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Biology

Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d'enquêter sur l'Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur

doi: 10.3791/54091 Published: July 3, 2016

Summary

La cryosphère offre un accès à des organismes préservés qui ont persisté dans des conditions environnementales passées. Un protocole est présenté à recueillir et à décontaminer les carottes de pergélisol des sols et de la glace. L'absence de colonies exogènes et de l'ADN suggèrent que les micro-organismes détectés représentent la matière, plutôt que la contamination par le forage ou le traitement.

Introduction

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La cryosphère (par exemple, les sols du pergélisol, les caractéristiques de la glace, la neige glaciaire, névé et glace) offre un aperçu de ce que les types d'organismes persisté dans des conditions environnementales passées. Étant donné que ces substrats peuvent être des dizaines à des centaines de milliers d'années, leurs communautés microbiennes, lorsque conservés, congelés depuis le dépôt, tenir compte des conditions environnementales anciennes. Pour analyser correctement ces écosystèmes et d'extraire l'information biologique significative des sols gelés et de la glace, une bonne collecte et le traitement des échantillons congelés est nécessaire. Ceci est d'une importance capitale que les projections climatiques pour le 21 ème siècle , indiquent la possibilité d'un réchauffement prononcé dans les régions arctiques et subarctiques 1. Plus précisément, l' intérieur de l' Alaska et le Groenland devraient se réchauffer à environ 5 ° C et 7 ° C, respectivement en 2100 2,3. Cela devrait avoir un impact significatif sol et les communautés microbiennes aquatiques et, par conséquent, liéles processus biogéochimiques. On prévoit que les températures plus chaudes et régime des précipitations modifié pour initier la dégradation du pergélisol dans de nombreux domaines 2-5 conduisant potentiellement à un plus épais, décongelé saisonnièrement (actif) couche 6,7, la fonte des sols gelés, et la fonte des masses de glace massifs tels que glace au sol, des coins de glace, et la ségrégation de la glace 8. Cela changerait radicalement les attributs biogéochimiques en plus de la biodiversité des plantes et des animaux dans ces écosystèmes.

glaciaires et du pergélisol sédiments et de glace caractéristiques syngénétiques ont piégé chimique et des preuves biologiques d'un environnement qui représente ce qui y vivait au moment où les caractéristiques formées. Par exemple, dans l'intérieur de l'Alaska, à la fois Illinoisan et le Wisconsin permafrost âgés sont présents et ce pergélisol, en particulier fournit des endroits uniques datant de moderne à 150.000 ans avant le présent (YBP) qui contiennent des preuves biologiques et géochimiques de l'impact des changements climatiques passés sur la biodiversité. Par conséquent, ces sédiments fournissent un enregistrement de la biogéochimie et de la biodiversité sur plusieurs milliers d'années. Étant donné que la région a faibles taux de sédimentation et n'a jamais été englacée, des échantillons intacts sont accessibles pour la collecte et l'analyse, soit le forage verticalement dans le profil du sol ou de forage horizontal dans les tunnels. Plus important encore , nombreux documents existent qui en particulier mettre en évidence les caractéristiques biogéochimiques uniques du pergélisol dans cette région 9-14. Plus précisément, l'application de l'analyse d'ADN pour estimer la présence et l'étendue de la biodiversité dans les deux échantillons de glace et pergélisol existants et anciens permet l'exploration du lien entre les conditions environnementales anciennes et de l'habitat à l'occupation par des organismes spécifiques.

Des études précédentes ont identifié des impacts climatiques sur les mammifères, les plantes et les micro - organismes à partir d' échantillons datant de 50k YBP 11, 15-19, bien que chaque étude a utilisé un differeméthodologie nt à recueillir et à décontaminer les pergélisol ou les carottes de glace. Dans certains cas, les carottes de forage ont été stérilisées 16, 20-21, bien que la méthodologie spécifique n'a pas précisé si les acides nucléiques étrangers ont également été éliminés des échantillons. Dans d' autres études, 15 isolats bactériens (par exemple, Serratia marcescens), ainsi que des microsphères fluorescentes 22 ont été utilisées pour mesurer l'efficacité des procédures de décontamination.

Cette expérience faisait partie d'une étude plus vaste enquête sur les communautés microbiennes à partir d'échantillons de pergélisol remontant à environ 40k YBP. L'objectif spécifique de cette partie de l'étude était de décontaminer avec succès la glace et pergélisol noyaux. À notre connaissance, aucune méthodologie a intégré l'utilisation de solutions conçues pour éliminer les acides nucléiques étrangers et nucléases associés de la partie extérieure des noyaux congelés. Ceci en dépit du fait que ces solutions sont commonly utilisée pour décontaminer l'équipement de laboratoire pour des expériences moléculaires.

