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Biology

जमे हुए कोर के बाहरी हिस्से से Exogenous सामग्री को हटाने प्राचीन जैविक समुदायों शरण के अंदर जांच करने के लिए

Published: July 3, 2016 doi: 10.3791/54091
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 4, 2, 4
1Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 2Environmental Processes Branch, Environmental Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Vicksburg, MS, 3Terrestrial and Cryospheric Scienes Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Hanover, NH, 4Biogeochemical Sciences Branch, Cold Regions Research and Engineering Laboratory, US Army Engineer Research & Development Center, Fairbanks, AK

Summary

cryosphere संरक्षित जीवों कि पिछले पर्यावरणीय परिस्थितियों में कायम करने के लिए पहुँच प्रदान करता है। एक प्रोटोकॉल को इकट्ठा करने और मिट्टी और बर्फ के permafrost कोर शुद्ध करना प्रस्तुत किया है। बहिर्जात कालोनियों और डीएनए के अभाव का सुझाव है कि पता लगाया सूक्ष्मजीवों सामग्री के बजाय, ड्रिलिंग या प्रसंस्करण से संदूषण का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Introduction

Cryosphere (जैसे, permafrost मिट्टी, बर्फ सुविधाओं, हिमनदों बर्फ, Firn, और बर्फ) किस प्रकार के जीवों के पिछले पर्यावरणीय परिस्थितियों में कायम में एक झलक प्रदान करता है। इन substrates हजारों वर्ष पुरानी है, उनकी सूक्ष्म समुदायों, जब जमाव के बाद से जमे हुए संरक्षित के सैकड़ों करने के लिए दसियों हो सकता है के बाद से, प्राचीन पर्यावरण की स्थिति को दर्शाते हैं। उचित रूप से इन पारिस्थितिक तंत्र का विश्लेषण और जमे हुए मिट्टी और बर्फ, उचित संग्रह और प्रसंस्करण जमे हुए नमूनों की सार्थक से जैविक जानकारी निकालने के लिए आवश्यक है। यह अत्यंत महत्व का है के रूप में 21 वीं सदी के लिए जलवायु अनुमानों आर्कटिक और उप-आर्कटिक क्षेत्रों 1 में एक स्पष्ट वार्मिंग के लिए संभावित संकेत मिलता है। विशेष रूप से, आंतरिक अलास्का और ग्रीनलैंड गर्म करने के लिए लगभग 5 डिग्री सेल्सियस और 7 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः 2100 2,3 से उम्मीद कर रहे हैं। यह काफी मिट्टी और जलीय सूक्ष्म समुदायों, और इसलिए, संबंधित को प्रभावित करने की उम्मीद हैbiogeochemical प्रक्रियाओं। गर्म तापमान और वर्षा बदल शासन कई क्षेत्रों में 2-5 permafrost गिरावट संभवतः एक मोटा, मौसम thawed (सक्रिय) के लिए अग्रणी परत 6.7, जमे हुए मिट्टी के विगलन, और जैसे बड़े पैमाने पर बर्फ पिघलने के शव का आरंभ करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं जमीन बर्फ, बर्फ wedges, और अलगाव बर्फ 8। यह नाटकीय रूप से पौधों और इन पारिस्थितिक तंत्र में जानवरों की जैव विविधता के अलावा biogeochemical गुण बदल जाएगा।

हिमनदों बर्फ और syngenetic permafrost तलछट और बर्फ सुविधाओं रासायनिक और एक वातावरण का प्रतिनिधित्व क्या समय सुविधाओं का गठन पर वहाँ रहते थे की जैविक सबूत फंस चुके हैं। उदाहरण के लिए, आंतरिक अलास्का में, दोनों Illinoisan और विस्कॉन्सिन आयु वर्ग के permafrost कर रहे हैं वर्तमान और विशेष रूप से इस permafrost वर्तमान (YBP) कि Impa के जैविक और geochemical सबूत होते हैं पहले 150.000 साल के लिए आधुनिक से डेटिंग अद्वितीय स्थानों प्रदान करता हैजैव विविधता पर पिछले जलवायु परिवर्तन की सीटी। नतीजतन, इन अवसादों कई वर्षों के हजारों के ऊपर biogeochemistry और जैव विविधता का एक रिकॉर्ड प्रदान करते हैं। के बाद से क्षेत्र में कम अवसादन दर है और हिमाच्छादित कभी नहीं किया है, अबाधित नमूने खड़ी मिट्टी प्रोफ़ाइल या ड्रिलिंग क्षैतिज सुरंगों में में संग्रह और विश्लेषण, या तो ड्रिलिंग के लिए पहुंच रहे हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, व्यापक रिकॉर्ड मौजूद है कि विशेष रूप से इस क्षेत्र में 9-14 permafrost की अनूठी biogeochemical सुविधाओं पर प्रकाश डाला। विशेष रूप से, डीएनए विश्लेषण के आवेदन दोनों वर्तमान और प्राचीन बर्फ और permafrost नमूनों में उपस्थिति और जैव विविधता की हद तक अनुमान लगाने के लिए विशिष्ट जीवों द्वारा कब्जे के लिए प्राचीन पर्यावरण की स्थिति के संबंध और वास के अन्वेषण के लिए सक्षम बनाता है।

पिछले अध्ययनों स्तनधारियों, पौधों और 50 के लिए डेटिंग YBP 11, 15-19 नमूनों से सूक्ष्मजीवों पर जलवायु प्रभावों की पहचान की है, हालांकि प्रत्येक अध्ययन एक विभिन्न इस्तेमाल कियाNT कार्यप्रणाली को इकट्ठा करने और permafrost या आइस कोर शुद्ध करना। कुछ उदाहरणों में, ड्रिलिंग कोर 16, 20-21 निष्फल रहे थे, हालांकि विशिष्ट पद्धति स्पष्ट नहीं किया विदेशी न्यूक्लिक एसिड भी नमूने से सफाया कर दिया गया है। अन्य अध्ययनों में, बैक्टीरियल 15 (जैसे, Serratia marcescens) के साथ ही फ्लोरोसेंट microspheres 22 परिशोधन प्रक्रियाओं की प्रभावकारिता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है आइसोलेट्स।

इस प्रयोग से वापस लगभग 40k YBP के लिए डेटिंग permafrost नमूनों से माइक्रोबियल समुदायों की जांच के लिए एक बड़ा अध्ययन का हिस्सा था। अध्ययन के इस भाग के विशिष्ट उद्देश्य को सफलतापूर्वक बर्फ और permafrost कोर शुद्ध करना था। हमारे ज्ञान करने के लिए, कोई कार्यप्रणाली जमे हुए कोर के बाहरी हिस्से से विदेशी न्यूक्लिक एसिड और जुड़े न्युक्लिअसिज़ समाप्त करने के लिए डिजाइन समाधान के उपयोग के एकीकृत किया गया है। यह सच है कि इन समाधान commonl हैं के बावजूद हैY आणविक प्रयोगों के लिए प्रयोगशाला के उपकरण शुद्ध करता था।

