Summary
Kriosfer geçmiş çevre koşullarında kalıcı korunmuş organizmalar erişim imkanı sunmaktadır. Bir protokol toplamak ve toprak ve buz permafrost çekirdeklerini dekontaminasyonunda sunulmuştur. Eksojen kolonilerin ve DNA yokluğu tespit mikroorganizmalar sondaj veya işleme malzeme yerine, kontaminasyonu temsil ettiğini göstermektedir.
Introduction
Krayosfer (örneğin, permafrost topraklar, buz özellikleri, buzul kar, firn ve buz) Son çevresel koşullar altında devam organizmaların ne tür bir bakış sunuyor. Bu yüzeyler birikimi beri dondurulmuş korunmuş eski binlerce yıl, kendi mikrobiyal topluluklar, yüzlerce onlarca olabilir çünkü, antik çevre koşullarını yansıtacak. uygun bu ekosistemleri analiz ve donmuş örneklerin donmuş toprak ve buz, uygun toplama ve işleme anlamlı biyolojik bilgileri ayıklamak için gereklidir. 21. yüzyıl için iklim projeksiyonları Arktik ve alt Kutup bölgelerine 1 belirgin bir ısınma potansiyeli işaret gibi bu son derece önemlidir. Özellikle, İç Alaska ve Grönland yaklaşık 5 ° C ve sırasıyla 2100 2,3 ile 7 ° C, sıcak bekleniyor. Bu önemli ölçüde toprak ve su mikrobiyal topluluklar ve bu nedenle, ilgili etki beklenirbiojeokimyasal süreçler. Sıcak sıcaklıklar ve değişen yağış rejimi, potansiyel bir kalın, mevsimsel çözülmüş (aktif) yol açan birçok alanda 2-5 permafrost bozulmasını 6,7, dondurulmuş toprakların çözülme ve gibi büyük buz kütlelerinin erime katman başlatması bekleniyor zemin buz, buz dilimleri ve segregasyon buz 8. Bu dramatik bu ekosistemlerde bitki ve hayvan biyolojik çeşitlilik yanında biyokimyasal özelliklerini değiştirmek istiyorum.
Buzul buz ve sinjenetik permafrost sediment ve buz özellikleri kimyasal ve özellikleri oluşan zamanda orada yaşamış neler temsil eden bir çevrenin biyolojik kanıtlar tuzak var. Örneğin, İç Alaska, Illinoisan ve Wisconsin hem sürekli donmuş mevcut olan yaşlı ve özellikle bu permafrost mevcut IMPA biyolojik ve jeokimyasal kanıtlar içeriyor (YBP) önce 150.000 yıl modern kalma eşsiz yerleri sağlarbiyolojik çeşitlilik üzerindeki geçmiş iklim değişikliklerinin ct. Sonuç olarak, bu çökeltiler binlerce yıl boyunca biyojeokimyası ve biyolojik çeşitliliğin bir kaydını sağlar. Alan düşük sedimantasyon oranları vardır ve glaciated olmamıştı yana, bozulmamış numuneler dikey tünellerde toprak profili veya yatay sondaj içine toplama ve analizi, her iki sondaj için erişilebilir. Daha da önemlisi, geniş kayıtlar özellikle bu bölgede 9-14 içinde permafrost benzersiz biyokimyasal özelliklerini vurgulamak olduğunu mevcuttur. Özellikle, DNA analizinin uygulama hem kaybolmamış ve antik buz ve donmuş toprak örneklerinde biyolojik çeşitliliğin varlığını ve kapsamını tahmin etmek için belirli organizmalar tarafından işgal antik çevre şartlarının bağlantı ve habitat keşif sağlar.
Her çalışma bir differe kullanılan rağmen Önceki çalışmalar, memeliler, bitki ve YBP 11, 15-19 50k kalma örneklerinden mikroorganizmalar üzerinde iklimsel etkilerin belirlediknt metodoloji toplamak ve sürekli donmuş veya buz çekirdeği dekontamine. Belirli metodoloji yabancı nükleik asitler ayrıca örneklerden elenen olup olmadığını açıklığa kavuşturmak etmedi ama bazı durumlarda, sondaj çekirdek, 16, 20-21 sterilize edildi. Diğer çalışmalarda, bakteriyel 22 dekontaminasyon işlemleri etkinliğini ölçmek için kullanılmıştır 15 (örneğin, Serratia) ve flüoresan mikro küreler izole eder.
Bu deney geri yaklaşık 40k YBP kalma permafrost örneklerinden mikrobiyal topluluklar araştıran daha geniş bir çalışmanın parçası oldu. Çalışmanın bu bölümünün özel hedefi başarıyla buz ve donmuş toprak çekirdeklerini dekontamine oldu. Bildiğimiz kadarıyla, herhangi bir metodoloji dondurulmuş çekirdek dış kısmından yabancı nükleik asitlerin ve ilgili nükleazlar ortadan kaldırmak için tasarlanmış çözeltilerin kullanımı entegre edilmiştir. Bu bu çözümler, piyasada yaygın olmasına rağmen biry moleküler deneyler için laboratuvar araçlarını temizlemek için kullanılan.
