заморожены с осаждения, отражают древние условия окружающей среды. Для того, чтобы надлежащим образом проанализировать эти экосистемы и извлечь полезную биологическую информацию из замороженного состояния почв и льда, правильного сбора и обработки замороженных образцов необходимо. Это имеет огромное значение , так как климатические прогнозы для 21 - го века указывают на потенциал выраженного потепления в Арктике и субарктических регионах 1. В частности, интерьер Аляски и Гренландии , как ожидается , чтобы нагреть приблизительно 5 ° C и 7 ° C, соответственно к 2100 году 2,3. Ожидается, что значительное влияние на почву и водные микробные сообщества, и, следовательно, связанной сбиогеохимические процессы. Более теплые температуры и измененное режим осадков , как ожидается , инициировать деградацию вечной мерзлоты во многих областях 2-5 потенциально может привести к более толстой, сезонноталого (активный) слой 6,7, оттаивание мерзлых грунтов, а таяние массивных ледяных тел , таких как льды, ледяные клинья, и сегрегации льда 8. Это позволит резко изменить биогеохимические атрибуты в дополнение к биоразнообразию растений и животных в этих экосистемах.
Ледниковых и сингенетические мерзлота осадка и льда особенности заманили в ловушку химических и биологических доказательств окружающей среды, представляющей то, что жил там в то время формировались особенности. Например, в интерьере Аляске, как Illinoisan и Висконсин в возрасте вечной мерзлоты присутствуют и это вечной мерзлоты, в частности, предоставляет уникальные места начиная от современных до 150000 лет до настоящего времени (YBP), которые содержат биологические и геохимические доказательства ИТПМкт прошлых климатических изменений на биоразнообразие. В результате, эти отложения обеспечивают запись биогеохимии и биоразнообразия в течение многих тысяч лет. Так как область имеет низкие цены отстаивание и никогда не таянии, нетронутые образцы доступны для сбора и анализа, либо сверлить вертикально в почвенном профиле или бурение горизонтально в туннелях. Что еще более важно, обширные записи существуют , которые особенно подчеркивают уникальные биогеохимические особенности вечной мерзлоты в этом регионе 9-14. В частности, применение ДНК-анализа для оценки наличия и степени биоразнообразия в обоих дошедших до наших дней и древних льдов и вечной мерзлоты образцов позволяет исследование взаимосвязи древних условий окружающей среды и среды обитания для оккупации конкретных организмов.
Предыдущие исследования выявили климатические воздействия на млекопитающих, растений и микроорганизмов из образцов , относящихся к 50k YBP 11, 15-19 лет, хотя каждое исследование использовали differeМетодология нт для сбора и обеззараживать вечной мерзлоты или ледяных кернов. В некоторых случаях, сердечники бурения стерилизовали 16, 20-21, хотя конкретная методология не уточнить , были ли чужеродной нуклеиновой кислоты также исключены из образцов. В других исследованиях, бактериальные изоляты 15 (например, Serratia marcescens), а также флуоресцентные микросферы 22 были использованы для измерения эффективности процедур дезактивации.
Этот эксперимент был частью более крупного исследования следственным микробных сообществ из образцов вечной мерзлоты, начиная с приблизительно 40k YBP. Конкретная цель этой части исследования состояла в том, чтобы успешно обеззараживать льда и вечной мерзлоты ядер. Насколько нам известно, ни одна методика не интегрировал использование растворов, предназначенных для устранения иностранных нуклеиновых кислот и связанных с ними нуклеазы из внешней части замороженных ядер. И это несмотря на то, что эти решения являются commonlу используется для обеззараживания лабораторного оборудования для молекулярных экспериментов.
После того, как сердечники были дезактивированы, геномную ДНК экстрагировали с использованием протоколов , разработанных Гриффитс и др. , 23 и Towe и др. 24, количественно с помощью спектрофотометра, и разбавляют стерильной, ДНК , свободной от воды , чтобы достичь 20 нг в реакции. Бактериальные гены 16S рРНК амплифицировали с праймерами 331F и 797R и зонд BacTaq 25 и архей генов 16S рРНК амплифицировали с использованием праймеров Arch 349F и Arch 806R и зонд ТМ Arch 516F 26 при следующих условиях: 95 ° С в течение 600 с последующим 45 циклов 95 ° C в течение 30 сек, 57 ° с в течение 60 сек и при 72 ° C в течение 25 сек с конечным удлинением при 40 ° с в течение 30 сек. Все реакции КПЦР проводились в двух экземплярах. В 20 мкл объемы реакции включали 20 нг ДНК, 10 мкМ праймеров, 5 мкМ зонда и 10 мкл реакционной смеси КПЦР. Стандарты FOг бактериальных и архейного КПЦР были приготовлены с использованием геномной ДНК из Pseudomonas Шогезсепз и Halobacterium Салинарум соответственно. Оба были выращены до логарифмической фазы. отсчеты Пластинчатые были проведены и ДНК выделяли из культур. Геномную ДНК количественно с помощью спектрофотометра с предположением одного и шести копий гена 16S рРНК на геном для Н. Салинарум и P. Шогезсепз соответственно 27-28. были вычислены числа копий бактериальных и архей генов на основе стандартной кривой, логарифмирована для учета неравных отклонений между курсами лечения, и оценены ANOVA.