एक बार जब कोर decontaminated थे, जीनोमिक डीएनए प्रोटोकॉल ग्रीफिथ एट अल। 23 और Towe एट अल। 24 द्वारा विकसित का उपयोग कर निकाला गया था, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग मात्रा, और बाँझ, डीएनए मुक्त पानी से पतला प्रतिक्रिया प्रति 20 एनजी प्राप्त करने के लिए। बैक्टीरियल -16 rRNA जीन प्राइमरों 331F और 797R के साथ प्रवर्धित थे और BacTaq 25 और अर्चेअल -16 जांच rRNA जीन प्राइमरों आर्क 349F और आर्क 806R और निम्न शर्तों के तहत टीएम आर्क 516F 26 जांच के साथ परिलक्षित गया: 600 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस 45 चक्रों के बाद 30 सेकंड, 60 सेकंड के लिए 57 डिग्री सेल्सियस, और 72 डिग्री 30 सेकंड के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार के साथ 25 सेकंड के लिए सी के लिए 95 डिग्री सेल्सियस की। सभी qPCR प्रतिक्रियाओं दो प्रतियों में आयोजित की गई। 20 μl प्रतिक्रिया की मात्रा 20 एनजी डीएनए, प्राइमरों के 10 माइक्रोन, जांच के 5 सुक्ष्ममापी, और qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 μl शामिल थे। मानक के लिएr बैक्टीरियल और अर्चेअल qPCR जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर तैयार कर रहे थे स्यूडोमोनास fluorescens और Halobacterium salinarum, क्रमशः। दोनों चरण लॉग इन करने के बड़े हो रहे थे। प्लेट मायने रखता आयोजित की गई और डीएनए संस्कृतियों से अलग किया गया था। जीनोमिक डीएनए एक की धारणा और एच के लिए जीनोम प्रति -16 rRNA जीन के छह प्रतियों के साथ एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ मात्रा निर्धारित की गई थी salinarum और पी fluorescens क्रमश: 27-28। बैक्टीरियल और अर्चेअल जीन की प्रतिलिपि संख्या मानक वक्र के आधार पर गणना की गई है, उपचार के बीच असमान प्रसरण के लिए खाते में करने के लिए लॉग-बदल, और एनोवा द्वारा मूल्यांकन।

सामुदायिक संरचना -16 rRNA जीन अनुक्रमण प्रवाह कोशिकाओं और पुल प्रवर्धन तकनीकों का प्रयोग और 'माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि' (QIIME), 29 के साथ समुदायों का विश्लेषण करके निर्धारित किया गया था। आगे और रिवर्स पढ़ता साथ शामिल हो गए थे और फिर दृश्य थे फ़िल्टर, अनुक्रमित,और उच्च गुणवत्ता के प्रतिनिधियों नए सिरे से परिचालन वर्गीकरण इकाइयों (OTU) एक संदर्भ डेटाबेस के साथ अनुक्रम संरेखण के माध्यम से काम के लिए चयन किया गया था। गठबंधन दृश्यों वर्गीकरण काम के लिए एक अलग संदर्भ डेटाबेस की तुलना में थे। एक जाति के स्तर OTU तालिका सामान्य समुदाय संरचना का निर्धारण करने के लिए बनाया गया था।

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Protocol

1. उपकरण तैयार करना और permafrost कोर संग्रह

  1. उपकरण तैयार करने और क्षेत्र नमूना संग्रह और संरक्षण के गियर
    1. बैरल के शीर्ष में ड्राइव एडाप्टर डालने और लीवर जगह में इसे बंद करने के लिए घूर्णन द्वारा नमूना संग्रह के लिए बरमा इकट्ठा करो। ड्राइव एडाप्टर पर एडाप्टर ट्यूब पिन और एडाप्टर ट्यूब पर मोटर पिन। प्रति बैरल पर कटर डालें।
    2. पहनें प्रकाश कर्तव्य सूट, nitrile दस्ताने, मास्क और नमूने के लिए किसी भी प्रदूषण को कम करने के लिए। कान संरक्षण और permafrost सुरंग (चित्रा 1) में प्रवेश करने पर सुरक्षा के लिए एक कठिन टोपी पहनते हैं।
    3. सुरंग में प्रवेश और एक स्थान के नमूने (चित्रा 1 बी) इकट्ठा करने के लिए चयन करें।
      नोट: खड़ी या क्षैतिज ड्रिलिंग स्थान के लिए, एक ऐसा क्षेत्र है जहां सबूत है कि सामग्री जमे हुए है (जैसे, बर्फ या permafrost) वहाँ जाना जाता है का चयन करें, वहाँ कोई ज्ञात बड़ी जड़ सिस्टम है, और वहाँ कोई ज्ञात बजरी है। सभी हटाएंएक नमूना इकट्ठा करने से पहले क्षेत्र से संयंत्र सामग्री रह रहे हैं। खड़ी या क्षैतिज ड्रिलिंग हैं, एक क्षेत्र है कि अपेक्षाकृत सपाट और बरमा के साथ पहुँचा जा सकता है का चयन करें।
    4. एक प्लास्टिक की सामग्री है कि 70% isopropanol, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ निष्फल कर दिया गया है साथ जमीन लेयरिंग द्वारा एक काम स्टेशन तैयार करें।
    5. आधे में एक 10 सेमी व्यास क्लोराइड (पीवीसी) पाइप काट लंबाई वर्कस्टेशन पर रखें कोर पकड़ के रूप में वे बरमा से हटा रहे हैं एक गर्त प्रदान करने के लिए। 70% isopropanol, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ पीवीसी पाइप शुद्ध करना।
    6. काम स्टेशन के पास, 70% isopropanol, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ छिड़काव द्वारा बरमा शुद्ध करना। एक पोंछ के साथ बरमा से समाधान निकालें।
  2. बर्फ और permafrost कोर संग्रहण और भंडारण
    1. नमूने के लिए दीवार का एक क्षेत्र का चयन करें (1.2.1 देखनाध्यान दें)।
    2. 70% isopropanol, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ पोंछते द्वारा जमे हुए दीवार क्षेत्र के लगभग 10 सेमी व्यास शुद्ध करना।
    3. ब्याज की क्षेत्र के लिए decontaminated बरमा तरक्की ऐसी है कि यह नमूना क्षेत्र को सीधा है और दीवार (चित्रा 1 सी, डी) की साफ चेहरे में ड्रिलिंग शुरू करते हैं।
    4. ध्यान से नमूना संग्रह क्षेत्र से बरमा को हटा दें। मोटर से बरमा डिस्कनेक्ट और स्वच्छ काम स्टेशन में बाँझ पीवीसी पाइप के ऊपर बरमा जगह है। ध्यान से बरमा झुकाव है कि इस तरह जमे हुए कोर बाँझ पीवीसी पाइप (चित्रा 1E) पर बाहर स्लाइड।
    5. 70% isopropanol, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ दस्ताने शुद्ध करना।
    6. बाँझ दस्ताने के साथ बर्फ और permafrost कोर उठाओ और उन्हें बाँझ बैग में जगह है।
    7. एक कूलर या ठंडे कमरे में कोर की जगह जब तक वे भेज या कार्रवाई कर रहे हैं।
    8. श्रीसूखी बर्फ का उपयोग कर उन्हें 0 डिग्री सेल्सियस नीचे के तापमान पर बनाए रखने के लिए जमे हुए कोर आईपी।
    9. इसके तत्काल बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर कोर की दुकान।