Çekirdekler dekontamine Bir kez genomik DNA, Griffiths ve ark., 23. ve towe ve ark., 24 ile geliştirilmiş protokollerin kullanılması ile ekstre bir spektrofotometre kullanılarak ölçülür ve reaksiyon başına 20 ng elde edilecek şekilde steril DNA içermeyen su ile seyreltildi. 600 saniye, 95 ° C'de 45 döngü izledi: Bakteriyel 16S rRNA gen rRNA genleri primerler Arch 349F ve kemer 806R ve aşağıdaki koşullar altında TM Arch 516F 26 sondası ile amplifiye edilmiştir primerleri 331F ve 797R ile amplifiye edilir ve BacTaq 25 ve arkeal 16S prob edilmiştir 30 saniye, 60 saniye boyunca 57 ° C, ve 30 saniye süreyle 40 ° C'de son uzatma ile 25 saniye için 72 ° C, 95 ° C. Tüm qPCR reaksiyonlar çift kopya halinde gerçekleştirilmiştir. 20 ul reaksiyon hacmi 20 ng DNA, primerler 10 uM, prob 5 um ve qPCR Reaksiyon karışımı 10 ul dahildir. Standartlar foPseudomonas sırasıyla fluorescens ve halobakteriyum salinarumun bakteri ve arke qPCR genomik DNA kullanılarak hazırlanmıştır r. Her iki log fazına kadar büyütülmüştür. Plaka sayımları gerçekleştirilmiştir ve DNA izole edildi. Genomik DNA, bir varsayımı ve genom başına 16S rRNA geninin altı kopyasını H. bir spektrofotometre ile nicelleştirilmiştir salinarım ve P. sırasıyla 27-28, fluorescens. bakteriyel ve arke genlerin kopya sayısı standart eğri baz alınarak hesaplanmıştır, tedaviler arasındaki eşitsiz varyanslar için hesap log-dönüştürülmüş ve ANOVA ile değerlendirildi.
Topluluk kompozisyon 16S rRNA geni sıralanması akış hücreleri ve köprü büyütme teknolojilerini kullanarak ve 'mikrobiyal ekoloji içine nicel anlayışlar' (QIIME) 29 ile toplulukları analiz edilerek belirlenmiştir. İleri ve ters okur birbirine katıldı ve daha sonra diziler, filtre endeksli edildive yüksek kaliteli temsilcileri bir referans veri tabanı ile dizi uyum yoluyla de novo operasyonel taksonomik birimler (OTU) atama için seçildi. Hizalanmış dizilerin taksonomik atama için ayrı bir referans veri tabanı ile karşılaştırılmıştır. Bir filum düzeyinde OTU tablo genel toplum kompozisyonunu belirlemek için oluşturuldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekipman Hazırlama ve Permafrost Core Collection
- Ekipman hazırlama ve saha örnek toplama ve saklama dişli
- varil üst içine sürücü adaptörünü takarak ve yerine kilitlemek için kolu çevirerek numune toplama için burgu birleştirin. Sürücü adaptöre üzerine adaptör tüpü pin ve adaptör tüpüne motoru pin. varil üzerinde kesicileri takın.
- örnekleri herhangi bir bulaşmayı azaltmak için hafif hizmet takım elbise, nitril eldiven ve maske takın. Kulak koruma ve Permafrost Tüneli (Şekil 1) girdikten sonra güvenlik için sert bir şapka giymek.
- Tünel girin ve örnekleri (Şekil 1B) toplamak için bir yer seçin.
Not: dikey veya yatay sondaj yeri için, malzeme (örneğin buz veya permafrost) dondurulur dair kanıt var bilinen bir alanı seçmek, bilinen hiçbir büyük kök sistemleri vardır ve hiçbir bilinen çakıl yoktur. Hepsini silBir örnek toplama önce alandan bitki materyali yaşayan. dikey veya yatay sondaj ise nispeten düz ve burgu ile erişilebilen bir alan seçin. - % 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile sterilize edilmiş bir plastik malzeme ile zemin katmanlama bir iş istasyonu hazırlayın.
- bu burgu uzaklaştırıldıkça çekirdekleri tutmak için bir oluk sağlamak için boyuna iş istasyonunda yarı 10 cm çapında, polivinil klorür (PVC) boru kesme yerleştirin. % 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile PVC boru dekontamine.
- iş istasyonu yakınında,% 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile püskürtülerek burgu dekontamine. Bir silme ile burgu çözümler çıkarın.
- Buz ve permafrost çekirdek toplama ve depolama
- örnek duvarın bir alanı seçin (1.2.1 bakınızNot).
- % 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile silerek dondurulmuş duvar alanının yaklaşık 10 cm çapında dekontamine.
- Bu örnek alan dik olacak şekilde ilgi alanına dekontamine burgu yükseltmek ve duvara (Şekil 1C, D) temizlenmiş yüzüne sondaj başlar.
- Dikkatle numune toplama alanından burgu çıkarın. motordan burgu ayırın ve temiz bir çalışma istasyonu steril PVC boru üzerinde burgu yerleştirin. Dikkatle dondurulmuş çekirdekler steril PVC boru (Şekil 1E) üzerine kaydırın şekilde burgu eğin.
- % 70 izopropanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile eldiven dekontamine.
- Steril eldiven ile buz ve donmuş toprak çekirdeği Pick up ve steril torbalar içine koyun.