Une fois que les noyaux ont été décontaminés, l' ADN génomique a été extrait en utilisant les protocoles mis au point par Griffiths et al. , Et 23 Töwe et al. , 24, quantifié en utilisant un spectrophotomètre, et dilué avec de l' eau stérile, exempte d' ADN pour obtenir 20 ng par réaction. Bactériennes gènes 16S ARNr ont été amplifiés avec des amorces 331F et 797R et sonde BacTaq 25 et 16S archées gènes ARNr ont été amplifiés avec des amorces Arc 349F et Arch 806R sonde et TM Arche 516F 26 dans les conditions suivantes: 95 ° C pendant 600 secondes , suivie de 45 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 57 ° C pendant 60 s et 72 ° C pendant 25 secondes avec une extension finale à 40 ° C pendant 30 secondes. Toutes les réactions de qPCR ont été réalisées en double. Les 20 volumes de réaction de 20 ul inclus ng d'ADN, 10 uM d'amorces, 5 pM de la sonde, et 10 pi de mélange réactionnel de PCR quantitative. normes for qPCR bactérienne et Archaea ont été préparés en utilisant l' ADN génomique de Pseudomonas fluorescens et Halobacterium salinarum, respectivement. Les deux ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique. Chiffres de plaques ont été réalisées et l'ADN a été isolé à partir des cultures. L' ADN génomique a été quantifiée avec un spectrophotomètre avec l'hypothèse d'une et six copies du gène de l' ARNr 16S par génome de H. salinarum et P. fluorescens, respectivement 27-28. le nombre de copies des gènes bactériens et archées ont été calculées sur la base de la courbe standard, log-transformées pour tenir compte des variances inégales entre les traitements, et évalués par ANOVA.

Composition de la Communauté a été déterminée par séquençage du gène de l' ARNr 16S en utilisant des cellules d'écoulement et les technologies d'amplification en pont et en analysant les collectivités 'connaissances quantitatives en écologie microbienne »(29) QIIME. Avant et arrière se lit ont été jointes ensemble et ensuite séquences ont été filtrés, indexés,et des représentants de haute qualité ont été sélectionnés pour l'attribution de novo unités taxonomiques opérationnelles (OTU) par l'alignement de séquence avec une base de données de référence. séquences alignés ont été comparés à une base de données de référence séparée pour l'affectation taxonomique. Une table de OTU niveau phylum a été créé pour déterminer la composition de la communauté générale.

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Protocol

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Équipement 1. Préparation et Permafrost Core Collection

  1. préparation de l'équipement et le prélèvement d'échantillons sur le terrain et des engins de conservation
    1. Assembler tarière pour le prélèvement d'échantillons en insérant l'adaptateur d'entraînement dans la partie supérieure du corps et tourner le levier pour le verrouiller en place. Pin le tube adaptateur sur l'adaptateur d'entraînement et la broche du moteur sur le tube de l'adaptateur. Insérer les éléments de coupe sur le canon.
    2. Porter des costumes utilitaires légers, des gants en nitrile, et des masques pour réduire toute contamination des échantillons. Porter une protection auditive et un casque pour la sécurité à l' entrée du tunnel Permafrost (figure 1).
    3. Entrez dans le tunnel et sélectionnez un emplacement pour recueillir les échantillons (figure 1B).
      Remarque: Pour l' emplacement vertical ou horizontal de forage, sélectionnez une zone où il est connu preuve que le matériel est congelé (par exemple, la glace ou pergélisol), il n'y a pas de systèmes à grande racine connus, et il n'y a pas de gravier connue. Enlever toutmatériel végétal vivant de la région avant de recueillir un échantillon. Si le forage verticalement ou horizontalement, sélectionnez une zone qui est relativement plat et accessible avec la vis sans fin.
    4. Préparer un poste de travail en superposant le sol avec une matière plastique qui a été stérilisé à l'isopropanol à 70%, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    5. Placez un 10 cm de chlorure diamètre de polyvinyle (PVC) coupé en deux sur la longueur sur le poste de travail pour fournir un bac pour contenir les noyaux car ils sont retirés de la vis sans fin. Décontaminer le tuyau en PVC avec 70% d'isopropanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    6. Près de la station de travail, décontaminer la tarière par pulvérisation avec 70% d'isopropanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase. Retirer les solutions de la vis sans fin avec une lingette.
  2. Ice et le pergélisol collecte et le stockage de base
    1. Sélectionnez une zone de la paroi de l'échantillon (voir 1.2.1Remarque).
    2. Décontaminer environ 10 cm de diamètre de la zone de la paroi gelée en l'essuyant avec 70% d'isopropanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    3. Surélever la tarière décontaminé à la zone d'intérêt de telle sorte qu'elle est perpendiculaire à la surface de l' échantillon et de commencer le forage dans le visage nettoyé de la paroi (figure 1C, D).
    4. Retirez délicatement la vis sans fin de la zone de prélèvement d'échantillon. Débrancher la vis du moteur et placer la vis au-dessus du tuyau en PVC stérile dans la station de travail propre. Inclinez doucement tarière de telle sorte que les noyaux congelés coulissent sur ​​le tuyau de PVC stérile (figure 1E).
    5. Décontaminer les gants avec 70% d'isopropanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    6. Ramassez la glace et pergélisol noyaux avec des gants stériles et de les placer dans des sacs stériles.
    7. Placer les carottes dans une chambre froide ou froide jusqu'à ce qu'ils soient expédiés ou transformés.
    8. ship les noyaux congelés à l'aide de glace sèche pour les maintenir à une température inférieure à 0 ° C.
    9. stocker immédiatement les noyaux à -80 ° C.

