Summary
Vi presenterer enkle teknikker for å isolere gigantiske transcriptionally aktive lampbrush kromosomer fra å leve oocytter av frosker og salamandere. Vi beskriver hvordan observere disse kromosomene "live" av fase kontrast eller differensial interferens kontrast, og hvordan du løser dem for fluorescerende in situ hybridisering eller immunofluorescent farging.
Abstract
Vi beskriver metoder for å studere de gigantiske transcriptionally aktive lampbrush kromosomer (lbcs) funnet i eggcelle, eller unlaid egg, frosker og salamandere. Individuelle lbcs kan være opp til 1 mm i lengde og de bor i et gigantisk kjerne, selv opp til 0,5 mm i diameter. Den store størrelsen av kromosomene tillater at formålet med observasjoner av aktive gener ved lys optisk mikroskopi, men samtidig spesielle teknikker er nødvendig for å isolere kjernen, fjerne den kjernefysiske konvolutten, og sprer kromosomene på et objektglass. Eggcelle kjernen, også kalt germinal vesikkel (GV), isoleres i et medium som tillater delvis gelering av kjernefysiske aktin og bevarer den fine struktur av lbcs. Dette trinnet utføres manuelt under et dissekere mikroskop ved hjelp av gullsmed tang. Deretter er det kjernefysiske konvolutten fjernet, igjen manuelt med gullsmed tang. Atominnholdet raskt overført til et medium som disperses aktin gel og lar de uskadde lbcs å avgjøre på et objektglass. På dette punktet lbcs og andre kjerneorganeller kan sees av fase kontrast eller differensial interferens kontrast mikroskopi, men finere detaljer er skjult av Brownske bevegelser. For høy oppløsning mikroskopisk observasjon eller molekylær analyse, er hele forberedelse sentrifugeres for å feste den delikate lbcs fast til raset. En kort fiksering i paraformaldehyd blir så fulgt av immunofluorescerende farging eller in situ hybridisering. Lbcs er i en transkripsjonelt aktiv tilstand og sin enorme størrelse tillater molekylære analyser på individnivå gennivå hjelp confocal eller super-oppløsning mikroskopi.
Introduction
De fleste virveldyr, med unntak av pungdyr og placen pattedyr, produsere store Yolky egg. Til tross for sin noen ganger enorme størrelse, disse eggene er enkeltceller som når sitt endelige dimensjon mens de fortsatt i eggstokken av den kvinnelige. Ovarian egg kalles eggceller og hver inneholder vanligvis en enkelt gigantisk kjerne, kjent siden tidlig på 19 tallet som Germinal vesikkel eller bare GV. 1 Oocytter av vanlige laboratorie frosker, Xenopus laevis og Xenopus tropicalis, nå en maksimal diameter på 1,2 mm og 0,8 mm henholdsvis (figur 1). De Gvs fra modne oocytter av disse to frosker er 0,3 - 0,4 mm i diameter (figurene 2, 3). Salamandere har vanligvis enda større egg og GVS. Fullt modne oocytter i den meksikanske Axolotl, Ambystoma mexicanum, er mer enn 2 mm i diameter og GV er ca 0,5 mm. Således er disse kjerner er lett synlige for det blotte øye og boksbli manipulert på mange måter som er umulig med kjerner av typiske somatiske celler.