Состав сообществ определяли путем секвенирования гена 16S рРНК с использованием клеток потока и технологии усиления моста и анализа сообществ с "количественным проникновения в микробной экологии» (QIIME) 29. Вперед и обратного чтения были соединены вместе, а затем последовательности были отфильтрованы, индексированные,а также представители высокого качества были отобраны для De Novo операционные таксономические единицы (ОТУ) назначение через выравнивания последовательностей с эталонной базой данных. Выровненных последовательностей сравнивали с отдельной справочной базы данных для таксономического назначения. Таблица ОТУ уровень филюм был создан для определения общего состава сообщества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка оборудования и мерзлотоведения Основные коллекции
- Оборудование для подготовки и отбора проб на местах и сохранение передач
- Собрать бур для взятия пробы, вставив адаптер диска в верхней части ствола и поворачивая рычаг, чтобы зафиксировать его на месте. Pin адаптер трубку на адаптер привода и пин-код двигателя на адаптер трубки. Вставьте резцы на бочке.
- Носите легкие костюмы долг, нитриловые перчатки и маски, чтобы уменьшить любое загрязнение к образцам. Пользуйтесь средствами защиты слуха и каски для безопасности при входе в туннель мерзлотоведения (Рисунок 1).
- Введите туннель и выберите место для сбора образцов (рис 1В).
Примечание: Для вертикального или горизонтального расположения бурения, выберите область , где , как известно , доказательства того, что материал в замороженном состоянии (например, лед или вечной мерзлоты), нет известных крупных корневых систем, и нет никакого известного гравия. Убрать всеживой растительный материал из области перед сбором пробы. При бурении по вертикали или горизонтали, выберите область, которая является относительно плоской и доступной с шнеком. - Подготовьте рабочую станцию отводками землю с пластмассовым материалом, который был стерилизован с 70% изопропанола, ДНК деконтаминации раствора и обеззараживающим раствором РНКазы.
- Поместите 10 см диаметр поливинилхлорид (ПВХ), резать трубу вдоль пополам на рабочей станции, чтобы обеспечить желоб для хранения стержней, как они будут удалены из бура. Дезактивацию трубы ПВХ с 70% изопропилового спирта, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
- Рядом с рабочей станции, обеззараживают шнек путем распыления его с 70% изопропанола, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы. Удалить из решения шнек с вытирания.
- коллекция кернов льда и вечной мерзлоты и хранение
- Выберите область стены к образцу (см 1.2.1Заметка).
- Обеззараживайте примерно 10 см в диаметре замороженной области стенки, протерев его 70% изопропанола, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
- Поднимают Очищенное шнек на интересующей области таким образом, чтобы она была перпендикулярна к площади образца и начать бурение на очищаемой поверхности стенки (рис 1C, D).
- Осторожно снимите шнек из области отбора проб. Отсоедините шнек от двигателя и поместите шнек над стерильной ПВХ трубы в чистой рабочей станции. Осторожно наклоните шнек таким образом, чтобы замороженные ядра выскользнуть на стерильном трубы из ПВХ (рис 1E).
- Обеззараживайте перчатки с 70% изопропанола, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
- Возьмите льда и вечной мерзлоты ядер с стерильных перчатках и поместить их в стерильные пакеты.
- Поместите ядер в более прохладном или холодном помещении, пока они не будут отправлены или обработаны.
- Ш.И.П. замороженных ядер с использованием сухого льда, чтобы поддерживать их при температуре ниже 0 ° C.
- Сразу хранить сердечников при -80 ° С.
2. мерзлота и ядро обработки льда
- Подготовка материала
- Приготовьте стерильную нуклеиновой кислоты свободный сверхмощный алюминиевой фольги, металлические стеллажи, изделия из стекла, металла, пинцет и стекловату путем обжига в печи при температуре 450 ° С в течение 4 ч. Отложите эти материалы пока не используется.