2. permafrost और बर्फ कोर प्रसंस्करण

  1. सामग्री तैयार
    1. 4 घंटे के लिए 450 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में पाक द्वारा बाँझ, न्यूक्लिक एसिड मुक्त भारी कर्तव्य एल्यूमीनियम पन्नी, धातु रैक, कांच के बने पदार्थ, धातु संदंश, और कांच ऊन से तैयार करें। इन सामग्रियों को अलग सेट तक इस्तेमाल किया।
    2. एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान से गुजर रहा 95% इथेनॉल और ultrapure पानी जीवाणुरहित।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस और पानी पर स्टोर इथेनॉल समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. 70% इथेनॉल, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ छिड़काव और तुरंत प्रत्येक समाधान के बाद पोंछते द्वारा एक प्लास्टिक शासक जीवाणुरहित।
  2. जीवाणु संस्कृति तैयारी
    1. शोरबा और प्लेटों Serratia marcescens विकसित करने के लिए तैयार करें।
      1. शोरबा के लिए, गठबंधन 5 ग्राम कोशिशptone, 1 ग्राम ग्लूकोज, 5 ग्राम खमीर निकालने, और 1 ग्राम पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, और फिर आसुत पानी जोड़ने 1 एल तक पहुंचने के लिए प्लेटें बनाने के लिए, ऊपर मिश्रण करने के लिए अगर की 15 ग्राम जोड़ें। शोरबा और प्लेटों के लिए, 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर 7 और आटोक्लेव पीएच को समायोजित करें।
    2. 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड, पोटेशियम क्लोराइड की 0.2 ग्राम, सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय की 1.44 ग्राम, और 0.24 ग्राम पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार के संयोजन से 1x फॉस्फेट buffed नमकीन घोल (पीबीएस) तैयार करें और आसुत जल जोड़ने के 800 मिलीलीटर तक पहुंचने के लिए। 7.4 पीएच को समायोजित करें और 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर 1 एल आटोक्लेव तक पहुंचने के लिए आसुत जल जोड़ें।
    3. एस में सूई से एक बाँझ पाश के साथ शोरबा टीका लगाना marcescens संस्कृति है कि पहले से -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए जमा हो गया था। सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत, सीरियल पतला पीबीएस के 9 मिलीलीटर संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़ने और मैन्युअल द्वारा संस्कृति समाधान पलटना। पीबीएस के 9 मिलीलीटर को यह कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर जोड़ें और मैन्युअल समाधान पलटना। एक 10 -9 Dilu तक आठ बार दोहराएँtion पहुँच जाता है।
    4. थाली पर शोरबा के 1 मिलीलीटर के वितरण और एक सेल स्प्रेडर के साथ प्रसार के द्वारा अगर प्लेट पर 10 -6, 10 -7, 10 -8, और 10 -9 समाधान बिखरा हुआ है। कमजोर पड़ने प्रति तीन प्रतियों में यह मत करो। 4 डिग्री सेल्सियस पर मूल संस्कृति स्टोर।
    5. 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं। कालोनियों की संख्या की गणना मूल संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए। नोट: मूल संस्कृति में कालोनियों की संख्या बैक्टीरिया की वृद्धि दर पर निर्भर करेगा।
    6. Pipet एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में मूल संस्कृति के 250 μl। के रूप में पिछले चरण में कॉलोनी गिनती द्वारा निर्धारित लगभग 10 9 कोशिकाओं / एमएल प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस के लिए पर्याप्त मात्रा जोड़कर मूल संस्कृति पतला। 10 मिनट के लिए 2500 XG पर centrifuging द्वारा एक microcentrifuge ट्यूब में गोली कोशिकाओं।
      नोट: 1x पीबीएस की मात्रा बैक्टीरिया की वृद्धि दर के आधार पर अलग अलग होंगे।
    7. एक बाँझ biohood मेंशोरबा बंद pipet और पीबीएस बफर 1x 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक या लगभग दो महीने में स्टोर।
    8. प्रसंस्करण के दिन, एस पतला कदम 2.2.7 से marcescens संस्कृति मूल एस के 1 मिलीलीटर जोड़कर एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पीबीएस बफर 1x 39 मिलीलीटर marcescens संस्कृति।
  3. कोर प्रसंस्करण और संरक्षण गियर के लिए ठंडे कमरे अंतरिक्ष तैयार
    1. एक 1% ब्लीच समाधान के साथ ठंडे कमरे, स्वच्छ दीवारों, फर्श, और धातु तालिका हल्का करने से पहले।
    2. लगभग करने के लिए ठंडे कमरे के तापमान सेट -11 डिग्री सेल्सियस।
    3. एक बार ठंडे कमरे वांछित तापमान तक पहुँच गया है, प्रकाश कर्तव्य सूट, nitrile दस्ताने, मास्क पहनने और ठंडे कमरे और नमूने के लिए किसी भी प्रदूषण को कम करने के लिए।
      नोट: दो व्यक्तियों ठीक से तैयार इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं।
    4. बाँझ सामग्री लाने (जैसे, एल्यूमीनियम पन्नी, धातु रैक, कांच के बने पदार्थ, ट्रे, एस marcescens संस्कृति, और मीलcrotome ब्लेड) और ठंडे कमरे और बाँझ मेज पर जगह में नमूने हैं।
  4. Permafrost और एक ठंडे कमरे की सुविधा में आइस कोर प्रसंस्करण
    1. एक बाँझ, न्यूक्लिक एसिड मुक्त एल्यूमीनियम पन्नी की चादर पर एक permafrost कोर रखें।
    2. हल्के एस का पतला संस्कृति के साथ कोर के बाहर टीका लगाना marcescens एक बाँझ फोम प्लग (चित्रा 2 बी) का उपयोग कर।
    3. बाँझ धातु रैक कि एक ट्रे के ऊपर बैठता है पर कोर रखें।
    4. 70% इथेनॉल, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ इस्पात microtome ब्लेड जीवाणुरहित।
    5. 70% इथेनॉल, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ व्यक्ति को एक साफ nitrile दस्ताने और ट्रे के ऊपर एक 45 डिग्री के कोण पर कोर पकड़।
    6. व्यक्तिगत बी धीरे समाप्त होता सहित पूरे कोर के बाहर के लगभग 5 मिमी, परिमार्जन, बाँझ ब्लेड का उपयोग करते समय व्यक्ति एक प्रत्येक परिमार्जन के बाद कोर (बदल जाता है 3 ए, बी)। जरूरत के रूप में 70% इथेनॉल, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ ब्लेड साफ कर लें।
    7. व्यक्तिगत बी ध्यान से और जल्दी से कोर के ऊपर डाल देना फिल्टर निष्फल 95% इथेनॉल, जबकि व्यक्ति एक कोर के रूप में समाधान डाल दिया है (आंकड़े 2 डी, 3 सी) बदल जाता है।
    8. व्यक्तिगत बी तुरंत फिल्टर निष्फल पानी से कुल्ला कोर है।
    9. एक नया बाँझ धातु रैक के साथ ट्रे पर इस्तेमाल किया धातु रैक बदलें।
    10. व्यक्ति एक ट्रे के ऊपर एक 45 डिग्री के कोण पर 70% इथेनॉल, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ उसके nitrile दस्ताने साफ और कोर पकड़ है।
    11. व्यक्तिगत बी स्प्रे डीएनए परिशोधन समाधान के साथ पूरे कोर है।
    12. व्यक्तिगत बी तुरंत फिल्टर निष्फल पानी से कुल्ला कोर है।
    13. व्यक्तिगत बी स्प्रे RNase परिशोधन समाधान के साथ पूरे कोर है।
    14. Individu हैअल बी तुरंत फिल्टर निष्फल पानी के साथ कोर कुल्ला।
    15. एल्यूमीनियम पन्नी की एक बाँझ शीट पर कोर रखें और हल्के से लपेट।
  5. पिघलना बाहरी कोर
    1. एक बाँझ गिलास पकवान पर एक बाँझ धातु रैक लामिना का प्रवाह के साथ एक बाँझ biohood में रखें।
    2. दो अगर एस के लिए विशिष्ट प्लेटें प्लेस बाँझ रैक नीचे कांच डिश में marcescens कोर (चित्रा 2 ई) से तरल इकट्ठा करने के लिए।
    3. बाँझ धातु रैक पर कोर रखें।
    4. (औसत पर, यह लगभग 10 मिनट के भीतर हो जाएगा) कोर की बाहरी सतह के लगभग 2-5 मिमी 23 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना करने की अनुमति दें। लगभग कोर मुड़ें 90 ° हर 2 मिनट।
    5. कोर की पूरी सतह झाड़ू बाँझ संदंश और बाँझ कांच ऊन का उपयोग कर और टीका लगाना दो अगर प्लेट एस के लिए विशिष्ट प्लेटों की सतह पर इन सामग्रियों swabbing द्वारा marcescens। मूल संस्कृति के साथ दो नए प्लेटों टीका लगाना के बाहर डोप के लिए इस्तेमाल कियाकोर, जो ठंडे कमरे की कम तापमान के संपर्क में था।
    6. निकट एक बाँझ शासक रखने, लेकिन कोर छू नहीं द्वारा thawed बेलनाकार कोर के बाहरी आयाम को मापने।
    7. कोर बड़े बाँझ बैग में रखें और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
  6. विकास के लिए जाँच करें
    1. एक सप्ताह के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर अगर प्लेटें सेते हैं।
    2. एस के विकास के लिए अगर प्लेट की जांच करना marcescens कालोनियों।
      1. थाली पर नहीं दिखाई कालोनियों देखते हैं, तो चरण 2.5.3 आगे बढ़ें।
      2. कालोनियों थाली पर दिखाई देते हैं, खंड 2 "permafrost और आइस कोर प्रसंस्करण" में कदम 2.1.1 से दोहराएँ।
    3. फ्रीजर से कोर प्राप्त करें और aseptically एक बाँझ बैग को हस्तांतरण।
    4. लगभग 24-48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ बैग में कोर स्टोर पूरे कोर पिघलना करने के लिए।