Like bemerkelsesverdig er den gigantiske størrelsen av kromosomene i GV, et faktum føres allerede i slutten av det 19. århundre. Individuelle kromosomer Ambystoma og andre salamandere kan være opp til 1 mm i lengde (bilde 4, 5). De av Xenopus er betydelig mindre, men med lengder opp til 100 um eller mer, de dverg de typiske somatiske kromosomer de fleste organismer. En viktig funksjon av egg kromosomer er deres ekstraordinære transkripsjonen aktivitet, noe som fører til en av sine mest karakteristiske morfologiske trekk - hundrevis av sammenkoblede laterale sløyfer (figur 5). Hver sløyfe består av en eller noen få transkripsjonsenheter som aktivt syntetisere RNA. Sløyfene gi eggcelle kromosomer en fuzzy utseende, noe som førte til navnet "lampbrush" kromosom etter deres overfladiskelikhet med børster som brukes i tidligere tider for å rydde parafin lampe skorsteiner. 2
Fokuset i denne artikkelen er om bruk av isolerte GVS å studere lbcs og atomorganeller (nucleoli, histon locus organer, og flekker). To ganske forskjellige teknikker bli beskrevet. I den første, mer vanlig teknikk blir Gvs isolert i en saltoppløsning ved hjelp av gullsmed tang, raskt skylt for å fjerne vedhengende eggeplomme, og den nukleære konvolutten er fjernet, igjen med gullsmed tang. Den geléaktige innhold, inneholder lbcs og atomorganeller, får lov til å slå seg ned på et glass objektglass eller dekkglass. Slike preparater kan bli undersøkt direkte ved fasekontrast eller DIC mikroskopi. Alternativt kan preparater sentrifugeres å feste lbcs og organeller til lysbildet eller dekkglass. Slike preparater kan deretter bli behandlet for detaljert molekylær analyse av nukleinsyrer og proteiner, primært ved immunfluorescens og fluorescent in situ hybridisering (FISH). 3-7
En annen teknikk involverer isolering av GV i mineralolje. 8 Olje isolert GVS forbli transkripsjonelt aktiv i mange timer og er potensielt nyttige for studier hvor man ønsker atom innholdet skal være så realistisk som mulig. 9,10 På grunn av at brytningsindeksen for det nukleære "SAP" er nær den for de lbcs og andre kjerneorganeller (figur 3), kan mikroskopiske teknikker være en utfordring med oljeisolert Gvs.
Til slutt, på grunn av sin størrelse og lett manipulering, Gvs er ideelt materiale for studier på atom konvolutten. Atom pore komplekset ble først beskrevet fra elektron mikroskopiske undersøkelser på amfibier GV konvolutter 11 og nyere superresolution observasjoner har brukt det samme materialet. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generell informasjon om frosker og salamandere, samt kilder til dyr, kan finnes på følgende nettsteder: Xenbase (http://www.xenbase.org) og Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Denne protokollen følger retningslinjene fra Department of Embryology av Carnegie Institution for Science dyr omsorg.
1. Solutions
- Gjør 10 L "frosk vann": Tilsett 10 ml 1 M CaCl2 og 10 ml 1 M NaHCO 3 til 10 l avionisert eller dekloreres H2O under omrøring.
- Lag en L 20% paraformaldehyde: Lag 1 liter 4 mM Na 2 CO 3. I et kjemisk hette tilsettes 200 g pulverisert paraformaldehyd, og oppvarm til ca. 80 ° C for å oppløse. Cool, og filteret gjennom filterpapir. Forsiktig: paraformaldehyde er giftig og må behandles med forsiktighet. Alternativt kjøpe kommersielle paraformaldehyde løsning.
- Lag en L amfibium bedøvelse løsning: Tilsett 1,5 g etyl-3-aminobenZoate metansulfonat til en L frosk vann. Oppbevares i romtemperatur.
- Lag 1 L oocytt kulturmedium OR2 14: 82,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na2 HPO 4, 5 mM HEPES (fra 500 mM stamløsning, pH 8,3). Den endelige pH-verdi vil være ca. pH 7,8. Tilsett 100 mg ampicillin og 100 mg streptomycin for å hindre bakterievekst.
- Lag 1 L GV isolasjon Løsning: 83 mM KCl, 17 mM NaCl, 6,5 mM Na HPO 2 til 4, 3,5 mM KH 2PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT). Juster til pH 7,0.
- Gjør 100 ml GV spredning løsning: 20,7 mM KCI, 4,3 mM NaCl, 1,6 mM Na HPO 2 til 4, 0,9 mM KH 2PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,1% paraformaldehyd. Juster til pH 7,0. For å lette raskere spredning av kjernefysiske gel, legg 10-50 mikrometer CaCl 2.