- Стерилизуют 95% этанола и сверхчистой воды, пропусканием раствора через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
- раствор этанола Хранить при -20 ° C и воды при 4 ° С.
- Стерилизовать пластиковая линейка путем распыления его с 70% -ным этанолом, ДНК деконтаминации раствора и РНКазы обеззараживание раствором и сразу же после того, как протирки каждого раствора.
- Бактериальная культура Подготовка
- Приготовьте бульон и пластины для роста Serratia marcescens.
- Для бульона, смешайте 5 г попробоватьptone, 1 г глюкозы, 5 г дрожжевого экстракта и 1 г двухосновного фосфата калия, а затем добавить дистиллированную воду, чтобы достигнуть 1 L. Для того, чтобы плиты, добавить 15 г агар вышеуказанной смеси. Для бульона и пластин, довести рН до 7 и автоклаве при температуре 121 ° С в течение 15 мин.
- Приготовьте 1х фосфатный отшлифованной физиологический раствор (PBS) путем объединения 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 1,44 г двухосновного фосфата натрия и 0,24 г одноосновного фосфата калия и добавить дистиллированную воду, чтобы достигнуть 800 мл. Регулировка рН до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до достижения 1 л автоклаве при температуре 121 ° С в течение 15 мин.
- Инокулируйте бульон стерильной петлей путем погружения в S. marcescens культура , которая была ранее хранили замороженными при -80 ° С. В асептических условиях, серийный разбавленный культуру путем добавления 1 мл культуры в 9 мл PBS и вручную инвертировать решение. Добавить 1 мл этого раствора до 9 мл PBS и вручную инвертировать решение. Повторите еще восемь раз до 10 -9 diluние достигается.
- Разведите 10 -6, 10 -7, 10 -8 и 10 -9 решений на чашках с агаром, распределяя по 1 мл бульона на тарелку и распространения с сотовым распределителю. Делайте это в трех экземплярах на разведение. Хранить исходную культуру при температуре 4 ° С.
- Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение 24 ч. Подсчитайте число колоний, чтобы подсчитать число клеток в исходной культуре. Примечание: Число колоний в исходной культуре, будет зависеть от скорости роста бактерий.
- Пипеткой 250 мкл исходной культуры в стерильный 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Развести оригинальную культуру, добавив достаточное количество объема 1x PBS , чтобы получить приблизительно 10 9 клеток / мл , как определено по количеству колоний в предыдущем шаге. Гранул клеток в микроцентрифужных трубки центрифугированием при 2500 х г в течение 10 мин.
Примечание: Объем 1x PBS будет варьироваться в зависимости от скорости роста бактерий. - В стерильную biohood, Пипеткой от бульона и ресуспендирования клеток в 1 мл буфера PBS 1x. Хранить при температуре 4 ° С до использования или примерно двух месяцев.
- В день обработки, разбавить S. marcescens культуры с этапа 2.2.7 путем добавления 1 мл исходной S. marcescens культуры до 39 мл PBS буфера 1х в центрифужную пробирку на 50 мл.
- Приготовьте бульон и пластины для роста Serratia marcescens.
- Подготовьте холодной комнате пространство для обработки и сохранения основного снаряжения
- Перед охлаждая холодной комнаты, чистые стены, полы, и металлический стол с 1% -ным раствором хлорной извести.
- Заданное значение температуры холодильной камеры до приблизительно -11 ° С.
- После того, как холодная комната достигла желаемой температуры, носить светлые костюмы дежурстве, нитриловые перчатки и маски, чтобы уменьшить любые загрязнения в холодной комнате и образцов.
Примечание: Два правильно одетые лица, необходимые для этой процедуры. - Принесите стерильных материалов (например, алюминиевая фольга, металлические стеллажи, изделия из стекла, поднос, S. marcescens культуры и миcrotome лезвие) и образцы в холодной комнате и место на стерильном столе.
- Мерзлота и обработки кернов льда в холодном помещении объекта
- Поместите ядро мерзлоты на стерильном нуклеиновой кислоты свободного листа алюминиевой фольги.
- Слегка инокуляции вне ядра с разбавленной культуры S. marcescens с помощью стерильной пены пробку (рис 2B).
- Поместите ядро на стерильную металлическую стойку, которая находится над лотком.
- Стерилизовать стали микротома лезвие с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
- Имеют индивидуальные чистый нитриловые перчатки с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы и удерживать ядро на 45 ° над тарелкой.