2. Permafrost and Ice traitement de base

  1. Préparation du matériel
    1. Préparer, sans feuille stérile d'acide nucléique robuste en aluminium, étagères métalliques, verrerie, pinces métalliques, et de la laine de verre par cuisson dans un four à 450 ° C pendant 4 heures. Mettez de côté ces matériaux jusqu'à leur utilisation.
    2. Stériliser 95% d'éthanol et de l'eau ultrapure en faisant passer les solutions à travers un filtre de 0,22 um.
    3. solution d'éthanol de magasin à -20 ° C et de l'eau à 4 ° C.
    4. Stériliser une règle en plastique par pulvérisation avec 70% d'éthanol, une solution d'ADN de décontamination et la solution de décontamination RNase et en essuyant immédiatement après chaque solution.
  2. Culture bactérienne Préparation
    1. Préparer le bouillon et les plaques à croître Serratia marcescens.
      1. Pour le bouillon, mélanger 5 g essayerptone, 1 g de glucose, 5 g d'extrait de levure et 1 g de phosphate de potassium dibasique et de l'eau puis distillée pour atteindre add 1 L. Pour fabriquer des plaques, ajouter 15 g d'agar au mélange ci-dessus. Pour bouillon et plaques, ajuster le pH à 7 et autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
    2. Préparer 1x solution saline de phosphate meulé (PBS) en combinant 8 g de chlorure de sodium, 0,2 g de chlorure de potassium, 1,44 g de phosphate dibasique de sodium et 0,24 g de phosphate de potassium monobasique et d'ajouter de l'eau distillée pour atteindre 800 ml. Ajuster le pH à 7,4 et ajouter de l'eau distillée pour atteindre 1 L. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
    3. Ensemencer le bouillon avec une boucle stérile en plongeant dans la S. culture marcescens qui a déjà été stocké congelé à -80 ° C. Dans des conditions aseptiques, la culture diluée en série en ajoutant 1 ml de la culture à 9 ml de PBS et inverser manuellement la solution. Ajouter 1 ml de cette dilution dans 9 ml de PBS et inverser manuellement la solution. Répétez huit autres fois jusqu'à ce qu'une dilu 10 -9tion est atteinte.
    4. Répartir les 10 -6, -7 10, 10 -8 et 10 -9 solutions sur des plaques de gélose en distribuant 1 ml de bouillon sur la plaque et la diffusion avec un épandeur cellulaire. Pour ce faire, en triple exemplaire par dilution. Conserver la culture d'origine à 4 ° C.
    5. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 24 heures. Compter le nombre de colonies pour calculer le nombre de cellules dans la culture d'origine. Note: Le nombre de colonies dans la culture d'origine dépendra du taux de bactéries de croissance.
    6. Pipet 250 ul de la culture d'origine dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile. Diluer la culture d' origine en ajoutant un volume suffisant du 1 x PBS pour obtenir environ 10 9 cellules / ml , comme déterminé par comptage des colonies dans l'étape précédente. Sédimenter les cellules dans un tube de microcentrifugation par centrifugation à 2500 xg pendant 10 min.
      Remarque: Le volume de PBS 1x variera en fonction du taux de bactéries de croissance.
    7. Dans un biohood stérile, Pipeter hors du bouillon et remettre les cellules dans 1 ml 1x tampon PBS. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation ou environ deux mois.
    8. Le jour du traitement, on dilue le S. la culture de l' étape 2.2.7 marcescens par addition de 1 ml de S. originale marcescens culture à 39 ml de PBS 1x tampon dans un tube de centrifugation de 50 ml.
  3. Préparer l'espace de chambre froide pour le traitement de base et du matériel de conservation
    1. Avant de refroidissement de la chambre froide, nettoyer les murs, les planchers, et table en métal avec une solution d'eau de Javel à 1%.
    2. Réglez la température de la chambre froide à environ -11 ° C.
    3. Une fois que la chambre froide a atteint la température désirée, porter des vêtements légers de service, des gants en nitrile, et des masques pour réduire toute contamination de la chambre froide et les échantillons.
      Note: Deux individus bien habillés sont nécessaires pour cette procédure.
    4. Apportez les matériaux stériles (par exemple, une feuille d'aluminium, étagères métalliques, verrerie, plateau, S. marcescens culture et milame crotome) et des échantillons dans la chambre froide et les placer sur la table stérile.
  4. Permafrost et de la glace de traitement de base dans une installation de chambre froide
    1. Placer un noyau de pergélisol sur la libre une feuille stérile, d'acide nucléique de papier d'aluminium.
    2. Légèrement inoculer à l'extérieur du noyau avec la culture diluée de S. marcescens en utilisant un bouchon de mousse stérile (figure 2B).
    3. Placer le noyau sur la grille métallique stérile qui se trouve au-dessus d'un bac.
    4. Stériliser la lame de microtome en acier avec 70% d'éthanol, une solution d'ADN de décontamination et la solution de décontamination RNase.
    5. Avoir un nitrile individuel propre gants avec 70% d'éthanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase et maintenez-core à un angle de 45 ° au-dessus du plateau.
    6. Avoir individuel B gratter doucement environ 5 mm de l'extérieur de l'ensemble de base, y compris les extrémités, en utilisant la lame stérile tandis que la personne A transforme le noyau après chaque scrape ( 3A, B). Essuyer la lame avec 70% d'éthanol, une solution d'ADN de décontamination et la solution de décontamination RNase selon les besoins.
    7. Avoir individuel B verser stérilisée par filtration éthanol à 95% sur le noyau soigneusement et rapidement, tandis que la personne A transforme le noyau que la solution est versée (Figures 2D, 3C).
    8. Avoir individuel B laver immédiatement le noyau avec de l'eau stérilisée par filtration.
    9. Remettre la grille en métal utilisé sur le plateau avec un nouveau support métallique stérile.
    10. Avoir individuel A nettoyer ses gants en nitrile avec 70% d'éthanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase et maintenir le noyau à un angle de 45 ° au-dessus du plateau.
    11. Avoir individuel B pulvériser l'ensemble du noyau avec une solution d'ADN de décontamination.
    12. Avoir individuel B laver immédiatement le noyau avec de l'eau stérilisée par filtration.
    13. Avoir individuel B pulvériser l'ensemble du noyau avec une solution de décontamination RNase.
    14. Avoir Individual B laver immédiatement le noyau avec de l'eau stérilisée par filtration.
    15. Placez le noyau sur une feuille stérile de papier d'aluminium et envelopper légèrement.
  5. noyau externe Thaw
    1. Placer une grille stérile métallique sur un récipient en verre stérile dans un biohood stérile à flux laminaire.
    2. Placer deux plaques d' agar spécifiques à S. marcescens dans le plat en verre au- dessous du support stérile pour recueillir le liquide du noyau (Figure 2F).
    3. Placez le noyau sur la grille métallique stérile.
    4. Laisser environ 2-5 mm de la surface externe du noyau décongeler à 23 ° C (en moyenne, cela aura lieu dans environ 10 min). Tournez le noyau d'environ 90 ° toutes les 2 min.
    5. Swab surface entière du noyau à l' aide de pinces stériles et laine de verre stérile et inoculer deux plaques de gélose spécifique à S. marcescens par écouvillonnage ces matériaux sur la surface des plaques. Inoculer deux nouvelles plaques avec la culture d'origine utilisé pour doper l'extérieur de lanoyau qui a été exposée aux basses températures de la chambre froide.
    6. Mesurer les dimensions extérieures du noyau cylindrique décongelés en plaçant une règle stérile près, mais ne pas toucher le noyau.
    7. Placez le noyau dans un grand sac stérile et le stocker à -80 ° C.
  6. Vérifiez la croissance
    1. Incuber les plaques de gélose à 23 ° C pendant une semaine.
    2. Examiner des plaques d' agar pour la croissance de S. colonies marcescens.
      1. S'il n'y a pas de colonies visibles sur la plaque, passez à l'étape 2.5.3.
      2. Si les colonies apparaissent sur la plaque, répétez l'étape 2.1.1 dans la section 2 "Permafrost et de la glace de traitement de base».
    3. Obtenir le noyau du congélateur et aseptique transférer à un sac stérile.
    4. Conserver le noyau dans un sac stérile à 4 ° C pendant environ 24-48 heures pour dégeler le noyau entier.