- Gjør 500 ml subbing løsning. Dønning 0,5 g av kommersiell gelatin i 20 ml H2O i 5 - 10 min. Legg 500 ml kokende H2O og nøye virvel for å oppløse gelatin. Avkjøl og tilsett 50 mg Crk (SO 4) 2 · 12 H 2 O. Filter med sug og oppbevares ved 4 o C.
- Lag 10 ml monteringsmedium. Oppløs 10 mg fenylendiamin i 5 ml PBS (135 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 4,3 mM Na HPO 2 til 4, 1,5 mM KH 2PO 4, justert til pH 9). Tilsett 5 ml glycerol. Oppbevares i 250 mL alikvoter ved -80 o C.
2. Materialer
- For subbed lysbilder, glir sted tre tommer x 1 tomme glass mikroskop i et kommersielt rengjøringsmiddel og gni dem for å fjerne eventuelle forurensninger. Sett i et lysbilde rack og skyll godt med vann fra springen, og deretter i avionisert vann. Dypp lysbilder i subbing løsning, renne i en vinkel, og stek over natten ved 60 o C.
- For plast firkanter, skåret 25 mm firkanter av en plate av 1 mm tykk poly (metylmetakrylat). Bor et5 mm rundt hull i midten av hver firkant. Sand begge overflatene og kantene av plassen samt omkretsen av hullet.
MERK: Som et alternativ til hjemmelaget plast torg og vel lysbilder, som beskrevet i neste avsnitt, bruke kommersielle lim in situ PCR og hybridisering kamre (25 mL). Man kan nok også bruke gjenbrukbare silikon isolatorer for cellekultur, selv om dette ikke har blitt grundig testet ennå. - For brønn slides, smelte 20 - 30 For g parafinvoks (56-57 ° C) i en 50 ml glassbeger på en varmeplate. Med en 20 ul pipette spres en 5 ul dråpe av parafin på hver side av sentrum av en subbed lysbilde. Trykk på en plast firkant inn i parafin og plasser raset på kokeplate. Parafin vil smelte og bør spres jevnt under plast torget.
- Fjern lysbildet fra den varme platen og la den avkjøles. Plasser en støtte under hver ende av raset, slik at lysbildet ikke kommer i kontakt med tabletop under kjøleprosessen. Dersom parafin kjøles for raskt, vil det trekke bort fra det sentrale hull. Forbered 10 eller flere brønn lysbilder: hver GV forberedelse bruker en ny brønn lysbilde.
- For lysbilde bærere for sentrifugering, bruk spesielt konstruert bærere for rotoren brukes. Flere produsenter tilbyr sentrifuger med bærere for 96 - vel plastplater. Disse bærere kan tilpasses ganske lett å holde objektglass.
3. Isolering av ubefruktede egg
- Plasser en voksen kvinne frog (Xenopus laevis eller Xenopus tropic) eller salamander (Ambystoma mexicanum) i nok bedøvelse løsning for å dekke dyret helt. Når dyret opphører bevegelsen, legg den buk-up på en seng av chipped is i en egnet beholder.
- Med kirurgiske sakser lage en 2 - 3 cm innsnitt i den nedre del av magen lateralt for midtlinjen. Flytte de indre organer forsiktig til side for å finne eggstokken på siden av innsnittet (there er to eggstokker, en på hver side av abdomen). Klipp ut en del av eggstokken med nok ubefruktede egg for de planlagte eksperimenter. Siden det finnes tusenvis av eggceller i hver eggstokk, en forholdsvis liten del av eggstokk - vil (1 3 cm) vanligvis være tilstrekkelig.
- Plassere en eller noen få stykker av eggstokk i OR2 saltvann i en stor petriskål (100 mm) ved romtemperatur. Ubefruktede egg kan lagres i god stand i flere dager, hvis skadet ubefruktede egg blir fjernet og OR2 løsningen endres daglig.