- sevk veya işlenmiş kadar bir soğutucu ya da soğuk bir odada çekirdeği koyun.
- Sh0 ° C'nin altındaki bir ısıda tutmak için kuru buz kullanılarak, dondurulmuş çekirdek ip.
- Hemen -80 ° C 'de çekirdek saklayın.
2. Permafrost ve Buz Çekirdekli İşlem
- Malzemenin hazırlanması
- 4 saat 450 ° C'de bir fırın içinde pişirme ile, steril, nükleik asit, serbest ağır hizmet alüminyum varak, metal raflar, cam, metal forseps, ve cam yünü hazırlayın. kullanılıncaya kadar bu malzemeleri bir kenara koyun.
- 0.22 um'lik bir filtreden çözüm geçirilerek% 95 etanol ve ultra saf su sterilize edin.
- 4 ° C 'de, -20 ° C ve su saklayın etanol çözeltisi.
- % 70 etanol, DNA, dekontaminasyon çözeltisi ve RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile püskürtme eder ve her bir çözelti sonra silinerek plastik bir cetvel sterilize edin.
- Bakteriyel kültür hazırlanması
- Serratia marcescens'i büyümeye suyu ve tabak hazırlayın.
- suyu için 5 gr deneyin birleştirmekptone, 1 g glikoz, 5 g maya ekstresi ve 1 g potasyum fosfat dibazik, ve daha sonra damıtılmış su ilave, plakaları yapmak yukarıdaki karışıma agar 15 g eklemek için 1 L. ulaşmaya. suyu ve plakalar, 15 dakika boyunca 121 ° C 'de 7 ve otoklava pH ayarlamak.
- 8 g sodyum klorür, potasyum klorür, 0.2 g sodyum fosfat dibazik 1.44 g ve 0.24 g potasyum fosfat monobazik birleştirerek 1x fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) hazırlayın ve 800 ml ulaşmak için damıtılmış su ilave edilir. 7.4 pH ayarlamak ve 15 dakika boyunca 121 ° C 'de 1 L Otoklav ulaşmak için damıtılmış su ilave edilir.
- S. daldırılarak steril bir çerçevenin bulunduğu suyu inoküle Daha önce, -80 ° C'de dondurulmuş olarak saklandı marcescens kültürü. aseptik koşullar altında, seri seyreltilmiş el PBS 9 ml kültürün 1 ml'sinin eklenmesi ve kültür çözeltisi ters çevirin. PBS 9 ml, bu seyreltme 1 ml ilave edilir ve el solüsyonu ters. 10 -9 Dilu kadar sekiz kez daha tekrarlayıntion ulaşılır.
- Plaka üzerine suyu 1 ml dağıtmak ve bir hücre dağıtıcı ile yayarak agar plakları üzerine 10 -6, 10 -7 10 -8 ve 10 -9 çözüm yayıldı. seyreltme başına üç nüsha olarak bunu yapın. 4 ° C'de orijinal kültür saklayın.
- 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Özgün kültür içindeki hücrelerin sayısını hesaplamak için koloni sayısı. Not: Orijinal kültüründe kolonilerin sayısı bakterilerin büyüme hızına bağlı olacaktır.
- Pipetleyin steril 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine orijinal kültürün 250 ul. Önceki adımda koloni sayımı ile tespit edildiği üzere yaklaşık olarak 10 9 hücre / ml elde etmek için 1 x PBS yeterli hacim ilave edilerek, orijinal kültür seyreltilir. 10 dakika süre ile 2500 x g 'de santrifüj ile mikrosantrifüj tüpü içinde hücreleri Pelet.
Not: 1 x PBS hacmi bakterilerin büyüme hızına bağlı olarak değişir. - steril biohood, Suyu kapalı pipetlemeyin ve PBS tamponu 1x 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. kullanılana kadar 4 ° C ya da yaklaşık iki ay saklayın.
- Işlem günü, S. seyreltik Orijinal S. 1 ml ilave adım 2.2.7 marcescens kültürü 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne PBS tampon 1x 39 ml marcescens kültürü.
- Serratia marcescens'i büyümeye suyu ve tabak hazırlayın.
- çekirdekli işlemci ve koruma dişli soğuk oda yer hazırlayın
- % 1 çamaşır suyu çözeltisi ile soğuk oda, temiz duvarlar, zeminler ve metal bir masaya soğutma önce.
- Yaklaşık soğuk oda ayarlanan sıcaklık -11 ° C.
- soğuk oda istenilen sıcaklığa ulaştığında, soğuk oda ve örnekleri herhangi bir bulaşmayı azaltmak için hafif hizmet takım elbise, nitril eldiven ve maske.
Not: İki düzgün giyimli kişiler bu işlem için gereklidir. - Steril malzeme getirmek (örneğin, alüminyum folyo, metal raflar, cam, tepsi, S. marcescens kültür ve miSteril masaya soğuk oda ve yerine crotome bıçak) ve örnekleri.
- Bir soğuk oda tesisinde sürekli donmuş ve buz çekirdekli işlemci
- bir alüminyum folyo, steril, nükleik asit serbest kağıda bir sürekli donmuş çekirdeği yerleştirin.
- Hafif S. seyreltik kültürü ile çekirdeğin dışında inoküle marcescens steril bir köpük fişi (Şekil 2B) elde edilmiştir.