- Имеют индивидуальные Б аккуратно соскрести примерно 5 мм от внешней стороны всей сердцевины, в том числе на концах, с помощью стерильного лезвия в то время как Физическое лицо поворачивается ядро после каждого соскоба (
- Имеют индивидуальные Б вылить стерилизовали с помощью фильтра 95% этанола на сердечник тщательно и быстро, в то время как Физическое лицо поворачивает сердечник как раствор вливают (цифры 2D, 3С).
- Имеют индивидуальные B немедленно промойте сердцевину с стерилизованным фильтрацией воды.
- Заменить использовали металлические стойки на лотке с новой стерильной металлической стойке.
- Иметь Физическое лицо очистить свои нитриловые перчатки с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы и удерживать ядро на 45 ° над тарелкой.
- Имеют индивидуальные B распылить всю сердцевину с ДНК обеззараживание раствором.
- Имеют индивидуальные B немедленно промойте сердцевину с стерилизованным фильтрацией воды.
- Имеют индивидуальные B распылить весь сердечник с обеззараживающим раствором РНКазы.
- Есть индивидуаль B немедленно промойте сердцевину с стерилизованным фильтрацией воды.
- Поместите сердечник на стерильный лист алюминиевой фольги и слегка завернуть.
- Оттепель внешнее ядро
- Поместите стерильную металлическую стойку над стерильную стеклянную посуду в стерильном biohood с ламинарным потоком.
- Поместите два агаром , специфичные для S. marcescens в стеклянную посуду ниже стерильной стойки для сбора жидкости из ядра (рис 2E).
- Поместите ядро на стерильной металлической стойке.
- Разрешить примерно 2-5 мм от внешней поверхности сердечника оттаивают при 23 ° C (в среднем, это будет происходить в течение примерно 10 мин). Поверните ядро примерно на 90 ° через каждые 2 мин.
- Тампон всю поверхность сердечника с использованием стерильного пинцета и стерильную стекловату и прививают два агаром специфичные для S. marcescens моечные этих материалов на поверхность пластин. Инокулируйте две новые пластинки с оригинальной культурой используется для легирования с внешней поверхностиядро, которое подвергали воздействию низких температур холодной комнате.
- Измерьте наружные размеры талой цилиндрического сердечника путем размещения стерильный линейки рядом, но не касаясь ядра.
- Поместите сердечник в большой стерильный пакет и хранить его при температуре -80 ° С.
- Проверьте для роста
- Выдержите агаром при 23 ° С в течение одной недели.
- Изучение агаром для роста S. marcescens колонии.
- Если нет видимых колоний на пластине, перейдите к шагу 2.5.3.
- Если колонии появляются на тарелку, повторите процедуру с шага 2.1.1 в разделе 2 "мерзлота и обработки кернов льда".
- Получить ядро от морозильной камеры и асептически перенести его в стерильный пакет.
- Хранить ядро в стерильном пакете при температуре 4 ° С в течение приблизительно 24-48 ч, чтобы растопить весь сердечник.
3. Получение подвыборки для Нуклеиновой Кислоты экстракции из кернов льда и вечной мерзлоты
- выделения нуклеиновых кислот из кернов льда
- Смешайте талой материал из керна льда, осторожно перемешивая мешок (рис 2G).
- Налейте размороженного материал в стерильный контейнер с фильтром 0,22 мкм в вакууме для сбора микроорганизмов.
- Консерванта удалить фильтр стерильным пинцетом и поместить его в стерильный 2 мл керамический шарик трубки (1,4 мм).
- Хранить фильтр при -80 ° С.
- выделения нуклеиновых кислот из вечной мерзлоты ядер
- Смешайте талой материал из сердцевины вечной мерзлоты, аккуратно замешивать сумку.
- После того, как вечная мерзлота была хорошо перемешана, получить подвыборки приблизительно 0,5 г сыпучего грунта со стерильным Кулинарная лопатка и поместить его в взвешенную стерильные 2 мл керамический шарик с завинчивающейся крышкой трубки (1,4 мм), который находится в вертикальном положении на балансе.
- Хранить подвыборки при -80 ° С.
- Получить гравиметрический содержание воды образцов.
- Мера 10 г вечной мерзлоты с Sterilе Кулинарная лопатка и место в тарированный олова на весах. Измерьте влажную массу вечной мерзлоты и олова.
- Выдержите вечной мерзлоты в печи при температуре 105 ° С в течение 24 ч. Мера сухой массы вечной мерзлоты и олова.
- Рассчитывают гравиметрический содержание воды путем вычитания Влажную массу мерзлоты по сухой массе вечной мерзлоты и деления на сухую массу вечной мерзлоты.
- Хранить мерзлота при -80 ° С.