- Sutur snittet med kirurgisk silke og returnere dyret til en individuell glassbolle for utvinning. Legg akkurat nok "frosk vann" for å dekke dyret før det gjenvinner bevisstheten (ca. 15 min). Etter at dyret viser frivillige bevegelser, fylle bollen med vann. Selv om frisk vann brukes, er sterilitet ikke nødvendig, som amfibier nesten aldri blitt infisert etter operasjonen. Hvis ønskelig, kan neomycin anvendes til suturer. Såret gror vanligvis fullstendig etter en few dager og samme dyr kan brukes igjen etter ca 2 måneder.
4. Isolering av en Germinal Vesikkel (GV)
- Plasser en del av eggstokk (10 - 20 store oocytter) i en liten petriskål (35 x 10 mm) inneholdende OR2 oppløsning.
- Fjern en eggcelle fra eggstokken ved hjelp av to par # 5 gullsmed tang for å rive den tynne stilken av vevet som forbinder eggcelle til eggstokk veggen. Plasser eggcelle i en annen liten petriskål som inneholder GV isolasjon medium.
MERK: Tilstanden til lbcs avhenger av størrelsen (forfall) av eggcelle. Lbcs nå maksimal lengde med fremtredende løkker i ubefruktede egg som er litt mindre enn full størrelse. De mest modne oocytter inneholder ofte korte kromosomer med innleide sløyfer. - Utfør følgende trinn under lavt forstørrelse av en dissekere mikroskop (felt diameter ca 10-20 mm).
- Ta tak i eggcelle med begge parene av tang nær dyret pol (mørk halvkule) og gjøre en smalle tåre. Se i ekstrudert eggeplomme for den gjennomsiktige eggcelle kjernen, også kalt germinal vesikkel eller GV.
- Alternativt kan rote et stort hull nær dyret pol med en pinsett og forsiktig klemme ut GV sammen med eggeplomme (figur 2).
- Forsiktig rulle GV bort fra mesteparten av eggeplomme. Vanligvis vil det være en liten mengde eggeplomme tett vedheftende til GV.
5. Fjerning av Nuclear konvolutt
- For X. laevis og X. tropicalis, overføre GV fra isolasjonsmedium til spredningsmediet i løpet av 60 s med isolasjon, selv om det fortsatt er et lite vedheftende eggeplomme.
MERK: GVS av disse to artene "stivne" i ca 60 s hvis igjen i isolasjon medium og vil ikke spre seg i påfølgende trinn. Derfor er hastigheten av største betydning når undersøke Xenopus GV innholdet.- Ta tak i kjernefysisk konvolutt nær toppen av GV med ett parav gullsmed tang, tar seg ikke å trykke ned. Ta tak i konvolutten med andre pinsett så nær den første som mulig. Trekk de to parene av tang bort fra hverandre og GV innholdet vil "sprette" ut gratis av konvolutten, som fester seg fast til en eller begge tang.
- Plukk opp GV innholdet i et glass pipette eller en justerbar 20 mL mikropipette. Hvis du bruker en justerbar pipette, satt pipetten til 10 mL og kutte av enden av plastspiss med et barberblad. Tegn i 5 mL av væske før du plukker opp GV i de resterende 5 mL.
- Overfør fortsatt-gelerte kjernefysiske innholdet til sentrum av et godt lysbilde tidligere fylt med spredning løsning. Sprednings løsningen må ha en konveks overflate slik at en boble ikke blir fanget når dekkglass tilsettes.
- Legg et dekkglass (18 mm) og plasser raset i et fuktig kammer. Atom gel vil sakte spre over de neste 10 - 60 min, slik at kromosoms og atomorganeller komme til å ligge på overflaten av glass-slide.
MERK: GVS av salaman A. mexicanum og N. viridescens ikke "stivne" urimelig i isolasjon medium. Derfor kan man fortsette mer rolig med fjerning av kjernefysiske konvolutten enn en boks med Xenopus.
- Fjern kjernefysisk konvolutt fra en salamander GV som beskrevet i avsnitt 5.1.1, men gjør det i isolasjon medium.
- Plukk opp litt geldannede GV innholdet med en pipette og overfør til en petriskål som inneholder sprer løsning.