3. Obtenir sous-échantillon pour l'extraction des acides nucléiques à partir de carottes de glace et pergélisol

  1. Extraction des acides nucléiques à partir des carottes de glace
    1. Mélanger le matériau décongelé de la carotte de glace en agitant doucement le sac (figure 2G).
    2. Verser le produit décongelé dans un récipient stérile avec un filtre de 0,22 um sous vide pour recueillir les micro-organismes.
    3. retirer le filtre aseptique avec des pinces stériles et placez-le dans un 2 ml tube de perles en céramique stérile (1,4 mm).
    4. Conservez le filtre à -80 ° C.
  2. Extraction des acides nucléiques à partir des carottes de pergélisol
    1. Mélanger le matériau décongelé à partir du noyau de pergélisol en malaxant doucement le sac.
    2. Après le pergélisol a été bien mélangé, obtenir un sous-échantillon d'environ 0,5 g de sol en vrac avec un scoopula stérile et le placer dans un stérile 2 ml tube de perles à vis de capuchon en céramique taré (1,4 mm) qui se trouve à la verticale sur un équilibre.
    3. souséchantillons Conserver à -80 ° C.
    4. Obtenir le contenu d'échantillons d'eau gravimétrique.
      1. Mesurer 10 g du pergélisol avec un sterile scoopula et les placer dans une boîte taré sur une balance. Mesurer la masse humide de pergélisol et de l'étain.
      2. Incuber permafrost dans un four réglé à 105 ° C pendant 24 heures. Mesurer la masse sèche du pergélisol et de l'étain.
      3. Calculer la teneur en eau gravimétrique en soustrayant la masse humide du pergélisol par la masse sèche du pergélisol et en divisant par la masse sèche du pergélisol.
    5. permafrost de magasin à -80 ° C.