3. आइस कोर और permafrost से न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए subsample प्राप्त

  1. आइस कोर से न्यूक्लिक एसिड निकासी
    1. धीरे बैग (चित्रा 2 जी) आंदोलनकारी द्वारा आइस कोर से thawed सामग्री मिक्स।
    2. thawed सामग्री सूक्ष्मजीवों इकट्ठा करने के लिए वैक्यूम के तहत एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ एक बाँझ कंटेनर में डालो।
    3. Aseptically बाँझ संदंश के साथ फिल्टर को हटाने और एक बाँझ 2 मिलीलीटर चीनी मिट्टी मनका ट्यूब (1.4 मिमी) में जगह है।
    4. -80 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर स्टोर।
  2. permafrost कोर से न्यूक्लिक एसिड निकासी
    1. धीरे बैग सानना द्वारा permafrost कोर से thawed सामग्री मिक्स।
    2. बाद permafrost अच्छी तरह से मिश्रित किया गया है, एक बाँझ scoopula के साथ लगभग 0.5 ग्राम थोक मिट्टी की एक subsample प्राप्त करने और एक tared बाँझ 2 मिलीलीटर चीनी मिट्टी मनका पेंच टोपी ट्यूब (1.4 मिमी) है कि एक संतुलन पर ईमानदार बैठता में जगह है।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर subsamples।
    4. नमूनों की gravimetric पानी की सामग्री प्राप्त करते हैं।
      1. permafrost के 10 ग्राम उपाय के एक STERIL साथई scoopula और एक संतुलन पर एक tared टिन में जगह है। permafrost और टिन का गीला बड़े पैमाने पर मापने।
      2. एक ओवन 24 घंटे के लिए 105 डिग्री सेल्सियस पर सेट में permafrost सेते हैं। permafrost और टिन की सूखी बड़े पैमाने पर मापने।
      3. permafrost की सूखी जन द्वारा permafrost के गीला बड़े पैमाने घटाकर और permafrost की सूखी जन द्वारा विभाजित करके gravimetric पानी की मात्रा की गणना।
    5. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर permafrost।