4. Извлечение нуклеиновых кислот из мерзлотоведения и кернов льда
- подготовка материала
- Подготовка янтарный ампул для хранения растворов путем обработки 0,1% диэтилпирокарбоната (DEPC), инкубирование O / N при 37 ° С, и автоклавирования.
- Подготовьте 240 мМ раствор калий-фосфатного буфера. Добавить 2. 5 г одноосновного фосфата калия и 38,7 г двухосновного фосфата калия. Отрегулировать конечный объем до 500 мл добавлением стерильной воды.
- Подготовить гексадецилтриметиламмоний бромид (СТАВ) экстракции БУФFER путем растворения 4,1 г хлорида натрия в 80 мл воды и медленно добавляя 10 г СТАВ при нагревании и перемешивании. Отрегулировать конечный объем до 100 мл добавлением стерильной воды.
- Добавить равные объемы раствора фосфатного буфера и СТАВ-буфера и фильтр стерилизуют с использованием фильтра 0,22 мкм. Накройте бутылку с алюминиевой фольгой и хранить при комнатной температуре.
- Готовят 1,6 М раствор хлорида натрия (NaCl) путем объединения 9,35 г NaCl и 100 мл стерильной воды. Добавьте 10 г полиэтиленгликоль 8000 к раствору и фильтра стерилизуют 1,6 М NaCl. Хранить при температуре 4 ° С.
- Выделения нуклеиновых кислот в соответствии с модифицированной версией Гриффитс и др. 22 и Towe и др. 23
- Носите легкие костюмы дежурстве, нитриловые перчатки и маски. Чистая лаборатория пространство и пипец с 70% -ным этанолом, ДНК обеззараживание раствором и обеззараживающим раствором РНКазы.
- Удалить подвыборки (фильтр из керна льда или вечной мерзлоты образца почвы) в 2 мл керамический шарик винт-цар трубки от -80 ° C морозильника и оттаивания при комнатной температуре.
- Добавить 0,5 мл гексадецилтриметиламмония бромида (СТАВ) буфера для экстракции и вихрем кратко.
- Добавить 0,5 мл фенола-хлороформа-изоамиловый спирт (25: 24: 1) (рН 8) и встряхните трубки в горизонтальном направлении в течение 10 мин с помощью адаптера с плоской панелью в вихревом.
- После бусинка избиение, центрифужные пробирки при 16100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Удалить водный слой на новый стерильный 1,5 мл трубки и смешивают с равным объемом хлороформа-изоамиловый спирт (24: 1). Центрифуга при 16100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Удалить водный слой на новый стерильный 1,5 мл трубки и добавляют два объема 30% полиэтиленгликоля 8000 и 1,6 М NaCl. Инкубировать в течение 2 часов при температуре 4 ° С.
- Центрифуга при 16100 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
- Промыть гранулу нуклеиновой кислоты с приблизительно 500 мкл охлажденного льдом 70% этанола и центрифугируют при 16100 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Воздух сухой осадок в стерильной biohood в течение 2 часов, Ресуспендируют в 50 мкл ДНКазы / РНКазы ТЕ-буфера (рН 8,0). ДНК готова для последующих применений, таких как ПЦР и КПЦР.
- Определить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
- Развести ДНК стерильной, ДНК без воды для достижения 20 нг на реакцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный метод может быть использован для деконтаминации замороженных образцов, собранных из различных криосферы средах, от ледникового льда вечной мерзлоты. Здесь мы приводим данные , специально собранные от льда и вечной мерзлоты образцов , собранных из инженерного Центра исследований и разработок - в холодных регионах научно-инженерной лаборатории (ERDC-CRREL) мерзлота тоннеля , расположенного в Fox, АК (рис 1А и 1В). Мерзлота тоннель проходит приблизительно 110 м в сторону долины Голдстрим и обеспечивает доступ к богатому льдом ила и наносов 30-31. Образцы из ледяного клина и мерзлого грунта были тщательно собраны в трех экземплярах со стен туннеля 24 октября 2014 г. Во время отбора проб, температура вечной мерзлоты стены была -2,9 ° C. Образцы были собраны из признака льда клина примерно 27 м от портала тоннеля и мерзлого грунта на 35 м и 60 м отпортал туннеля (рис 1C и 1D). Особое внимание было принято во время отбора проб , чтобы ограничить загрязнение льда и вечной мерзлоты ядер (рис 1E). Замороженные ядра были обработаны в соответствии с нашим обеззараживание протоколом (рисунок 2) и транспортируется на сухом льду в почве микробиологической лаборатории CRREL в Ганновере, NH для обработки.