- bir tepsi oturur steril metal raf üzerinde çekirdek yerleştirin.
- % 70 etanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile çelik mikrotom bıçak sterilize edin.
- % 70 etanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile Bireysel temiz bir nitril eldiven ve tepsinin üzerinde 45 ° 'lik açıyla çekirdek tutun.
- Bireysel B nazikçe Bireysel A Her scrape sonra çekirdek (döner iken steril bıçak kullanarak, uçları dahil olmak üzere tüm çekirdek dışına yaklaşık 5 mm, kazıma var
- Bireysel bir çözüm dökülür olarak çekirdek (Şekil 2D, 3C) döner iken Bireysel B, dikkatli ve hızlı bir şekilde çekirdek üzerinde filtre ile sterilize% 95 etanol dökün var.
- Bireysel B hemen filtre ile sterilize suyla durulayın çekirdek var.
- yeni bir steril metal raf ile tepsiye kullanılan metal raf değiştirin.
- Bireysel bir tepsiye üzerinde 45 ° 'lik açıyla çekirdek% 70 etanol, DNA dekontaminasyon solüsyonu ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile onun nitril eldiven temiz tutun var.
- Bireysel B DNA dekontaminasyon solüsyonu ile tüm çekirdek sprey var.
- Bireysel B hemen filtre ile sterilize suyla durulayın çekirdek var.
- Bireysel B RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile tüm çekirdek sprey var.
- individu varal B hemen filtre ile sterilize suyla çekirdek durulayın.
- bir alüminyum folyo, steril kağıda çekirdek yerleştirin ve hafifçe sarın.
- Çözülme dış çekirdek
- laminer akışı ile steril biohood steril bir cam çanak içinde steril bir metal raf yerleştirin.
- S. özgü iki agar tabak koyun Steril raf altındaki cam tabak içinde marcescens çekirdek (Şekil 2E) sıvıyı toplamak için.
- Steril metal raf üzerinde çekirdek yerleştirin.
- (Ortalama olarak bu, yaklaşık 10 dakika içinde meydana gelir) göbeğin dış yüzeyi yaklaşık olarak 2-5 mm, 23 ° C'de çözülme izin verin. yaklaşık 90 °, her 2 dakika çekirdek getirin.
- Steril forseps ve steril cam yünü kullanılarak çekirdeğe tüm yüzeyini çubukla ve S. iki agar plakaları özel aşılamak levha yüzeyi üzerine bu malzemelerin sürme ile marcescens. Orijinal kültürü ile iki yeni plakaları aşılamak dışında dope için kullanılanSoğuk odanın düşük sıcaklıklara maruz kaldı çekirdek.
- yakın steril bir cetvel yerleştirerek, ancak çekirdek dokunmadan değil tarafından çözülmüş silindir çekirdeğinin dış boyutlarını ölçün.
- Büyük steril torbaya çekirdek yerleştirin ve -80 ° C'de saklayın.
- büyüme için kontrol edin
- bir hafta boyunca, 23 ° C'de agar inkübe edin.
- S. büyümesi için agar inceleyin marcescens kolonileri.
- plaka üzerinde hiçbir görünür koloniler varsa, 2.5.3 adıma devam edin.
- koloniler plaka üzerinde görünüyorsa, bölüm 2 "Permafrost ve buz çekirdekli işlemci" adım 2.1.1 itibaren tekrarlayın.
- dondurucu çekirdek elde ve aseptik olarak steril torbasına aktarın.
- bütün çekirdek çözülme için yaklaşık 24-48 saat boyunca 4 ° C 'de, steril bir torbaya çekirdek saklayın.
3. Buz Çekirdek ve Permafrost gelen Nükleik Asit Eldesi için alt örnek alın
- buz çekirdeklerinden nükleik asit ekstraksiyon
- Hafifçe torbayı (Şekil 2G) ajitasyon buz çekirdeğinden çözülmüş malzemeyi karıştırın.
- mikroorganizmaları toplamak için vakum altında 0.22 um filtre ile steril bir kap içine çözülmüş malzeme dökülür.
- Aseptik steril forseps ile filtreyi kaldırmak ve steril 2 ml seramik boncuk tüp (1.4 mm) yerleştirin.
- -80 ° C'de filtre saklayın.
- sürekli donmuş çekirdeklerinden nükleik asit ekstraksiyon
- hafifçe çanta yoğurma ile permafrost çekirdeğinden çözülmüş malzemeyi karıştırın.
- permafrost iyice karıştırılır edildikten sonra, steril bir scoopula yaklaşık 0.5 gr toplu toprak altörneğini elde etmek ve bir denge üzerinde dik oturur bir darası steril 2 ml seramik boncuk vidalı kapaklı tüp (1.4 mm) yerleştirin.
- -80 ° C'de saklayın alınan örnekler.
- Numunelerin gravimetrik su içeriğini elde.
- Bir steril ile permafrost 10 g ölçünBir denge üzerinde bir daralı teneke e scoopula ve yer. Permafrost ve kalay ıslak kütlenin ölçün.
- 24 saat boyunca 105 ° C'de ayarlanmış bir fırında permafrost inkübe edin. Permafrost ve kalay kuru kitle ölçün.
- sürekli donmuş kuru kütleye göre sürekli donmuş ıslak kütle çıkartılarak ve sürekli donmuş kuru kütleye bölünmesiyle Gravimetrik su miktarı hesaplanır.