4. permafrost और आइस कोर से न्यूक्लिक एसिड निकालें

  1. माल की तैयारी
    1. 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) के साथ इलाज, 37 डिग्री सेल्सियस, और autoclaving पर incubating हे / एन से समाधान धारण करने के लिए एम्बर शीशियों तैयार करें।
    2. 240 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर समाधान तैयार है। जोड़े 2. 5 पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार जी और पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय की 38.7 छ। बाँझ पानी जोड़कर 500 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    3. hexadecyltrimethylammonium ब्रोमाइड (CTAB) निष्कर्षण buf तैयारFer 80 मिलीलीटर पानी में 4.1 ग्राम सोडियम क्लोराइड भंग और धीरे-धीरे 10 ग्राम CTAB जोड़ने जबकि हीटिंग और सरगर्मी से। बाँझ पानी जोड़कर 100 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    4. फॉस्फेट बफर समाधान के बराबर मात्रा में जोड़ें और CTAB बफर और फिल्टर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ। आरटी पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ बोतल कवर।
    5. 9.35 छ NaCl और 100 मिलीलीटर बाँझ पानी के संयोजन से 1.6 मीटर सोडियम क्लोराइड समाधान (NaCl) तैयार करें। 10 ग्राम पॉलीथीन ग्लाइकोल 8000 1.6 एम NaCl समाधान और फिल्टर बाँझ में जोड़े। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. न्यूक्लिक एसिड निकासी ग्रीफिथ एट अल का एक संशोधित संस्करण के अनुसार। 22 और Towe एट अल। 23
    1. पहनें प्रकाश कर्तव्य सूट, nitrile दस्ताने, मास्क और। स्वच्छ प्रयोगशाला अंतरिक्ष और 70% इथेनॉल, डीएनए परिशोधन समाधान, और RNase परिशोधन समाधान के साथ pipets।
    2. 2 मिलीलीटर में (आइस कोर या permafrost मिट्टी नमूना से फिल्टर) subsample हटाये चीनी मिट्टी मनका पेंच-सीए-80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और आरटी पर पिघलना से पी ट्यूब।
    3. hexadecyltrimethylammonium ब्रोमाइड (CTAB) निष्कर्षण बफर और भंवर संक्षिप्त के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. (: 24: 25 1) फिनोल के क्लोरोफॉर्म-isoamyl शराब के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें (8 पीएच) और एक vortexer पर एक फ्लैट पैनल अनुकूलक का उपयोग कर 10 मिनट के लिए क्षैतिज नलियों हिला।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,100 XG पर मनका पिटाई, अपकेंद्रित्र ट्यूबों के बाद।
    6. एक नया बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब जलीय परत को हटाने और क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब के एक बराबर मात्रा के साथ मिश्रण (24: 1)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,100 XG पर अपकेंद्रित्र।
    7. एक नया बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब जलीय परत को हटाने और 30% पॉलीथीन ग्लाइकोल 8000 और 1.6 एम NaCl के दो संस्करणों में जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,100 XG पर अपकेंद्रित्र।
    9. न्यूक्लिक एसिड गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,100 XG पर ठंडा 70% इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज के लगभग 500 μl के साथ धोएं।
    10. 2 घंटे के लिए एक बाँझ biohood में शुष्क हवा गोली। 50 μl DNase / RNase मुक्त ते बफर में Resuspend (8.0 पीएच)। डीएनए ऐसे पीसीआर और qPCR के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए तैयार है।
    11. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण।
    12. बाँझ, डीएनए मुक्त पानी के साथ डीएनए पतला प्रतिक्रिया प्रति 20 एनजी प्राप्त करने के लिए।

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Representative Results

प्रस्तुत विधि permafrost करने के लिए, विभिन्न cryosphere वातावरण से एकत्र नमूनों जमे हुए शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है हिमनदों के बर्फ से। यहाँ, हम डेटा विशेष रूप से इंजीनियरिंग अनुसंधान और विकास केंद्र से एकत्र बर्फ और permafrost नमूनों से एकत्र पेश - ठंडा क्षेत्र अनुसंधान और इंजीनियरिंग प्रयोगशाला (ERDC-CRREL) Permafrost सुरंग फॉक्स, एके में स्थित (चित्रा 1 ए और 1 बी)। Permafrost सुरंग Goldstream घाटी के पक्ष में लगभग 110 मीटर में फैली हुई है और बर्फ अमीर गाद और मिट्टी इत्यादि 30-31 जगह होते हैं। एक बर्फ की कील और जमी मिट्टी से नमूने ध्यान से अक्टूबर 2014 सुरंग की दीवारों से 24 तीन प्रतियों में एकत्र किए गए नमूने के समय, permafrost दीवार का तापमान -2.9 डिग्री सेल्सियस था। नमूने से 35 मीटर और 60 मीटर की ऊंचाई पर सुरंग के पोर्टल, और जमी मिट्टी से एक बर्फ कील सुविधा लगभग 27 मीटर से एकत्र किए गए थेसुरंग के पोर्टल (चित्रा 1 सी और 1 डी)। विशेष देखभाल बर्फ और permafrost कोर (चित्रा 1E) के प्रदूषण को सीमित करने का नमूना संग्रह के दौरान लिया गया था। जमे हुए कोर हमारे परिशोधन प्रोटोकॉल (चित्रा 2) और प्रसंस्करण के लिए हनोवर, राष्ट्रीय राजमार्ग में CRREL मिट्टी सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला के लिए सूखी बर्फ पर पहुँचाया के अनुसार संभाल रहे थे।

सभी कोर प्रोटोकॉल धारा 2 में वर्णित बाँझ microtome ब्लेड और समाधान (चित्रा 3 ए, बी, और सी) का उपयोग कर का उपयोग संसाधित किया गया। इस अध्ययन के लक्ष्य को सफलतापूर्वक समय है कि माल जमा किया गया था में उपस्थित सूक्ष्म समुदायों निर्धारित करने के लिए जमे हुए नमूनों से अंतर्जात न्यूक्लिक एसिड निकालने के लिए किया गया था। परिशोधन प्रोटोकॉल Serratia marcescens का एक पतला संस्कृति के साथ कोर डोपिंग और फिर जांच के विकास के लिए पिछाड़ी पेट्री प्लेटों द्वारा मूल्यांकन किया गया थाएर कोर 31 इलाज किया गया। एस के अभाव marcescens कालोनियों संकेत दिया कि exogenous सूक्ष्मजीवों ठीक से कोर के बाहरी हिस्से से हटा दिया गया। हालांकि, कालोनियों के अभाव का संकेत नहीं होता है कि क्या exogenous डीएनए कोर के बाहरी हिस्से से हटा दिया गया था। इसलिए, हम Serratia सपा से डीएनए जांच करने के लिए आइस कोर से नमूने अनुक्रम। क्योंकि बर्फ कील में माइक्रोबियल बहुतायत होने की संभावना काफी permafrost की तुलना में कम था, हम एस से डीएनए यदि निर्धारित करने के लिए आइस कोर का इस्तेमाल किया marcescens वर्तमान परिशोधन प्रोटोकॉल का पालन किया जाएगा। कोर ठीक से decontaminated नहीं कर रहे थे, तो एस से संबंधित दृश्यों marcescens नमूनों में उपस्थित होने के लिए उम्मीद होगी। चित्रा 4 -16 rRNA जीन अनुक्रमण परिणामों से आइस कोर के भीतर कम जीवाणु विविधता को दर्शाता है। स्यूडोमोनास सपा से संबंधित दृश्यों।, जाति Gammaproteobacteria की, बर्फ sampl बोलबालातों। Planctomycetia से संबंधित सदस्यों को भी बर्फ में मौजूद है, लेकिन एक हद तक कम करने के लिए थे। विशेष ध्यान दें सुझाव है कि परिशोधन प्रोटोकॉल पर्याप्त exogenous डीएनए हटा दिया, अनुक्रमण परिणामों में Serratia सपा का अभाव है।।