- Raskt Skyll pipetten spissen i å spre løsningen, plukke opp atom gel, og plasser den i midten av et godt lysbilde tidligere fylt med spredning løsning. Legg en 18 mm dekkglass og plassere hele lysbildet i en fuktig kammer. Atom sap vil sakte spre over de neste 10 - 60 min og kromosomene og atomorganeller vil komme til å ligge på glassoverflaten. </ Ol>
6. Foreløpig Observasjon av lbcs og organ
- Vise lbcs og atomorgan av fasekontrast (vanlig oppreist mikroskop) ved lav forstørrelse etter spredning av kjernefysiske innholdet i spredning kammeret. På grunn av at kammeret er omtrent 1 mm dype, og atominnholdet er på bunnen, bruke en lav forstørrelse objektiv med en lang rekkevidde (5X - 10X).
MERK: Hovedårsaken til å undersøke forberedelse på dette tidspunktet er å avgjøre om det er verdt å bære gjennom de neste trinnene. I en god forberedelse kromosomene er ubrutt og har slått seg ned til bunnen av kammeret. Fortsett til sentrifugeringstrinn innen en time for å gjøre forberedelser, da dette vil sikre optimal festing av lampbrush kromosom looper til raset.
7. sentrifugering av Nuclear Innhold
- Legg et stykke filter papir på dekkglass, og trykk nedfor å fjerne overflødig væske fra kammeret.
- Tilsett ca 1 mm 3 vaselin på hver side av dekkglass. Smelt vaselin med en metallstang oppvarmet til ca 70-80 o C for å forsegle dekkglass på underliggende plast torget.
- Plasser lysbildene i lysbilde bærere for sentrifugering, noe som gjør at motsatte bærere er balansert. Sentrifuger lysbilder på ca 4800 xg i 30 min - 1 time. ved 4 o C. Bruk treg start funksjonen på sentrifugen.
8. Fikse Nuclear Innhold
- For de fleste påfølgende prosedyrer, fikse atom innholdet med paraformaldehyde.
- Sett et lysbilde stativ i en standard objektglass farging fatet og deretter plassere lysbildene individuelt i stativet. Legg nok fiksativ til å dekke lysbilder (2-4% paraformaldehyde i OR2 eller PBS).
- Med et par av sløv tang, presse dekkglass sideveis, plukke den opp, og kast den i riktig glass søppel.La lysbilder i fiksativ i minst 15-30 min. For in situ hybridisering og mest antistoff flekker, lengre fiksering (h eller d) er tillatt.
- For å fjerne plasten torget, glir sted en av gangen i iskald OR2 eller PBS i en farging parabolen. Sett inn en skarp barberhøvel blad på kanten av plasten torget og lirke den løs.
MERK: Ideelt plasten kommer av ren, forlater alle parafinvoks på lysbildet. Voksen tjener en nyttig hensikt: siden det omgir den lille sentrale området hvor atom innholdet er knyttet til raset, det fungerer som en demning som gjør det mulig å arbeide med små volumer (5-10 mL) med reagenser for farging, osv. Lysbilder kan holdes på ubestemt tid i kaldt OR2 eller PBS.
9. Farging av lbcs og Nuclear Organ
- Fjern en fast GV forberedelse fra lagring i OR2 eller PBS. Tørk av overflødig væske og plass på støtter i et fuktig kammer. En praktisk chambeh er et 90 x 15 mm petriskål inneholdende et 90 mm sirkel av fuktig filterpapir.
MERK: På dette punktet atom innholdet er godt festet til lysbilde i en 5 mm sirkulært område fritt for parafinvoks. På grunn av at voksen er vannavvisende, kan man endre løsninger ved å legge til og fjerne små volumer av væske til kanten av det sentrale området med en 20 ul pipette. Den store forholdsregel er å unngå å berøre smørefrie område med pipettespissen. - Gjennomføre farging med små volumer (10 - 20 mL) av reagenser. Fordi kromosomer og kjernefysiske organeller er svært liten og i umiddelbar kontakt med tilsatte reagenser, kan flekker protokoller være kort. Primære og sekundære antistoff flekker tider kan være så kort som 1 time eller mindre. Ikke ta med vaskemiddel i alle trinn, da dette fører til skade på forberedelse. Dersom det er ønskelig, beis preparat med DAPI (1 pg / ml) i 10 - 20 minutter for å fremheve aksene til lbcs.