4. Extrayez Nucleic Acids de Permafrost and Ice Cores

  1. préparation du matériel
    1. Préparer des fioles ambrées pour maintenir des solutions par traitement avec 0,1% de diéthyle (DEPC), incubation O / N à 37 ° C, et autoclavage.
    2. Préparer une solution de tampon phosphate de potassium 240 mM. 2. ajouter 5 g de phosphate de potassium monobasique et 38,7 g de phosphate de potassium dibasique. Ajuster le volume final à 500 ml par addition d'eau stérile.
    3. Préparer le bromure d'hexadécyltriméthylammonium (CTAB) extraction buffer par dissolution de 4,1 g de chlorure de sodium dans 80 ml d'eau, et en ajoutant lentement 10 g de CTAB tout en chauffant et en agitant. Ajuster le volume final à 100 ml par addition d'eau stérile.
    4. Ajouter des volumes égaux de solution de tampon phosphate et le tampon CTAB et stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 um. Couvrir la bouteille avec du papier d'aluminium et conserver à la température ambiante.
    5. Préparer une solution 1,6 M de chlorure de sodium (NaCl) en combinant de l'eau stérile, 9,35 g de NaCl et 100 ml. Ajouter 10 g de polyéthylèneglycol 8000 à la solution et stériliser par filtration 1,6 M de NaCl. Conserver à 4 ° C.
  2. L' extraction d'acide nucléique selon une version modifiée de Griffiths et al. , Et 22 Töwe et al. 23
    1. Porter des costumes utilitaires légers, des gants en nitrile, et des masques. espace de laboratoire propre et pipettes avec 70% d'éthanol, la solution d'ADN de décontamination, et la solution de décontamination RNase.
    2. Retirer souséchantillon (filtre à partir de carottes de glace ou de l'échantillon de sol permafrost) dans 2 ml perle en céramique vis-catube de p de -80 ° C congélateur et décongeler à la température ambiante.
    3. Ajouter 0,5 ml de bromure d'hexadécyltriméthylammonium (CTAB) tampon d'extraction et de vortex brièvement.
    4. Ajouter 0,5 ml d'alcool phénol-chloroforme-isoamylique (25: 24: 1) (pH 8) et agiter les tubes horizontalement pendant 10 min en utilisant un adaptateur à écran plat sur un vortex.
    5. Après bourrelet battant, des tubes de centrifugation à 16.100 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    6. Enlever la couche aqueuse dans un nouveau tube de 1,5 ml stérile et mélanger avec un volume égal d'alcool chloroforme-isoamylique (24: 1). Centrifugeuse à 16.100 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    7. Enlever la couche aqueuse dans un nouveau tube stérile de 1,5 ml et ajouter deux volumes de 30% de polyéthylène glycol 8000 et 1,6 M de NaCl. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C.
    8. Centrifugeuse à 16.100 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    9. Laver granulés d'acide nucléique avec environ 500 pi de glace froide éthanol à 70% et centrifuger à 16100 xg pendant 10 min à 4 ° C.
    10. Air culot sec dans un biohood stérile pendant 2 heures. Remettre en suspension dans un tampon de 50 ul de DNase / RNase-TE (pH 8,0). L'ADN est prêt pour les applications en aval telles que la PCR et qPCR.
    11. Déterminer la concentration de l'ADN avec un spectrophotomètre.
    12. Diluer l'ADN avec de l'eau stérile, exempte d'ADN pour atteindre 20 ng par réaction.

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Representative Results

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La méthode présentée peut être utilisée pour décontaminer les échantillons congelés prélevés dans divers environnements cryosphère, de la glace glaciaire au pergélisol. Ici, nous présentons des données spécifiquement collectées à partir d' échantillons de glace et pergélisol recueillies à partir de la recherche en génie et Centre de développement - régions froides Laboratoire de recherche et d' ingénierie (ERDC-CRREL) Permafrost Tunnel situé à Fox, AK (figure 1A et 1B). Le tunnel Permafrost étend environ 110 m sur le côté de la vallée de Goldstream et donne accès à la glace riche limon et alluvions 30-31. Les échantillons provenant d'un coin de la glace et le sol gelé ont été soigneusement recueillis en triple des parois du tunnel, le 24 Octobre 2014. Au moment de l'échantillonnage, la température de la paroi du pergélisol était -2.9 ° C. Des échantillons ont été prélevés sur une caractéristique de la glace de coin d'environ 27 m à partir du portail du tunnel, et le sol gelé à 35 m et 60 m dele portail du tunnel (Figure 1C et 1D). Une attention particulière a été prise lors de la collecte d'échantillons pour limiter la contamination de la glace et pergélisol noyaux (figure 1E). Les noyaux congelés ont été traités selon notre protocole de décontamination (Figure 2) et transportés sur de la glace sèche au laboratoire de microbiologie des sols CRREL à Hanovre, NH pour le traitement.

Tous les cœurs ont été traités selon le protocole décrit dans la section 2 en utilisant des lames de microtome stériles et des solutions (figure 3A, B et C). Le but de cette étude était d'extraire avec succès des acides nucléiques endogènes des échantillons congelés pour déterminer les communautés microbiennes présentes au moment où le matériel a été déposé. Le protocole de décontamination a été évaluée par le dopage des noyaux avec une culture diluée de Serratia marcescens, puis en examinant les boîtes de Petri à l' arrière de croissanceer les carottes ont été traités 31. L'absence de S. marcescens colonies ont indiqué que les micro - organismes exogènes ont été correctement supprimés de la partie externe du noyau. Cependant, l'absence de colonies ne serait pas indiquer si un ADN exogène a été retirée de la partie extérieure du noyau. Par conséquent, nous avons séquencé les échantillons de la carotte de glace pour vérifier l' ADN de Serratia sp. Parce que l' abondance microbienne dans la glace coin était probablement significativement plus faible que dans le pergélisol, nous avons utilisé les carottes de glace afin de déterminer si l' ADN de S. marcescens serait présent en suivant le protocole de décontamination. Si les carottes ne sont pas correctement décontaminés, puis des séquences liées à S. marcescens serait prévu pour être présent dans les échantillons. La figure 4 montre la diversité bactérienne faible au sein de la partie centrale de glace à partir d' ARNr 16S résultats du séquençage des gènes. Sequences liés à Pseudomonas sp., Du phylum Gammaproteobacteria, a dominé le sampl de glacees. Les membres liés à Planctomycetia étaient également présents dans la glace, mais dans une moindre mesure. On notera en particulier l'absence de Serratia sp. Dans les résultats du séquençage, ce qui suggère que le protocole de décontamination suffisamment éloignée de l' ADN exogène.