इसके अलावा, वहाँ न्यूक्लिक एसिड की निकासी के दौरान प्रदूषण का एक अतिरिक्त खतरा नहीं है। नकारात्मक निकासी कारतूस बहिर्जात न्यूक्लिक एसिड से प्रदूषण को प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया। नमूने और नकारात्मक नियंत्रण से डीएनए qPCR का उपयोग परिलक्षित किया गया। qPCR आंकड़ों से पता चला है कि permafrost शरण बैक्टीरिया, लेकिन जीव permafrost (तालिका 1) में पता नहीं थे। सफल परिशोधन आगे नियंत्रण के सकारात्मक प्रवर्धन के साथ संयोजन के रूप में, निकासी रिक्त स्थान को जीवाणु या अर्चेअल amplicons की कमी इसका सबूत था, स्यूडोमोनास fluorescens और Halobacterium salinarum (तालिका 1)। abundमंजूरी माप से पता चला है कि वहाँ कोर पोर्टल से 35 मीटर की ऊंचाई पर एकत्र बीच बैक्टीरियल बहुतायत में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे कि 60 मीटर कोर (तालिका 1) की तुलना में। चल रहे शोध निर्धारित करने के लिए कि क्या माइक्रोबियल समुदाय रचना कोर के बीच अलग था आयोजित किया जा रहा है।

आकृति 1
फेयरबैंक्स के पास चित्रा 1. नमूना साइटों, एके। (ए) फेयरबैंक्स, अलास्का (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (बी) ERDC-CRREL Permafrost सुरंग, (सी) के संग्रह के मानचित्र SIPRE बरमा, (डी) बरमा के मद्देनजर प्रवेश करने permafrost दीवार, और (ई) अभिलेखीय के लिए कोर तैयारी का उपयोग कर permafrost कोर। देखें एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा के सायन।

चित्र 2
चित्रा 2. जमे हुए सामग्री decontaminating के योजनाबद्ध। (ए) जमे हुए सामग्री (जैसे, आइस कोर या कोर permafrost) एक ठंडे कमरे में कार्रवाई की है। (ख) यह उद्देश्यपूर्ण एक जीवाणु संस्कृति के साथ दूषित है। (सी) कोर एक बाँझ microtome ब्लेड के साथ बाल काटे है बाहरी 5 मिमी हिस्से को हटाने के लिए। (डी) समाधान की एक श्रृंखला आगे नमूना के बाहरी हिस्से को शुद्ध करने के लिए लागू कर रहे हैं। डीडीएस डीएनए परिशोधन समाधान इंगित करता है और आरडीएस RNase परिशोधन समाधान इंगित करता है। (ई) आरटी पर आयोजित एक बाँझ biohood में कोर रखकर, सामग्री के बाहरी 2-5 मिमी thaws। तरल है कि बर्फ या permafrost से भरी पेट्री प्लेटों में एकत्र किया जाता है और कोर swabbed है और कहा कि जांच करने के लिए चढ़ाया कोर ठीक से decontaminated किया गया था। (एफ और जी) बैक्टीरिया विकास का पता नहीं है, तो कोर एक बाँझ कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर thawed है। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. बाँझ शर्तों के तहत ठंडे कमरे में permafrost कोर के परिशोधन। (ए) scraping द्वारा एक धातु microtome ब्लेड के साथ permafrost कोर की बाहरी परत निकालें। (बी) के एक परिमार्जन के एक करीब देखने। (सी) समाधान कुल्ला कोर की बाहरी परत शुद्ध करना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 4
चित्रा 4. बर्फ कील नमूनों से माइक्रोबियल दृश्यों। बार प्रतिशत से बर्फ कील नमूनों में मौजूद जीवाणु संघों की औसत रिश्तेदार बहुतायत दिखा चार्ट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1 permafrost में बैक्टीरियल बहुतायत। Permafrost नमूने में बैक्टीरिया और संबद्ध निकासी कारतूस की बहुतायत दिखा qPCR का परिणाम है। तालिका में मूल्यों मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं। एन नमूने की संख्या है। एनडी नहीं पाया इंगित करता है।

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Discussion

cryosphere संरक्षित जीवों कि पिछले पर्यावरणीय परिस्थितियों में कायम करने के लिए पहुँच प्रदान करता है। हालांकि बरामद taxa पूरा ऐतिहासिक समुदाय का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं, बर्फ बर्फ और permafrost नमूनों के विश्लेषण से बरामद उन चुनिंदा समय अवधि 15-16 के बारे में महत्वपूर्ण ऐतिहासिक जानकारी उपज कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, सार्थक जैविक जानकारी ग्रीनलैंड बर्फ की चादर 20 में अवायवीय गतिविधि की जांच कर बर्फ के अध्ययन और permafrost अध्ययनों पिघलना 33 का एक परिणाम के रूप में कार्बन साइकिल प्रक्रियाओं की जांच से तैयार किया गया है और Beringia 16 में permafrost से फंगल विविधता में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। उचित नमूना संग्रह और परिशोधन से पहले हो जाना चाहिए नीचे की ओर का आयोजन इन जमे हुए माल के भीतर जैविक समुदायों की जांच करने का विश्लेषण करती है। हालांकि इन चरणों डेटा की व्याख्या पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, कई अध्ययनों कैसे नमूने w पर विशिष्ट विवरण प्रस्ताव नहीं हैअरे एकत्र और प्रसंस्कृत या छवियों को कैसे जमे हुए माल को संभालने के लिए दिखा। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों, फ्लोरोसेंट microspheres या ज्ञात बैक्टीरिया 15 के साथ कोर के बाहरी हिस्से को डाल दिया गया है, हालांकि इन सामग्रियों की सटीक सांद्रता वर्णित नहीं कर रहे थे। अन्य अध्ययनों में विस्तार से परिशोधन प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, लेकिन उच्च throughput कार्यप्रणाली 15, 32 की प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए विश्लेषण लागू नहीं किया है। इसलिए, अक्षत बैक्टीरिया और पेट्री प्लेटें और qPCR पर विकास के माध्यम से exogenous डीएनए की एक विस्तृत जांच के लिए कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था नमूना संग्रह, संरक्षण, और विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं पर्याप्त बाँझ जमे हुए माल में मौजूद सूक्ष्म समुदायों की पहचान करने के लिए थे।

इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक प्राचीन कोर से ब्याज की आनुवंशिक सामग्री को अलग-थलग करने के लिए संशोधित किया गया है। ऐसे विशिष्ट गियर पहने और आपूर्ति decontaminating संग्रह, प्रसंस्करण, और निकालने के दौरान लिया जाना चाहिए के रूप में ध्यानसंदूषण के बाद कोर से आयन किसी भी कदम पर हो सकता है। इसके अलावा, सूखी बर्फ या एक तुलनीय ठंडा एजेंट के साथ कोर शिपिंग जरूरी है, तो कोर पारगमन के दौरान पिघलना, तो वहाँ एक उच्च प्रवृत्ति है कि कोर के बाहरी क्षेत्र से दूषित पदार्थों को कोर के भीतरी भाग की ओर पलायन हो सकता है, क्योंकि है। आगे संदूषण के लिए क्षमता को कम करने के लिए, एक धक्का कोर के बजाय एक मोटर चालित बरमा के साथ बड़ा कोर इकट्ठा करने पर विचार करें। हमने पाया है कि धक्का कोर भी ठीक से स्क्रैप कदम में शुद्ध करना छोटे थे। वैकल्पिक रूप से, नमूने की एक बड़ी मात्रा में बड़ा कोर, जो जैविक सामग्री का एक कम बहुतायत के साथ नमूने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है से निकाला जा सकता है। इसके अतिरिक्त, बड़ी मात्रा में त्रुटि के लिए और अधिक कमरे हैं कि इस तरह Serratia marcescens कालोनियों प्लेटों पर पता चला रहे हैं, तो कोर काफी बड़े फिर से संसाधित किया जा रहा है देता है।

विभिन्न आपूर्ति सबसे कुशल निर्धारित करने के लिए परीक्षण किया गयाविधि कोर शुद्ध करना। उदाहरण के लिए, बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी, के बजाय कांच के बर्तन या प्लास्टिक सामग्री, कोर के लिए अनुमति जल्दी और आसानी से एक बाँझ सतह पर रखा जाएगा। इसके अलावा, गैर पारंपरिक और इस तरह एक धातु रैक के रूप में की आपूर्ति एक ट्रे स्क्रैप बाहरी सामग्री कोर से दूर जमा करने के लिए अनुमति देने के लिए फायदेमंद साबित हुई, फिर से दूषित कोर के जोखिम को कम। प्रोटोकॉल के पहले पुनरावृत्तियों में, scraping एक फ्लैट सतह है, जो संक्रमण के जोखिम में वृद्धि हुई है पर हुई। अंत में, बाँझ बैग, बल्कि कांच के बर्तन की तुलना में, मिश्रण और नमूने के भंडारण के लिए अनुकूल होना पाया गया है।

इस प्रोटोकॉल जमे हुए कोर के बाहरी हिस्से पर सूक्ष्मजीवों और न्यूक्लिक एसिड को खत्म करने का निशाना बनाया गया था। isopropanol और इथेनॉल प्रभावी कीटाणुनाशक हैं, वे न्यूक्लिक एसिड दूर नहीं है। इसलिए, समाधान है कि न्यूक्लिक एसिड और कोर के बाहरी हिस्से से जुड़े एंजाइमों को हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया। ये समाधानमाहौल आमतौर पर प्रयोगशाला की आपूर्ति और उपकरणों से न्यूक्लिक एसिड और जुड़े न्युक्लिअसिज़ दूर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जब प्रयोगशाला सतहों पर उनकी प्रभावकारिता परीक्षण, आरएनए परिशोधन समाधान डीएनए परिशोधन समाधान 34 से भी अधिक बहिर्जात सामग्री हटा दिया। कोर के बाहरी हिस्से को शुद्ध करना न्युक्लिअसिज़ का प्रयोग हमेशा पसंदीदा तरीका नहीं हो सकता है क्योंकि ब्याज की आनुवंशिक सामग्री भी एक विशेष जीव की एक कम बहुतायत के साथ नमूनों से हटाया जा सकता है। विशेष रूप से, आनुवंशिक समय की विस्तारित अवधि के लिए permafrost और बर्फ में संग्रहीत सामग्री गिरावट से गुजरना। क्योंकि सूक्ष्मजीवों इन अलास्का नमूनों में एक उच्च बहुतायत में हैं, चिंता यह है कि समाधान अंतर्जात आनुवंशिक सामग्री की एक उच्च अनुपात को दूर करेगा बहुत कम हो गया था। हालांकि, सतर्कता जब सुनिश्चित करने के लिए कि न्यूक्लिक एसिड होता है जो कम बहुतायत में जीवों से गंभीर रूप से अपमानित किया गया है या कर रहे हैं से नहीं हटा रहे हैं कि समाधान न्युक्लिअसिज़ रोकने का उपयोग कर लिया जाना चाहिएन्युक्लिअसिज़।

एस के अभाव पेट्री प्लेटों पर marcescens कालोनियों आत्मविश्वास प्रदान की है कि कोशिकाओं बरकरार permafrost कोर के बाहरी हिस्से से हटा दिया गया। इसके अलावा, आइस कोर कि एक ही प्रोटोकॉल कराना पड़ा के विश्लेषण नहीं detectable एस से संबंधित दृश्यों से पता चला marcescens। अनुक्रम परिणामों से पता चला है कि केवल स्यूडोमोनास भी दोनों स्यूडोमोनास सपा हालांकि, इन नमूनों में पाया गया। और Serratia सपा। कक्षा Gammaproteobacteria के भीतर हैं। साथ में, एस के अभाव पेट्री प्लेटें और qPCR से डीएनए amplicons की अनुपस्थिति पर marcescens कालोनियों का सुझाव है कि जमे हुए कोर सफलतापूर्वक decontaminated थे। इसलिए, का पता चला सूक्ष्मजीवों की संभावना जमे हुए माल में, ड्रिलिंग या कोर प्रसंस्करण से नहीं बल्कि संदूषण से एम्बेडेड थे। अन्य ड्रिलिंग तकनीक हाइड्रोलिक ड्रिलिंग अधिक से अधिक गहराई पर मिट्टी या बर्फ घुसना करने के लिए शामिल हैं। हालांकि इस विधि woulइन oligotrophic वातावरण में कम माइक्रोबियल बहुतायत की जांच के लिए फायदेमंद होगी, यह खुलासा नहीं करता है कि क्या ड्रिलिंग तरल पदार्थ को सफलतापूर्वक हटा दिया जाएगा। इसके अलावा, अगर उच्च throughput अनुक्रमण बहाव के विश्लेषण का हिस्सा नहीं है, विशिष्ट पीसीआर प्रतिक्रियाओं को निशाना एस marcescens निकाले डीएनए बढ़ाना इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