- Mount i glyserol eller en kommersiell mounting medium egnet for immunofluorescens. For å unngå å fange en luftboble under montering trinnet, gjør som følger.
- Trekk 15 ul av monteringsmedium inn i spissen av en 20 ul pipette. Fjern så mye væske som mulig fra området umiddelbart rundt atom spredning av "fukttransporterende" den av med et stykke filterpapir (kutt i form av en meget tynn trekant fra en 90 mm sirkel av # 1 filterpapir).
- Pipetter meste av montering medium på forberedelse, være forsiktig med å berøre det området av kjernefysisk spredning. Plasser de siste 1 pl, eller så av monteringsmedium i midten av en 22 mm dekkglass (tykkelse # 1.5). Snu dekkglass over forberedelse og slippe forsiktig på plass.
- For midlertidige mounts, opp til et par dager, bruke 1 mg / ml phenylenediamine i 50% glyserol. For permanente monteringer, spesielt for superresolution studier ved å bruke en lav-fluorescens medium som stivner til en brytningsindeks på ca. 1,46.
10. Fluorescent In Situ Hybridisering (FISH) av lbcs og Nuclear Organ
- Fordi FISH protokollene krever vanligvis et trinn ved forhøyet temperatur, fjerner parafinvoks fra preparatet. Skrap forsiktig med et barberblad, selv om fremgangsmåten er omstendelig og kan føre til skader av preparatet. Det er nyttig å markere område av preparatet på baksiden av sleiden med en diamantspiss.
- Alternativt kan oppløse parafinvoks med xylen. Sett opp en serie av Coplin krukker eller flekker retter som inneholder: 30%, 50%, 70%, 95% og 100% etanol; 3 containere xylen; 2 flere beholdere av 100% etanol og en aceton.
- Plasser lysbilder i lysbildeholderen og tørke dem i etanol serien, forlater lysbilder 3-5 minutter i hver konsentrasjon (kortere tid hvis opphisset).
- Oppløse parafinvoks ved å sende lysbildene gjennom de 3 containere xylen, ca 5 min hver hvis opphisset. Fjernxylen ved å passere gjennom to 100% etanoler, og til slutt fjerne etanolen med aceton. Ta lysbilder fra aceton og vippe dem til tørk.
- Utføre in situ hybridisering ved hjelp av en standard protokoll. 15,16
11. Isolering av en GV etter olje
- Plukk opp en eggcelle fra OR2 løsning med gullsmed tang, inkludert så lite omkringliggende vev som mulig. Plasser oocyte på en liten del av # 1 filterpapir. Overskytende OR2 løsningen vil overføre til filterpapiret, slik at den eggcelle tilnærmet fri for væske. Plukke opp "tørr" oocytt og plassere den under overflaten av lett mineralolje (parafinolje) i en liten petriskål (35 x 10 mm).
- Med fine Tungsten nål eller en tine av tang, dytte et lite hull i eggcelle nær den mørke dyr stang. Plukk opp eggcelle med en pinsett (unngå tips) og klem forsiktig. GV vil ekstrudere sammen med en mindre eller lArger mengde eggeplomme på overflaten (figur 3).
- Fjern så mye eggeplomme som mulig ved å forsiktig feie GV med siden av tang. I de fleste tilfeller vil det være vanskelig å fjerne alt av eggeplomme. Imidlertid, for de fleste formål en liten mengde eggeplomme er ikke et problem.
- Å observere GV innholdet, flate GV i større eller mindre grad.
- Fjern plast plassen fra et godt lysbilde og bruke de resterende parafinvoks som et grunt beholder for parafinolje. 10 Ta opp GV sammen med parafinolje i en 20 ul pipette og overføres til midten av parafin området. Legg til et dekkglass og observere innholdet i delvis flat GV. Denne teknikken ikke skader lbcs.