- -80 ° C'de saklayın permafrost.
4. Permafrost ve Buz Çekirdek nükleik asitlerin Özü
- Malzeme hazırlık
- 37 ° C, ve otoklav O / N kuluçkalanması,% 0.1 dietilpirokarbonat (DEPC) ile muamele etmek suretiyle çözüm tutmak için sarı şişeleri hazırlayın.
- 240 mM potasyum fosfat tampon çözeltisi hazırlayın. potasyum fosfat monobazik 2. 5 g ve potasyum fosfat dibazik, 38.7 g ekleyin. steril su ekleyerek 500 ml son ses seviyesini ayarlayın.
- heksadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB) ekstraksiyon tampon ile hazırlayınfer 80 mi su içinde 4.1 g sodyum klorür eritilmesi ve ısıtılarak ve karıştırılarak yavaş yavaş 10 g CTAB ekleyerek. Steril su ilave edilerek, 100 ml nihai hacim ayarlayın.
- fosfat tampon çözeltisi eşit hacimlerde ekleyin ve CTAB tamponu ve filtre, bir 0.22 mikron filtreyle sterilize edin. Oda sıcaklığında alüminyum folyo ve mağaza ile şişe kapağı.
- 9.35 g NaCI, 100 ml steril suyun bir araya getirilmesiyle 1.6 M sodyum klorür çözeltisi (NaCl) hazırlayın. 1.6 M NaCI çözeltisi ve filtre ile sterilize 10 g polietilen glikol 8000 ekleyin. 4 ° C'de saklayın.
- Nükleik asit Griffiths ve diğerleri değiştirilmiş bir versiyonuna göre ekstraksiyon. 22 ve towe ve ark., 23
- hafif hizmet takım elbise, nitril eldiven ve maske takın. Temiz laboratuar alanı ve% 70 etanol, DNA, dekontaminasyon çözeltisi ve RNaz dekontaminasyon solüsyonu pipetler.
- Seramik boncuk vida ca 2 ml (buz çekirdeği ya da permafrost toprak örneğinden filtreyi) alt örnek kaldırOda sıcaklığında -80 ° C derin dondurucuda ve çözülme gelen p tüp.
- kısaca hekzadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB) ekstraksiyon tamponu ve vorteks 0.5 ml ekleyin.
- (25: 24: 1), fenol-kloroform-izoamil alkol, 0.5 ml ilave edilir (pH 8) ve vortexer bir düz panel adaptörü kullanarak 10 dakika boyunca yatay olarak tüpleri çalkalanır.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,100 x g'de Boncuk dayak, santrifüj tüpleri et.
- yeni bir steril 1.5 ml'lik tübe Sulu tabaka uzaklaştırılır ve kloroform-izoamil alkol eşit hacimde karışımı (24: 1). 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,100 x g'de santrifüjleyin.
- yeni bir steril 1.5 ml'lik tübe Sulu tabaka uzaklaştırılır ve% 30 polietilen glikol 8000 ve 1.6 M NaCI, iki hacim ekleyin. 4 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,100 x g'de santrifüjleyin.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,100 xg'de buz soğukluğundaki% 70 etanol ve santrifüj yaklaşık 500 ul, nükleik asit pelet yıkayın.
- 2 saat süre ile, steril bir biohood hava kuru topak. 50 ul DNaz / RNaz içermeyen TE tamponu içinde süspanse (pH 8.0). DNA, örneğin, PCR ve qPCR olarak aşağı doğru uygulama için hazır hale gelir.
- spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirleyin.
- reaksiyon başına 20 ng elde edilecek şekilde steril DNA içermeyen su ile DNA seyreltilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
sunulan yöntem sürekli donmuş buzul buz çeşitli Cryosphere ortamlarda toplanan donmuş örnekleri dekontamine için kullanılabilir. Burada, özellikle Mühendislik Araştırma ve Geliştirme Merkezi'nden toplanan buz ve donmuş toprak örneklerinden toplanan verileri sunmak - Fox, AK bulunan Soğuk Bölgeler Araştırma ve Mühendislik Laboratuvarı (ERDC-CRREL) Permafrost Tünel (Şekil 1A ve 1B). Permafrost Tünel Goldstream vadinin yan içine yaklaşık 110 metre uzanan ve buz zengin silt ve alüvyon 30-31 erişim sağlar. Bir buz kama ve donmuş toprak numuneler dikkatle örnekleme zamanında Ekim 2014, 24 tünel duvarları üç kopya halinde toplanır, Permafrost duvarının sıcaklığı -2.9 ° C olmuştur. Numuneler gelen 35 m ve 60 m tünel portal ve donmuş toprak bir buz kama özelliği yaklaşık 27 m toplanmıştırTünelin portal (Şekil 1C ve 1D). Özel bakım buz ve donmuş toprak çekirdekleri (Şekil 1E) kirlenmesini sınırlamak için numune toplama sırasında çekildi. Dondurulmuş çekirdekler bizim dekontaminasyon protokolü (Şekil 2) ve işlenmesi için Hanover, NH CRREL toprak mikrobiyoloji laboratuvarına kuru buz üzerinde taşınan göre ele alınmıştır.