हमारे उदाहरण डाटासेट से नतीजे बताते हैं कि अक्षुण्ण जीनोमिक डीएनए सफलतापूर्वक जमे हुए माल से निकाला गया था। इसके अलावा, दोनों permafrost और बर्फ कील शरण बैक्टीरिया, के रूप में qPCR और अनुक्रमण क्रमश: इसका सबूत है। इस अध्ययन से अलास्का असंतत permafrost, कनाडा के उच्च आर्कटिक 35 में permafrost के रूप में इसी तरह के जीवाणु संख्या निहित हालांकि अलास्का नमूने किंघाई प्रांत में तिब्बती पठार, चीन 36 और से सक्रिय परत / permafrost मिट्टी से permafrost से परिमाण कम बैक्टीरिया के एक आदेश निहित नुनावुत, कनाडा 37। एक मैं करने के लिए इसी तरह केसीई कील नुनावुत, कनाडा 37 में एकत्र, जो मिट्टी के लिए आम है और पाचन विविध रहे हैं Gammaproteobacteria से संबंधित है, विशेष रूप से स्यूडोमोनास दृश्यों, इस अध्ययन में अलास्का बर्फ कील बोलबाला है। वास्तव में, कतायामा एट अल। संघो ERDC-CRREL Permafrost सुरंग से बर्फ wedges में से एक से Actinobacteria, बेसिली, और Gammaproteobacteria के भीतर 11 अलग बैक्टीरिया। ये अध्ययन इस अध्ययन में Gammaproteobacteria का पता लगाने की पुष्टि। Planctomycetia, जो जलीय नमूना के लिए आम हैं, भी बर्फ कील में पाया गया। इन जीवों किंघाई, चीन 39 में तिब्बती पठार में permafrost करने के लिए पूर्वोत्तर साइबेरिया 38 में permafrost ऊपर सक्रिय परत मिट्टी में मिला दिया गया है, इसके अलावा में।

कई अध्ययनों से धारणा है कि permafrost thaws के रूप में, methanogens की संभावना अधिक सक्रिय हो जाते हैं, योगदान के साथ permafrost में, आर्किया, विशेष रूप से methanogens की उपस्थिति की जांच की है,माहौल 21, 33-34 के लिए मीथेन की तपका buting। हैरानी की बात है, आर्किया अलास्का बर्फ कील या permafrost नमूने हालांकि दोनों Euryarchaeota और Crenarchaeota कनाडा के उच्च आर्कटिक 17 से permafrost में पाए गए और methanogens रूस के 21 में आर्कटिक टुंड्रा से permafrost नमूनों में पाया गया में पता नहीं थे।

जमे हुए माल प्राचीन सूक्ष्मजीवों बंदरगाह, biogeochemical प्रक्रियाओं है कि पहले कई वर्षों के हजारों हुई एक रिकार्ड उपलब्ध कराने के। जब जमे हुए माल गल क्योंकि सूक्ष्मजीवों कि एक बार cryosphere वातावरण में प्रतिबंधित किया गया मुक्त हो सकता है यह जैव विविधता वर्तमान जलवायु वार्मिंग शासन के तहत महान ब्याज की है। आदेश आत्मविश्वास से जैव विविधता इन जमे हुए माल में शरण की पहचान करने के लिए, जमे हुए मिट्टी और बर्फ के नमूने ठीक से संभाला और decontaminated किया जाना चाहिए। यहाँ, हम ensu के लिए जमे हुए नमूनों से विदेशी कोशिकाओं और डीएनए निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुतफिर से कि सूक्ष्म जीवाणुओं का पता चला ड्रिलिंग या कोर प्रसंस्करण से नहीं बल्कि संदूषण से, सामग्री से थे।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Auger Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% Isopropanol Walmart 551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7010
RNase decontamination solution, RNase Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA  7002
Light Duty Suits Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 10606
Nitrile Gloves Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FFS-700
Antiviral Masks Curad, Walgreens CUR3845
Sterile Sample Bags  Nasco, Fort Atkinson, WI B01445
Steel Microtome Blade  B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal Rack Fabricated at CRREL, Hanover, NH
Tray Handy Paint Products, Chanhassen, MN 7500-CC
Aluminum Foil Western Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter Corning, Corning, NY 430513
Serratia marcescens ATCC, Manassas, VA 17991
Biosafety Hood NuAire, Plymouth, MN NU-425-400
Petri Dish Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone Acros Organics, NJ 61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
ATCC Agar 181- Agar Difco, Sparks, MD 214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 12224-50
Ear Protection Elvex EP-201
Hard Hat
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34705
Glass Wool Pyrex 430330
Ruler
Weighing Tin  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-732-100
Sodium chloride Sigma Aldrich, St Louis, MO S-9625
Potassium chloride JT Baker, Phillipsburg, NJ 3040-04
Potassium phosphate, monobasic JT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Potassium phosphate, dibasic JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes Corning, Corning, NY 4558
2 ml Microcentrifuge Tubes MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13113-50
Scoopula Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE 1437520
Balance Ohaus, Parsippany, NJ E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich, St Louis, MO D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)  Acros Organics, NJ 22716-5000
Polyethylene glycol 8000  Sigma Aldrich, St Louis, MO P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1752-400
Centrifuge Eppendorf, Hauppauge, NY 5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) Sigma Aldrich, St Louis, MO C0549-1PT
TE Buffer Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE AM9860
Pipets Rainin, Woburn, MA Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tips Rainin, Woburn, MA Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
Vortexor Scientific Industries, Bohemia, NY G-560
Vortex Adaptor MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13000-V1
Clear Bottle Corning, Corning, NY C1395500
Amber Bottle Corning, Corning, NY C5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µm Corning, Corning, NY 430513
60 ml Syringe Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm EMD Millipore, Billerica, MA SLGV033RB
70% Ethanol Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP2818-500 diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 151030511
Cell Spreader Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-100-10
Disposable Inoculating Loops Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-363-602

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 113 permafrost आइस कोर माइक्रोबियल समुदायों परिशोधन qPCR मिट्टी बैक्टीरिया आर्किया
जमे हुए कोर के बाहरी हिस्से से Exogenous सामग्री को हटाने प्राचीन जैविक समुदायों शरण के अंदर जांच करने के लिए
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Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N.,… More

Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).

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