- Alternativt flate GV til omtrent 10 mikrometer tykkelse for observasjon av atomorganeller.
- Klipp av de siste 1 mm av en plast pipette med en skarp barberhøvel blad. Suck GV inn ispissen sammen med nøyaktig 5 mL av mineralolje. Ekstrudere GV og all olje på midten av en 22 mm dekkglass.
- Senk en standard 3 "x 1" glass lysbilde sakte inntil den bare berører oljedråpen. Dråpen og dekk vil løftes ved hjelp av kapillaritet, og oljen vil spre seg til kantene av dekkglass. Når dråpen fullstendig har spredd seg, vil oljen være ca 10 um tykt. De lbcs vil bli skadet og store nucleoli vil bli komprimert litt, men de fleste av de mindre atomorganeller vises mer eller mindre som de finnes i intakt GV (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å undersøke gigantiske lampbrush kromosomer man begynner ved å isolere eggceller fra en frosk eller salamander. Figur 1 viser en gruppe av modne oocytter i en bufret saltoppløsning etter fjerning fra eggstokk av frosken, Xenopus. Slike oocytter forblir i god stand for dager ved romtemperatur. Kjernen (eller germinal vesikkel) blir deretter fjernet fra en oocytt med gullsmed tang, enten i en saltoppløsning (figur 2) eller i olje (figur 3). De kjernefysiske innholdet i en olje-isolert kjerne kan bli undersøkt ved å forsiktig Klem kjernen og observere ved fasekontrast eller differensialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi. For å undersøke innholdet av en kjerne som har vært isolert i en saltoppløsning, må man først fjerne atom konvolutten med gullsmed tang og at innholdet skal avgjøre på et objektglass. Stoffblandingen er så sentrifugert å feste than kromosomer fast til raset, etter som kromosomene kan være farget med et antistoff (figur 4) eller utsettes for in situ hybridisering. De lampbrush kromosomer salamandere er mye større enn de av frosker (figur 5). I begge tilfeller enkelte transkripsjonsenheter (gener) kan ses på som løkker av kromatin som rager ut sideveis fra kromosomet akse.
Figur 1: Eldre oocytter fra Frog X. tropic. Eggstokk av en moden kvinne frosk inneholder tusenvis av ubefruktede egg i ulike stadier av modning. Den minste er størrelsen av somatiske celler og har allerede nådd prophase av den første meiotisk divisjon. Som en oocytt vokser, det gradvis akkumuleres eggeplomme, som gir cellen en hvit ugjennomsiktig utseende. Den største matteure oocytter, vist her, få en mørkere cap grunn av opphopning av melanin pigment. De største oocytter av X. tropicalis er ca 0,8 mm i diameter, de av X. laevis omtrent 1,4 mm, mens de av den Axolotl er en enorm 2,2 mm. Med unntak av størrelse, alle tre er lik generelt utseende. Scale bar = 1 mm.