En outre, il existe un risque supplémentaire de contamination lors de l'extraction des acides nucléiques. ébauches d'extraction négatifs ont été utilisés pour révéler la contamination par des acides nucléiques exogènes. L'ADN provenant des échantillons et des témoins négatifs ont été amplifiés en utilisant la qPCR. les données qPCR montrent que le pergélisol bactéries nourrissait, mais archées ne sont pas détectés dans le pergélisol (tableau 1). La décontamination réussie a en outre été mis en évidence par l'absence de amplicons bactériennes ou archées dans des ébauches d'extraction, en conjonction avec une amplification positive des contrôles, Pseudomonas fluorescens et Halobacterium salinarum (tableau 1). Le abunddes mesures d'assu- ont révélé qu'il n'y avait pas de différences significatives dans l' abondance des bactéries entre les carottes prélevées à 35 m du portail par rapport aux noyaux 60 m (tableau 1). Les recherches en cours est menée afin de déterminer si la composition de la communauté microbienne était différente entre les noyaux.

Figure 1
Figure 1. Les sites d'échantillonnage près de Fairbanks, AK. (A) Carte de Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL Permafrost Tunnel, (C) de la collection carottes de pergélisol à l' aide de la vis sans fin SIPRE, (D) vue de vis entrant dans la paroi du pergélisol, et (E) la préparation du noyau pour l' archivage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Schéma de décontamination matériel congelé. (A) Le matériau congelé (par exemple, le noyau de glace ou de noyau de pergélisol) est traitée dans une chambre froide. (B) Il est délibérément contaminé par une culture bactérienne. (C) Le noyau est rasée avec une lame de microtome stérile pour éliminer la partie extérieure de 5 mm. (D) Une série de solutions sont appliquées à décontaminer en outre la partie extérieure de l'échantillon. DDS indique la solution d'ADN de décontamination et RDS indique la solution de décontamination RNase. (E) En plaçant le noyau dans un biohood stérile tenue à la température ambiante, l'extérieur 2-5 mm du matériau dégèle. Le liquide qui coule de la glace ou pergélisol est recueillie dans des boîtes de Pétri et le noyau est frottée et plaqué pour vérifier que le noyau a été correctement décontaminé. (F et G) Si la croissance bactérienne ne soit pas détectée, le noyau est décongelé à 4 ° C dans un récipient stérile. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Décontamination des carottes de pergélisol dans la chambre froide dans des conditions stériles. (A) Retirer la couche externe du noyau de pergélisol avec une lame de microtome métallique par grattage. (B) Une vue rapprochée d'une éraflure. (C) rinçage de la solution pour décontaminer la couche externe du noyau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

contenu "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 4
Figure 4. séquences microbiennes à partir des échantillons de glace en coin. Diagramme à barres montrant l'abondance relative moyenne de phyla bactérienne présente dans les échantillons de glace en forme de coin en pourcentage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1
Tableau 1. abondance bactérienne dans le pergélisol. QPCR résultats montrant l'abondance des bactéries dans les échantillons de pergélisol et les blancs d'extraction associés. Les valeurs du tableau sont présentés sous forme de moyenne ± erreur standard. n est le nombre d'échantillons. ND indique non détecté.

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Discussion

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La cryosphère offre un accès à des organismes préservés qui ont persisté dans des conditions environnementales passées. Bien que les taxons récupéré peut ne pas représenter la communauté historique complète, ceux récupérés à partir de l' analyse des échantillons de glace et pergélisol glaciaires peuvent donner des informations historiques précieuses sur des périodes de temps sélectionnez 15-16. Par exemple, l' information biologique significatif a été établi à partir d' études de glace enquêtant sur ​​des activités anaérobie dans la calotte glaciaire du Groenland 20 et des études pergélisol enquête processus du cycle de carbone à la suite de dégel 33 et ont permis de mieux comprendre la diversité fongique du pergélisol en Béringie 16. la collecte d'échantillons et une décontamination doivent avoir lieu avant de procéder à des analyses en aval pour enquêter sur les communautés biologiques dans ces matériaux gelés. Même si ces mesures ont des répercussions importantes sur l'interprétation des données, de nombreuses études ne proposent pas de détails précis sur la façon dont les échantillons wavant collectées et traitées ou des images montrant comment manipuler les matériaux gelés. Par exemple, des études antérieures ont dopé la partie extérieure de noyaux avec des microsphères fluorescentes ou de bactéries connues 15, bien que la concentration exacte de ces matériaux ne sont pas décrits. D' autres études ont décrit des protocoles de décontamination en détail, mais ne sont pas appliquées à haut débit des analyses pour tester l'efficacité de la méthodologie 15, 32. Par conséquent, un examen détaillé des bactéries intactes et de l' ADN exogène par croissance sur des plaques de Petri et qPCR a été utilisé pour déterminer si la collecte de l'échantillon, la conservation, et les procédures d'analyse ont été assez stérile pour identifier les communautés microbiennes présentes dans les matériaux gelés.