Все ядра были обработаны с использованием протокола , описанного в разделе 2 с использованием стерильных микротомных лезвий и растворов (рис 3А, В и С). Цель данного исследования состояла в том, чтобы успешно извлечь эндогенные нуклеиновых кислот из замороженных образцов для определения микробных сообществ, присутствующих в то время, был депонирован материал. Протокол обеззараживание оценивали путем легирования сердечники с разбавленным культурой Serratia marcescens , а затем рассматривая чашки Петри для кормовой части ростаэр ядра были обработаны 31. Отсутствие S. marcescens колоний показали , что экзогенный микроорганизмы были должным образом удалены из наружной части сердечника. Тем не менее, отсутствие колоний не будет указывать, был ли экзогенный ДНК удаляется из наружной части сердечника. Таким образом, мы секвенировали образцы из керна льда , чтобы проверить ДНК из Serratia зр. Поскольку микробный обилие в клине льда, вероятно , значительно ниже , чем в вечную мерзлоту, мы использовали ледовых кернов , чтобы определить , является ли ДНК из S. marcescens будет присутствовать в соответствии с протоколом обеззараживание. Если ядра не были должным образом обеззараживать, а затем последовательностей , родственных S. marcescens можно было бы ожидать, что в образцах. На рисунке 4 показаны низкое содержание бактерий разнообразие внутри ледяного керна из 16S рРНК результатов секвенирования генов. Последовательности , связанные с Pseudomonas зр., Из филюмом Gammaproteobacteria, доминировали на льду SAMPLэс. Члены, связанные с Planctomycetia также присутствовали во льду, но в меньшей степени. Особо следует отметить отсутствие Serratia зр. В результатах секвенирования, предполагая , что протокол обеззараживание достаточно удалены экзогенной ДНК.
Кроме того, существует дополнительный риск загрязнения во время экстракции нуклеиновых кислот. Отрицательные заготовки экстракционные были использованы для выявления загрязнения из экзогенных нуклеиновых кислот. ДНК из образцов и отрицательных контролей были амплифицированы с использованием КПЦР. Данные показали , что КПЦР мерзлота бактерией, но археи не были обнаружены в вечную мерзлоту (таблица 1). Успешное обезвреживание дополнительно свидетельствует отсутствие бактериальных или архейных ампликонов в заготовках экстракции, в сочетании с положительным усилением элементов управления, синегнойной Шогезсепз и Halobacterium Салинарум (таблица 1). abundИзмерения показали , что ANCE не было никаких существенных различий в бактериальном изобилии между сердечниками , собранных в 35 м от портала по сравнению с 60 - м сердечников (таблица 1). Постоянно ведутся исследования, чтобы определить, был ли состав микробного сообщества отличается между ядрами.
Рисунок 1. Пример площадок вблизи Фэрбенкс, AK. (A) Карта Фэрбенкс, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL мерзлота Туннель, (C) коллекции вечной мерзлоты ядер с использованием шнек SIPRE, (D) вид шнек ввода вечной мерзлоты стены, и (E) готовит ядро для архивирования. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную верSion этой фигуры.
Рисунок 2. Схема обеззараживании замороженного материала. (А) Замороженный материал (например, кернов льда или ядро мерзлота) обрабатывается в холодном помещении. (Б) она намеренно загрязненный с бактериальной культурой. (С) Сердечник выбриты стерильным микротома лезвие , чтобы удалить часть мм наружный 5. (D) , ряд решений применяются для дальнейшего обеззараживать внешнюю часть образца. ДДС показывает ДНК дезактивацию раствора и RDS показывает обеззараживающим раствором РНКазы. (Е) Размещая ядро в стерильном biohood проведенной при комнатной температуре, внешний 2-5 мм материала оттаивает. Жидкость, которая капает из льда или вечной мерзлоты, собирают в чашках Петри и сердечник мазок и высевали, чтобы проверить, что ядро было должным образом дезинфицируются. (F и G) Если рост бактерий не обнаружено, то ядро оттаивают при температуре 4 ° С в стерильном контейнере. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Обеззараживание вечной мерзлоты ядер в холодном помещении в стерильных условиях. (A) Удалите внешний слой сердечника вечной мерзлоты с металлическим лезвием микротома путем соскоба. (B) ближе вид передряги. (C) Раствор для ополаскивания , чтобы обеззаразить внешний слой сердечника. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. микробной последовательности из образцов льда клина. Гистограмма показывает среднее относительное обилие бактериальной фил , присутствующих в образцах льда клина процент. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1. Бактериальные изобилие в вечной мерзлоты. Результаты КПЦР показывающие обилие бактерий в образцах вечной мерзлоты и связанных с ними экстракции заготовок. Значения в таблице представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. N есть число выборок. ND указывает не обнаружено.