Tüm çekirdekler, steril mikrotom bıçaklar ve çözümler (Şekil 3A, B ve C), Bölüm 2'de tarif edilen protokol kullanılarak işlenmiştir. Bu çalışmanın amacı, başarılı bir malzeme tevdi edilmiştir zamanda mevcut mikrobiyal topluluklar belirlemek için dondurulmuş örneklerinden endojen nükleik asitlerin ayıklamak oldu. Dekontaminasyon protokolü büyüme kıç Petri plakaları Serratia marcescens'in seyreltik kültürü ile çekirdek doping ve incelenerek değerlendirilmiştirER çekirdekler 31 tedavi edildi. S. yokluğu marcescens koloniler eksojen mikroorganizmaların doğru göbeğin dış kısmından çıkarıldı olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, kolonilerin olmayışı eksojen DNA göbeğin dış kısmından çıkarıldı belirtmek olmaz. Bu nedenle, biz Serratia sp DNA kontrol etmek için buz çekirdekten numune dizisi. Buz kama mikrobiyal bolluk permafrost daha büyük olasılıkla anlamlı derecede düşük olduğu için, biz S. DNA olmadığını belirlemek için buz çekirdekleri kullanılır marcescens dekontaminasyon protokolü takip mevcut olacaktır. Çekirdekler düzgün dekontamine olmasaydı, o zaman S. ile ilgili dizileri marcescens örneklerde mevcut olması beklenir. 4 16S rRNA gen Diziliş analizi sonuçlarından, buz çekirdek içinde düşük bakteriyel çeşitlilik göstermektedir. Diziler Pseudomonas sp ile ilgili., Filum Gammaproteobacteria arasında buz sampl hakimes. Planctomycetia ilişkin üye buz içinde mevcut, ancak daha az ölçüde de vardı. Özellikle dikkat Of Serratia sp yokluğudur. Dizileme sonuçlarında, dekontaminasyon protokolü yeterince eksojen DNA kaldırıldı düşündürmektedir.
Ayrıca, nükleik asitlerin ekstre sırasında kontaminasyon ek bir risk vardır. Negatif ekstraksiyon boşlukları eksojen nükleik asitlerden kirlenme ortaya çıkarmak için kullanıldı. örnekleri ve negatif kontrol DNA qPCR kullanılarak amplifiye edildi. qPCR veri permafrost bakterileri barındırmıştır gösterdi, ancak arke permafrost (Tablo 1) tespit edilmemiştir. Başarılı dekontaminasyon daha ileri derecede kontrol pozitif amplifikasyonu ile bağlantılı olarak, ekstraksiyon boşlukları bakteriyel veya arke amplikonların eksikliği ile ispatlanmıştır, Pseudomonas fluorescens ve halobakteriyum salinarumun (Tablo 1). abundance ölçümleri 60 m çekirdek (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında portal 35 m toplanan çekirdek arasında bakteri bolluğu açısından anlamlı farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur. Devam eden araştırma mikrobiyal topluluk kompozisyon çekirdek arasında farklı olup olmadığını belirlemek için yürütülmektedir.
Fairbanks yakın Şekil 1. Örnek siteleri, AK. Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html) ve (B) ERDC-CRREL Permafrost Tüneli, (C) toplama (A) Harita SIPRE burgu, (D) burgu görüntüle giren permafrost duvar, ve (E) arşiv için çekirdek hazırlanıyor kullanarak sürekli donmuş çekirdekler. ver bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sion.
Donmuş malzemenin temizlenmesi için Şekil 2 şematik. (A) donmuş malzeme (örneğin, buz çekirdeği ya da sürekli donmuş çekirdeği) soğuk bir odada işlenir. (B) kasıtlı bir bakteri kültürü ile kirlenmiş. (C) çekirdek dış 5 mm kısmını kaldırmak için steril bir mikrotom bıçağıyla traş edilir. Çözeltilerin (D) bir dizi başka örnek olarak bir dış kısmının dekontamine uygulanır. DDS DNA dekontaminasyon çözümü gösterir ve RDS RNaz dekontaminasyon solüsyonu gösterir. Oda sıcaklığında gerçekleştirilen steril biohood çekirdek yerleştirerek (E), malzemenin dış 2-5 mm çözülür. buz ya da permafrost damlar sıvı Petri kapları toplanır ve çekirdek sürülür ve kontrol etmek kaplama Çekirdek düzgün dekontamine edildi. (F ve G) bakteri üremesi tespit değilse, o zaman çekirdek steril kap içinde 4 ° C'de çözdürülür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Steril koşullar altında soğuk bir odada sürekli donmuş çekirdek Şekil 3. Dezenfekte. (A) kazıyarak bir metal mikrotom bıçak ile permafrost çekirdeğinin dış katmanı kaldırın. (B) scrape daha yakından görünümü. (C) Çözüm durulama çekirdeğinin dış katmanını dekontamine. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Buz kama örneklerinden 4. Mikrobiyal dizileri Şekil. Yüzdeye göre buz kama örneklerde mevcut bakteri şubelerinin ortalama bağıl bolluğu gösteren çubuk grafik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Permafrost Tablo 1. Bakteriyel bolluk. Permafrost örneklerinde bakteri ve ilişkili çıkarma boşlukları zenginliğini gösteren qPCR sonuçları. Tablodaki değerler ortalama ± standart hata olarak rapor edilir. n örnek sayısıdır. ND algılanmadı gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kriosfer geçmiş çevre koşullarında kalıcı korunmuş organizmalar erişim imkanı sunmaktadır. Iyileşti takson tam tarihi topluluğunu temsil olmayabilir ama, buzul buz ve donmuş toprak örneklerinin analizi elde olanlar seçme süreler 15-16 hakkında değerli tarihi bilgiler elde edebilirsiniz. Örneğin, anlamlı biyolojik bilgi çözülme 33 bir sonucu olarak karbon bisiklet süreçlerini araştıran buz Grönland buz tabakasının 20 anaerobik aktivite araştıran çalışmaların ve sürekli donmuş çalışmalar çizilmiş ve Beringia 16 permafrost gelen mantar çeşitliliği içgörü sağladı. aşağı iletken, bu donmuş malzeme içinde biyolojik toplulukları incelemek için analizler önce uygun numune toplama ve dekontaminasyon gerçekleşmelidir. Bu adımlar verileri yorumlayarak üzerinde önemli etkileri olsa bile, birçok çalışma w nasıl numuneler üzerinde özel ayrıntıları sunmuyoruzere toplanan ve işlenen veya görüntü dondurulmuş materyalleri nasıl işleneceğini gösteren. Bu malzemelerin konsantrasyonlarının tam tarif değil ama Örneğin, daha önceki çalışmalar, floresan mikrosferler ya da bilinen bakteri 15 göbeklerin dış kısmının katkılı var. Diğer çalışmalar ayrıntılı olarak dekontaminasyon protokolleri açıklanan, ancak yüksek verimlilik metodolojisi 15, 32 etkinliğini test etmek için analizler uygulanmıştır değil. Bu nedenle, bozulmamış bakteri ve Petri kapları ve qPCR üzerinde büyüme ile eksojen DNA'nın ayrıntılı tarama olmadığını belirlemek için kullanılmıştır numune toplama, saklama ve analitik prosedürler donmuş malzeme mevcut mikrobiyal topluluklar tanımlamak için yeterli steril edildi.
Bu protokol başarıyla eski çekirdek ilgi genetik malzemeyi izole etmek için modifiye edilmiştir. Böyle toplanması, işlenmesi ve özü sırasında alınması gereken özel giysiler giyen ve malzemeleri dekontaminasyon olarak Bakımkirlenme beri çekirdeklerinden iyon herhangi bir aşamada meydana gelebilir. çekirdekler taşıma sırasında çözülme, sonra göbeğin dış bölgesinden kirletici göbeğin iç kısmına göç edebilir daha yüksek bir eğilimi olduğu için ayrıca, kuru buz veya benzer bir soğutucu madde ile çekirdek nakliye zorunludur. Daha fazla kirlenme olasılığını en aza indirmek için, motorlu burgu yerine bir itme çekirdekli büyük çekirdeğe toplama düşünün. Biz itme çekirdek düzgün kazıma adımda dekontamine için çok küçük olduğunu bulmuşlardır. Seçenek olarak ise, numune daha büyük bir hacim biyolojik maddenin düşük bir bolluk ile numuneler için özellikle önemlidir daha büyük çekirdek, elde edilebilir. Ayrıca, büyük hacimli Serratia koloniler plakalar üzerinde tespit edilirse, o zaman çekirdek yeterince büyük tekrar işlenecek öyle ki hata için daha fazla yer verir.
Çeşitli malzemeler en verimli belirlemek için test edildiyöntem çekirdekleri dekontamine. Örneğin, steril alüminyum folyo, çekirdek için izin cam tabaklar veya plastik malzemeler, hızlı ve kolay steril bir yüzeye yerleştirilmelidir ziyade. Ayrıca, geleneksel olmayan bu tür bir metal raf olarak malzeme ve bir tepsi yeniden kirlenmesine neden olan çekirdek riskini azaltarak, kazınmış dış malzemeler çekirdekten uzağa birikmesine izin yararlı olduğunu kanıtladı. protokolünün önceki iterasyondan olarak, kazıma kirlenme riski yüksek düz bir yüzey üzerinde gerçekleşmiştir. Son olarak, daha ziyade, cam yemekler daha steril torbalar, karıştırma ve numune saklama için elverişli olduğu bulunmuştur.
Bu protokol, dondurulmuş çekirdek dış kısmı üzerinde mikroorganizmaların ve nükleik asitler ortadan kaldırmak için öngörülmüştür. izopropanol ve etanol etkili dezenfektanları olsa da, bunlar nükleik asitleri çıkarmayın. Bu nedenle, nükleik asit ve çekirdek dış kısmından ilişkili enzimleri kaldırma çözeltileri kullanılmıştır. bu soluleri genellikle laboratuar malzemeleri ve ekipmanları nükleik asitlerin ve ilgili nükleazlar kaldırmak için kullanılır. Laboratuvar yüzeyler üzerindeki etkinliğini test ederken, RNA dekontaminasyon solüsyonu DNA dekontaminasyon solüsyonu 34 daha fazla dışsal malzemeler kaldırıldı. İlgi konusu genetik malzeme, aynı zamanda, belirli bir organizmanın bir düşük yoğunlukta olan örneklerinden çıkarılabilir için göbeğin dış kısmını temizlemek için nükleazlar kullanılması her zaman tercih edilen bir yöntem olabilir. Özel olarak, uzun zaman süreleri için sürekli donmuş ve buz içinde depolanan genetik madde olarak ayrışması. mikroorganizmalar, Alaska örneklerde yüksek bolluk olduğundan, çözeltiler, endojen genetik materyallerin büyük bir oranını kaldırmak endişe büyük ölçüde azaltılmıştır. Düşük bolca organizmalardan ciddi bozulmuş olmuştur ya da vardır var nükleik asitler tarafından kaldırılmaz emin olmak için nükleazlar içeren solüsyonlar kullanıldığında Ancak, dikkatli alınmalıdırnucleaseleri.