Ce protocole a été modifié avec succès pour isoler le matériel génétique d'intérêt à partir de noyaux anciens. Entretien comme le port de matériel spécifique et la décontamination des fournitures doivent être prises au cours de la collecte, le traitement, et l'extraition des noyaux depuis la contamination peut se produire à chaque étape. En outre, l'expédition des noyaux de glace sèche ou d'un agent de refroidissement comparable est impératif parce que si les noyaux décongeler pendant le transit, alors il y a une propension plus élevée que les contaminants de la région extérieure du noyau peuvent migrer vers la partie intérieure du noyau. Pour réduire davantage le risque de contamination, envisager de recueillir plus gros noyaux avec une tarière motorisée plutôt que d'un noyau de poussée. Nous avons constaté que les noyaux de poussée étaient trop petites pour décontaminer correctement à l'étape de grattage. En variante, un plus grand volume d'échantillon peut être extrait à partir des noyaux plus grands, ce qui est particulièrement important pour les échantillons avec une faible abondance de matériel biologique. En outre, le plus grand volume permet une plus grande marge d'erreur de telle sorte que si Serratia marcescens colonies sont détectées sur des plaques, puis le noyau est suffisamment grande pour être traitée à nouveau.

Diverses fournitures ont été testés afin de déterminer le plus efficaceméthode pour décontaminer les noyaux. Par exemple, une feuille d'aluminium stérile, plutôt que des récipients en verre ou en matières plastiques, a permis à l'âme d'être placés sur une surface stérile rapidement et facilement. En outre, les fournitures non traditionnels tels que un rack en métal et un plateau se sont avérés bénéfiques pour permettre aux matériaux extérieurs grattées d'accumuler loin du centre, ce qui diminue le risque de re-contaminer les noyaux. Dans les itérations précédentes du protocole, le raclage a eu lieu sur une surface plane, ce qui augmente le risque de contamination. Enfin, les sacs stériles, plutôt que plats en verre, se sont révélés favoriser le mélange et le stockage des échantillons.

Ce protocole a été ciblé pour éliminer les micro-organismes et des acides nucléiques sur la partie externe des noyaux congelés. Bien que l'isopropanol et l'éthanol sont des désinfectants efficaces, ils ne suppriment pas les acides nucléiques. Par conséquent, les solutions qui éliminent les acides nucléiques et les enzymes associées à partir de la partie extérieure des noyaux ont été utilisés. Ces solutions sont couramment utilisés pour éliminer les acides nucléiques et les nucléases associés de fournitures et de matériel de laboratoire. Lors du test de leur efficacité sur des surfaces de laboratoire, une solution de décontamination de l' ARN a éliminé les produits exogènes plus que la solution de décontamination de l' ADN 34. Utilisation de nucléases pour décontaminer la partie extérieure du noyau pourrait ne pas être toujours la méthode préférée parce que le matériel génétique d'intérêt peuvent également être retirés à partir d'échantillons avec une faible abondance d'un organisme particulier. En particulier, le matériel génétique stocké dans le pergélisol et la glace pendant des périodes de temps prolongées subissent une dégradation. Parce que les micro-organismes sont dans une grande abondance dans ces échantillons d'Alaska, la crainte que les solutions élimineraient une forte proportion de matériaux génétiques endogènes a été considérablement réduite. Cependant, des précautions doivent être prises lors de l'utilisation des solutions qui contiennent des nucléases pour assurer que les acides nucléiques qui ont été sévèrement dégradées ou sont des organismes à faible abondance ne sont pas éliminés parles nucléases.

L'absence de S. marcescens colonies sur les boîtes de Petri pour autant la certitude que les cellules intactes ont été retirées de la partie externe des noyaux de pergélisol. En outre, l' analyse des carottes de glace qui ont subi le même protocole a montré aucune séquence détectables liés à S. marcescens. Les résultats de la séquence a révélé que seuls Pseudomonas ont été détectés dans ces échantillons, même si les deux Pseudomonas sp. et Serratia sp. sont dans la classe Gammaproteobacteria. Ensemble, l'absence de S. marcescens colonies sur des plaques de Petri et l'absence d'amplicons d'ADN provenant qPCR suggèrent que les noyaux congelés ont été décontaminés avec succès. Par conséquent, les micro-organismes détectés sont probablement noyés dans la matière congelée, plutôt que de la contamination par le forage ou le traitement des noyaux. D'autres techniques de forage comprennent le forage hydraulique pour pénétrer dans le sol ou de la glace à de plus grandes profondeurs. Bien que cette méthode would être bénéfique pour enquêter sur une faible abondance microbienne dans ces environnements oligotrophes, il ne révèle pas si les fluides de forage seraient supprimés. En outre, si le séquençage à haut débit ne fait pas partie de l'analyse en aval, les réactions PCR spécifiques ciblant S. marcescens doivent être utilisées pour amplifier l'ADN extrait.