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Криосфера предлагает доступ к сохранившимся организмов, которые сохранялись при прошлых условиях окружающей среды. Хотя восстановленный таксонов не может представлять собой полное историческое сообщество, те извлекают из анализа ледниковых льдов и вечной мерзлоты образцов может дать ценную историческую информацию о некоторых периодах времени 15-16. Например, значимые биологические данные были взяты из ледяных исследованиях , посвященных анаэробной активности в ледяного покрова Гренландии 20 и мерзлотных исследованиях , посвященных циклу углерода процессов в результате оттепели 33 и обеспечили понимание грибного разнообразия от вечной мерзлоты в Берингии 16. Правильный отбор проб и обеззараживание должно происходить перед проведением анализа вниз по течению, чтобы исследовать биологические сообщества в рамках этих замороженных материалов. Даже если эти шаги имеют существенные последствия для интерпретации данных, многие исследования не предлагают конкретные детали о том, как образцы шERE собраны и обработаны или изображения, показывающие, как обрабатывать замороженных материалов. Например, предыдущие исследования , легированного внешнюю часть сердечников с люминесцентными микросферы или известных бактерий 15, хотя точные концентрации этих веществ не были описаны. Другие исследования описаны протоколы деконтаминации подробно, но не применяется с высокой пропускной способностью анализа , чтобы проверить эффективность методики 15, 32. Таким образом, детальное обследование интактных бактерий и экзогенной ДНК на основе роста на чашках Петри и кПЦР использовалась , чтобы определить , является ли сбор образцов, сохранение и аналитические процедуры были достаточно стерильно для выявления микробных сообществ, присутствующих в замороженных материалах.
Этот протокол был изменен, чтобы успешно изолировать генетический материал интерес с древних ядер. Уход, такие как ношение снаряжение, специально сконструированное и обеззараживающих поставки должны быть приняты во время сбора, обработки и выпискииона из сердечников с момента заражения может происходить на любой стадии. Кроме того, судоходство сердечники с сухим льдом или сопоставимого охлаждающего агента необходимо, потому что, если сердечники оттаивать во время транспортировки, то есть большую склонность, что загрязняющие вещества из внешней области ядра могут мигрировать к внутренней части сердечника. В целях дальнейшего снижения вероятности возникновения загрязнения, рассмотреть возможность сбора больших ядер с моторизованным шнеком, а не толкающего ядра. Мы обнаружили, что нажимные стержни были слишком малы, чтобы правильно обеззараживать на этапе выскабливание. В качестве альтернативы, больший объем образца может быть извлечена из крупных ядер, что особенно важно для образцов с низким изобилием биологического материала. Кроме того, чем больше объем дает больше возможностей для ошибки , такие , что если Serratia marcescens колонии обнаружены на пластинах, затем ядро является достаточно большим , чтобы быть обработаны снова.
Различные поставки были протестированы для определения наиболее эффективнойМетод обеззараживать ядер. Например, стерильная алюминиевая фольга, а не стеклянной посуды или пластиковые материалы, разрешенные для ядра, чтобы быть размещены на стерильной поверхности быстро и легко. Кроме того, нетрадиционные расходные материалы, такие как металл стойки и поднос оказалось полезным, чтобы позволить Царапины внешние материалы накапливаются от ядра, снижая риск повторного загрязнения ядер. В предыдущих итераций протокола, соскоба произошло на плоской поверхности, что повышает риск заражения. И, наконец, стерильные мешки, а не стеклянной посуды, было обнаружено, что способствует смешиванию и хранения образцов.
Этот протокол был предназначен для ликвидации микроорганизмов и нуклеиновых кислот на внешней части замороженных ядер. В то время как изопропиловый спирт и этанол являются эффективными дезинфицирующими средствами, они не удаляют нуклеиновых кислот. Таким образом, были использованы растворы, которые удаляют нуклеиновых кислот и связанные с ними ферменты из внешней части сердечников. Эти Солуции обычно используются для удаления нуклеиновых кислот и связанных с ними нуклеазы из лабораторных расходных материалов и оборудования. При тестировании их эффективность на лабораторных поверхностях, РНК дезактивация раствора удаляют больше экзогенные материалов , чем в обеззараживающим раствором ДНК 34. С помощью нуклеазы, чтобы дезактивировать внешнюю часть сердечника не всегда может быть предпочтительным способом, так как генетические материалы, представляющие интерес также могут быть удалены из образцов с низким изобилием конкретного организма. В частности, генетический материал хранится в вечной мерзлоты и льда в течение длительных периодов времени подвергаются деградации. Поскольку микроорганизмы находятся в высоком содержании в этих аляскинских образцах, обеспокоенность тем, что решения позволит устранить значительную долю эндогенных генетических материалов была значительно сокращена. Тем не менее, следует проявлять осторожность при использовании решений, которые содержат нуклеазы, чтобы гарантировать, что нуклеиновые кислоты, которые были серьезно деградировали или находятся из организмов в низкой численности не удаляютсянуклеаз.