S. yokluğu Petri kapları marcescens koloniler sağlam hücreler sürekli donmuş çekirdeği dış kısmından çıkarıldı emin olduğunu sağladı. Ayrıca, aynı protokol uygulandı buz çekirdekleri analizi S. ile ilgili saptanabilir dizileri gösterdi marcescens. Sıra sonuçları sadece Pseudomonas bile hem Pseudomonas sp olsa da, bu numunelerde tespit edildiğini gösterdi. ve Serratia sp. sınıfında Gammaproteobacteria içindedir. S. birlikte, yokluğu Petri kapları ve qPCR DNA amplikonlarının yokluğunda marcescens kolonileri donmuş çekirdek başarıyla dekontamine olduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle, tespit mikroorganizmalar olasılıkla çok kirlenme daha delme veya çekirdek işlemesini, dondurulmuş malzeme içinde gömülü. Diğer sondaj teknikleri büyük derinliklerde toprak veya buz nüfuz hidrolik sondaj bulunmaktadır. Bu yöntem, Woul rağmenBu oligotropik ortamlarda düşük mikrobiyal bolluk araştırmak için yararlı olacağını, bu sondaj sıvıları başarıyla kaldırıldı olacağını olup olmadığını ortaya koymuyor. Yüksek verimli sekanslama alt analizinin bir parçası değilse başka, belirli bir PCR reaksiyonu S. hedefleme marcescens ekstre DNA'yı büyütmek için kullanılır.
Bizim örneğimizde veri kümesi elde edilen sonuçlar sağlam genomik DNA, başarılı bir şekilde dondurulmuş malzeme elde edildiğini göstermiştir. Bundan başka, her iki sürekli donmuş ve buz kama barındıran bakteriler sırasıyla qPCR ve sekanslama ile kanıtlanmıştır. Alaska örnekleri Tibet Qinghai eyaletinde Yaylası, Çin 36 ve aktif katman / permafrost topraklardan permafrost daha büyüklüğünü daha az bakteri sipariş içerdiği olsa bu çalışmadan Alaska kesintili permafrost, Kanadalı yüksek Arctic 35 permafrost benzer bakteri sayıları içerdiği Nunavut, Kanada 37. Bir i BenzerNunavut, Kanada 37 toplanan ce kama, topraklara ortak ve metabolik çeşitlidir özellikle Pseudomonas, Gammaproteobacteria ile ilgili diziler, bu çalışmada Alaska buz kama hakim. Aslında, Katayama ve ark. ERDC-CRREL Permafrost Tüneli'ne buz dilimleri birinden filum Actinobacteria'lar, basiller, ve Gammaproteobacteria içinde 11 izole edilen bakteri. Bu çalışmalar, bu çalışmada Gammaproteobacteria saptanmasını desteklemektedir. Suda örnek ortak olan Planctomycetia, ayrıca buz kama tespit edilmiştir. Bu organizmalar Çinghay, Çin 39 Tibet Plateau sürekli donmuş ek olarak kuzey Sibirya 38 Permafrost üzerinde aktif bir tabaka topraklarda bulunmuştur.
Birçok çalışma permafrost thaws olarak, metanojenler muhtemelen daha aktif olacağını kavramı, Katkı ile permafrost olarak, archaea, özellikle metanojenler varlığını araştırdıkatmosfer 21, 33-34 kadar metan efflux buting. Şaşırtıcı, archaea Euryarchaeota ve Crenarchaeota hem Kanadalı yüksek Arktik 17'den permafrost bulundu ve metanojenler Rusya'da 21 Arktik tundra gelen permafrost örneklerinde bulundu rağmen Alaska buz kama veya sürekli donmuş örneklerinde tespit edilememiştir.
Dondurulmuş malzemeler önce binlerce yıl meydana gelen biyokimyasal süreçlerin bir rekor sağlayan antik mikroorganizmalar. dondurulmuş malzemeler çözülme zaman bir kez krayosfer ortamda sınırlandırılmıştır mikroorganizmalar kurtarılmış olabilir, çünkü bu biyolojik çeşitlilik mevcut iklim ısınma rejim altında büyük ilgi olduğunu. güvenle bu donmuş malzeme sığınmış biyoçeşitliliği belirlemek amacıyla, dondurulmuş topraklar ve buz örnekleri düzgün ele ve dekontamine edilmelidir. Burada, ensu donmuş numunelerden yabancı hücreleri ve DNA'yı çıkarmak için bir protokol mevcuttespit edilen mikroorganizmalar yerine kirlenme daha sondaj veya çekirdeğini işlemesini, malzeme olduğunu yeniden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
- Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