Les résultats de notre exemple données ont montré que l'ADN génomique intact a été extrait avec succès des matériaux gelés. En outre, les deux coins hébergeaient bactéries du pergélisol et de la glace, comme en témoigne par qPCR et le séquençage, respectivement. Le pergélisol discontinu de l' Alaska à partir de cette étude contenait le nombre de bactéries semblables à celles du pergélisol dans l'Arctique canadien 35, bien que les échantillons d' Alaska contenaient un ordre de grandeur moins de bactéries que le pergélisol du plateau tibétain dans la province du Qinghai, en Chine 36 et actifs sols couche / pergélisol de Nunavut, Canada 37. Semblable à un iCE coin recueilli au Nunavut, Canada 37, des séquences liées à Gammaproteobacteria, en particulier Pseudomonas, qui sont communs aux sols et métaboliquement diversifié, dominé la glace de coin de l' Alaska dans cette étude. En fait, Katayama et al. 11 bactéries isolées dans le phylum Actinobactéries, bacilles et Gammaproteobacteria de l' un des coins de glace du permafrost Tunnel ERDC-CRREL. Ces études confirment la détection de Gammaproteobacteria dans cette étude. Planctomycetia, qui sont communs à l'échantillon aquatique, ont également été détecté dans la glace coin. Ces organismes ont été trouvés dans les sols de la couche active au- dessus du pergélisol dans le nord de la Sibérie 38, en plus de pergélisol dans le plateau tibétain dans le Qinghai, en Chine 39.

De nombreuses études ont étudié la présence d'archées, en particulier les méthanogènes, dans le pergélisol, avec l'idée que permafrost, méthanogènes vont probablement devenir plus actifs, contribuer à l'efflux de méthane dans l'atmosphère 21, 33-34. Étonnamment, les archées ont pas été détectés dans les échantillons d' Alaska de coin de glace ou pergélisol même si les deux Euryarchaeota et Crenarchaeota ont été trouvés dans le pergélisol de l'Arctique canadien et 17 haute méthanogènes ont été trouvés dans les échantillons de pergélisol de la toundra arctique en Russie 21.

matériaux congelés abritent des micro-organismes anciens, fournissant un enregistrement des processus biogéochimiques qui ont eu lieu plusieurs milliers d'années. Cette biodiversité est d'un grand intérêt dans le cadre du régime de réchauffement climatique actuel, car les micro-organismes qui ont été limités dans l'environnement cryosphère peuvent se libérer lorsque les matériaux congelés dégeler. Afin d'identifier en toute confiance la biodiversité hébergé dans ces matériaux congelés, les sols gelés et des échantillons de glace doivent être correctement manipulés et décontaminés. Ici, nous présentons un protocole pour éliminer les cellules étrangères et de l'ADN à partir d'échantillons congelés à ensure que les microorganismes ont été détectés à partir du matériau, plutôt que de la contamination par le forage ou le traitement des noyaux.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Auger Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% Isopropanol Walmart 551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7010
RNase decontamination solution, RNase Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA  7002
Light Duty Suits Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 10606
Nitrile Gloves Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FFS-700
Antiviral Masks Curad, Walgreens CUR3845
Sterile Sample Bags  Nasco, Fort Atkinson, WI B01445
Steel Microtome Blade  B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal Rack Fabricated at CRREL, Hanover, NH
Tray Handy Paint Products, Chanhassen, MN 7500-CC
Aluminum Foil Western Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter Corning, Corning, NY 430513
Serratia marcescens ATCC, Manassas, VA 17991
Biosafety Hood NuAire, Plymouth, MN NU-425-400
Petri Dish Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone Acros Organics, NJ 61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
ATCC Agar 181- Agar Difco, Sparks, MD 214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 12224-50
Ear Protection Elvex EP-201
Hard Hat
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34705
Glass Wool Pyrex 430330
Ruler
Weighing Tin  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-732-100
Sodium chloride Sigma Aldrich, St Louis, MO S-9625
Potassium chloride JT Baker, Phillipsburg, NJ 3040-04
Potassium phosphate, monobasic JT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Potassium phosphate, dibasic JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes Corning, Corning, NY 4558
2 ml Microcentrifuge Tubes MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13113-50
Scoopula Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE 1437520
Balance Ohaus, Parsippany, NJ E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich, St Louis, MO D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)  Acros Organics, NJ 22716-5000
Polyethylene glycol 8000  Sigma Aldrich, St Louis, MO P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1752-400
Centrifuge Eppendorf, Hauppauge, NY 5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) Sigma Aldrich, St Louis, MO C0549-1PT
TE Buffer Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE AM9860
Pipets Rainin, Woburn, MA Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tips Rainin, Woburn, MA Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
Vortexor Scientific Industries, Bohemia, NY G-560
Vortex Adaptor MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13000-V1
Clear Bottle Corning, Corning, NY C1395500
Amber Bottle Corning, Corning, NY C5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µm Corning, Corning, NY 430513
60 ml Syringe Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm EMD Millipore, Billerica, MA SLGV033RB
70% Ethanol Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP2818-500 diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 151030511
Cell Spreader Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-100-10
Disposable Inoculating Loops Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-363-602

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References

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Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d'enquêter sur l'Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur
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Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).More

Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).

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