Figur 2: Fjerning av GV fra en Oocyte av X. tropic. Venstre. Et lite hull ble laget med gullsmed tang i den mørkere dyr pol av en eggcelle og GV ble forsiktig ekstrudert. I dette eksempelet er GV var nesten fri for plomme som det kom ut av egget. Vedhengeggeplomme kan fjernes ved å suge GV inn og ut av en pipette med en spiss diameter bare er litt større enn diameteren av GV selv. Ikke sant. Three GVS av X. tropic. Disse Gvs var igjen et par minutter i et svakt surt medium (GV isolering løsningen justert til pH 5,8), noe som fører til at atom konvolutten for å svelle bort fra de gelerte atominnholdet. GVS behandlet på denne måten vil ikke spre seg for cytologisk undersøkelse. Men slike GVS er ideelle for molekylær analyse: konvolutten kan fjernes med gullsmeder tang, som gir et utvalg av kjernefysiske innholdet helt gratis cytoplasma forurensning. 17,18 Scale bar = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: GV av X. tropic Isolert i Oil. Venstre. Etter en liten punktering ble gjort i eggcelle nær den mørke dyret pole, GV begynte å ekstrudere. I dette tilfellet GV kom ut med nesten ingen vedhengeggeplomme. Midten. GV er nå helt fri fra eggcelle cytoplasma. Slike GVS fortsette å transkribere RNA i timevis. Ikke sant. Etter at GV er forsiktig presset i olje under et dekkglass, kan kjerneorganeller sees av DIC, som vist her, eller ved fasekontrast. Hele GV er mye større enn det lille området som vises her. HLB = histon locus legeme med tre flekker på overflaten. Scale bar = 0,5 mm for de to første plater, 10 mikrometer for den tredje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Lampbrush Kromosomer (lbcs) fra Axolotl A. mexicanum. Venstre. Ikke sant. Det samme forberedelse sett av mørkefelt belysning. Man kan nå se de mange ufargede forsterket nucleoli. Scale bar = 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: A Single LBC fra Axolotl A. mexicanum og Frog X. tropic, på samme forstørrelse. Disse bildene illustrerer den ekstreme størrelsen forskjellen mellom lbcs av en salamander og frosk (innfelt). Størrelsen difference korrelerer med det totale DNA innhold av genomene (ca 30 GBP for A. mexicanum vs 1,7 Gbp for X. tropic). Individuelle laterale sløyfer (transkripsjon enheter) er også mye lenger i salamander enn i frosken. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De første observasjonene av "levende" lbcs fra hånd isolert GVS av frosker og salamandere ble gjort nesten 80 år siden av den amerikanske biologen William Duryee, 19 før innføringen av fasekontrast og DIC mikroskopi, før fluorescerende farging, og før FISH. Fordelene med lbcs for å undersøke detaljer om kromosom struktur og transkripsjon ved den enkelte genet nivået som kreves utvikling av teknikker for å feste lbcs til glassplater, for å fikse dem på en naturtro måte, og å anvende molekylære teknikker uten å ødelegge deres grunnleggende morfologi. Nesten hver teknikk for å oppnå disse målene krever litt tilpasning til de artene som er under etterforskning, og noen kompromiss mellom naturtro bevaring og molekylær karakterisering. For eksempel, er usedvanlig lett å jobbe med på grunn av sin enorme størrelse og hvor lett de GV innholdet spre i det aktuelle mediet GVS og lbcs av tailed amfibier. Until nylig, men svært lite var kjent om deres genomikk, noe som gjør det vanskelig å korrelere vell av cytologiske funksjoner med molekylære detaljene. Omvendt, lbcs av Xenopus er ganske liten i forhold til de av tailed amfibier (figur 5), men genomene til både X. tropicalis og X. laevis er blitt sekvensert og er rimelig godt annotert.
For de første som bruker amfibier GVS, vil den store utfordringen være å isolere GV og fjern kjernefysiske konvolutten uten å skade lbcs. Til dags dato har ingen oppdaget en måte å fjerne konvolutten med unntak for hånd med gullsmed tang. Det ville være en stor teknisk forhånd om en måte ble funnet å "løse opp" eller "fordøye" konvolutten men la kromosomer og andre kjerneorgan uskadet. En slik teknikk vil være like nyttig for molekylære studier. I våre undersøkelser på kjernekraft og cytoplasma RNA fant vi det nødvendig åfjern kjernefysiske konvolutten før analyse av kjernefysiske RNA (figur 2). 17,18 Hvis konvolutten ikke er fjernet, er den lille mengden av kjernefysiske RNA overveldet av forurensende cytoplasmisk RNA som fester seg på utsiden av konvolutten.
En annen stor forbedring ville være oppdagelsen av noen måte å feste lbcs tettere til et objektglass. Sentrifugering av blandingen er kritisk, men til og med forlenget sentrifugering (1 time ved 4500 xg) ikke sikre feste. Man kan vanligvis fortelle når lbcs er godt festet ved å undersøke dem med fasekontrast etter medium forstørrelse. Godt festet kromosomer viser ingen Brownske bevegelser i det hele tatt. Hvis noen Brownske bevegelser av løkkene er synlig, vil påfølgende farging eller fisk protokoller føre til omfattende skader eller tap av materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