Отсутствие S. marcescens колонии на чашки Петри при условии , уверенность , что интактные клетки были удалены из наружной части сердцевины вечной мерзлоты. Кроме того, анализ кернов льда , которые прошли тот же протокол , не показали никаких детектируемых последовательностей , связанных с S. marcescens. Результаты последовательностей показал , что только Pseudomonas были обнаружены в этих образцах, несмотря на то, как Pseudomonas зр. и Serratia зр. находятся в пределах класса Gammaproteobacteria. Вместе отсутствие S. marcescens колонии на чашках Петри и отсутствие ампликонов ДНК из кПЦР позволяют предположить , что замороженные ядра были успешно обеззараживать. Таким образом, микроорганизмы, обнаруженные, вероятно, были встроены в замороженном материале, а не загрязнение от сверления или обработки ядер. Другие методы бурения включают в себя гидравлическое бурение для проникновения почвы или льда на больших глубинах. Хотя этот метод would полезно исследовать низкую микробной изобилие в этих олиготрофных средах, не раскрывает ли будет успешно удален буровые растворы. Кроме того, если высокая пропускная способность последовательности не является частью вниз по течению анализа, специфические ПЦР - реакции ориентации S. marcescens следует использовать для амплификации экстрагированной ДНК.
Результаты нашего примера набора данных показал, что нетронутые геномную ДНК успешно извлечены из замороженных материалов. Кроме того, обе вечной мерзлоты и льда клина питали бактерии, о чем свидетельствует кПЦР и последовательности, соответственно. Аляскинский прерывистой вечной мерзлоты из этого исследования содержали аналогичные бактериальные числа как вечной мерзлоты в канадском высоких широтах Арктики 35, хотя на Аляске образцы содержали на порядок меньше бактерий , чем вечной мерзлоты из Тибетского нагорья в провинции Цинхай, Китай 36 и активный слой / мерзлотных почв от Нунавут, Канада 37. Как и в случае Iв.п. клин собраны в Нунавут, Канада 37, последовательности , связанные с Gammaproteobacteria, в частности , Pseudomonas, которые являются общими для почв и метаболически разнообразны, доминировали Аляскинский ледяной клин в данном исследовании. На самом деле, Катаяма и др. 11 изолированных бактерий внутри фил Actinobacteria, бацилл и Gammaproteobacteria от одного из ледяных клиньев из ERDC-CRREL мерзлотоведения тоннеля. Эти исследования подтверждают обнаружение Gammaproteobacteria в данном исследовании. Planctomycetia, которые являются общими для водной пробы, были также обнаружены в клине льда. Эти организмы были обнаружены в активных почвах слое над вечной мерзлоты в Северо - Восточной Сибири 38, в дополнение к вечной мерзлоты в Тибетском плато в провинции Цинхай, Китай 39.
Многие исследования изучали присутствие архей, особенно метаногенами, в вечной мерзлоты, с понятием, что в качестве вечной мерзлоты оттаивает, метаногены, вероятно, станут более активными, contriБутинге с оттоком метана в атмосферу 21, 33-34. Удивительно, но археи не были обнаружены в аляскинских льда клина или вечной мерзлоты образцов хотя оба эвриархеоты и Crenarchaeota были найдены в вечной мерзлоты от канадской высоких широтах Арктики 17 и метаногены были обнаружены в пробах из вечной мерзлоты арктической тундры в России 21.
Замороженные материалы гавани древних микроорганизмов, обеспечивая учет биогеохимических процессов, которые произошли много тысяч лет назад. Это биологическое разнообразие представляет большой интерес в рамках нынешнего режима потепления климата, потому что микроорганизмы, которые были когда-то ограничены в криосферы среде может стать освобожденным, когда замерзшие материалы оттепели. Для того, чтобы уверенно идентифицировать биоразнообразие питал в этих замороженных материалов, замороженные почвы и образцы льда должны быть надлежащим образом обработаны и обеззараживать. Здесь мы приводим протокол для удаления чужеродных клеток и ДНК из замороженных образцов до ensuповторно, что микроорганизмы, обнаруженные были из материала, а не загрязнение от сверления или обработки ядер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
- Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
