Summary
유전자 돌연변이는 유전자 타겟팅 편집 기법을 사용하여 유기체의 광범위한 이제 가능하다. 여기, 우리는 아 스티 아낙 스 mexicanus, 표면 물고기와 cavefish를 포함 물고기의 종 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs) 등의 전사 활성을 이용하여 표적 유전자의 돌연변이 유발을위한 프로토콜을 보여줍니다.
Introduction
특성 진화의 유전 적 기초를 이해하는 것은 진화 생물학의 중요한 연구 목표입니다. 상당한 진전이 특성의 진화를 기본 궤적을 확인하고 (실시 예 1-3)이 유전자좌에서의 후보 유전자를 정확히 파악을했다. 그러나, 기능적으로 이들 유전자의 역할 특성의 진화 연구에 사용 된 많은 유기체 도전 유지하고 테스트하는 것은 현재 유전자 취급 용이하지 않다. 게놈 편집 기술의 출현은 크게 유기체의 광범위한 유전 조작성 증가했다. 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs) 및 클러스터 정기적 interspaced 짧은 반복 팔린 드롬 (CRISPRs)은 (실시 예 4-11) 유기체의 여러 유전자 표적 돌연변이를 생성하기 위해 사용되어왔다. 진화론 관련 시스템에 적용이 도구는, 진화 생물 학자들이 진화의 유전 적 기초를 공부하는 방법을 혁신 할 수있는 잠재력을 가지고.
아 스티 아낙 스의 mexicanus는 두 가지 형태로 존재하는 물고기의 종입니다. 강에 사는 표면 형태 (표면 생선)과 여러 동굴 주거 형태 (cavefish) A. mexicanus의 cavefish은 (12에서 검토) 표면의 물고기 조상에서 진화. cavefish의 인구는 학교 행동의 감소, 증가 침략, 자세와 과식증 (13) 먹이의 변화로 동작 입맛과 두개골 neuromasts, 변화의 수를 증가, 감소 또는 색소 침착의 손실, 눈의 손실을 포함하여 특성의 숫자를 진화 -19. Cavefish 표면 물고기 interfertile, 그리고 유전자지도 실험은 동굴 특성 1,20-26에 대한 궤적 및 후보 유전자를 식별하기 위해 수행되었다. 일부 후보 유전자가 다른 종 (21)의 모델 생물 또는 과발현 27 또는 과도 최저 U에 의해, 세포 배양 1,19에서 동굴의 특성에 기여하는 기능 역할에 대해 테스트되었습니다A.에 morpholinos 28 노래 mexicanus. 그러나, 이러한 각각의 방법은 한계가있다. A. 이러한 유전자의 돌연변이 대립 유전자를 생성 할 수있는 능력 mexicanus는 cavefish의 발전에 그 기능을 이해하는데 중요하다. 따라서, A. mexicanus는 게놈 편집 기술의 응용 프로그램에 대한 이상적인 후보 유기체이다.
여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을 간략하게 설명 mexicanus TALENs를 사용하여. 이 방법은 표현형에 대한 관심 (29)의 유전자 안정 돌연변이 물고기의 라인을 분리하기위한 모자이크 주입 설립자 물고기를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물의 절차는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지침에 따라이었고, 아이오와 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 메릴랜드 대학에 의해 승인되었다.
1. TALEN 디자인
- TALEN 디자인 웹 사이트에 입력 원하는 대상 시퀀스. (예 : https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). 입력 스페이서 / 반복 배열 길이를 선택.
- "순서"라고 표시된 상자에 게놈 시퀀스를 복사합니다.
- "사용자 지정 스페이서 / RVD 길이를 제공한다"탭에서 스페이서 길이와 배열의 길이를 선택합니다.
참고 : 15 염기쌍의 스페이서 길이 잘 15-17 일의 배열의 길이를 반복하고 조립이 덜 복잡합니다.
- TALEN 쌍을 선택합니다. 독특한 제한 효소 부위를 중심으로 설계 TALEN 쌍은 제한 효소에 의해 소화 유전자형이 허용PCR 산물.
- 디자인 된 프라이머에는 Primer3 (30-32)과 같은 웹 사이트를 이용하여 TALEN 대상 부위 주변의 게놈 영역을 증폭한다. 제한 효소 유전자형하면 설계 프라이머 번만 제한 효소 부위를 포함하는 영역을 증폭한다. 이 지역이 증폭되고 A에 존재하는 다형성을 확인하기 TALEN 건설에 앞서 염기 서열을하는 것이 좋습니다 mexicanus 실험실 인구는 미세 주입에 사용되는.
합니다 (TALEN 키트 프로토콜에서 수정) 2. TALEN 조립 33, 34
자세한 내용 및 문제 해결을 위해 프로토콜 34을 참조하십시오.
- 준비하고 제조업체의 지침에 따라 TALEN 키트에서 필요한 플라스미드 시퀀스.
- 반응 A와 B에 대한 1 반응이 반복 변수 diresidues (RVDS) 1-10과 반응 A의 대상 벡터 pFUS_A는 RVDS를 포함를 11- 포함 # (N-1)과 일을 설정합니다N은 TALEN에 RVDS의 총 개수이다 전자 대상 벡터 pFUS_B 반응 B의 (N-1).
- 각 반응에 추가 각 RVD (100 NG / μL), 대상 벡터 (100 NG / μL), 1 ㎕의 BSA I 제한 효소 1 ㎕의 소 혈청 알부민 (BSA) (2 ㎎ / ㎖를 함유하는 각각의 플라스미드 1 μL ) 1 μL 리가 20 μl의 총 부피에 대한 물의 μL 배 리가 버퍼 (X)의 2 μL. 예를 들어, 표 1을 참조하십시오.
주 : 하프 반응이 또한 사용될 수있다. - 열 순환기의 반응을 놓고 사이클 실행 : 10 배 (37 ° C / 5 분 + 16 ° C / 10 분) + 50 ° C / 5 분 + 80 ° C / 5 분.
- 각 반응에 추가 각 RVD (100 NG / μL), 대상 벡터 (100 NG / μL), 1 ㎕의 BSA I 제한 효소 1 ㎕의 소 혈청 알부민 (BSA) (2 ㎎ / ㎖를 함유하는 각각의 플라스미드 1 μL ) 1 μL 리가 20 μl의 총 부피에 대한 물의 μL 배 리가 버퍼 (X)의 2 μL. 예를 들어, 표 1을 참조하십시오.
- 클레아 제와 반응을 품어. 각 반응에 1 ㎕의 25 mM의 ATP 1 ㎕를 클레아를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 반응을 인큐베이션.
- 반응을 변환.
- 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환.
참고 : 제 유능한 CELL을 사용할 수있다. 그러나, 낮은 능력을 가진 세포는 식민지의 부족이 발생할 수 있습니다.- 화학적 적격 세포를 25 ㎕의 반응물의 2.5 μl를 섞는다. 다섯 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 품어.
- 2 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. Catabolite 억압 (SOC) 슈퍼 최적 배지 125 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 튜브를 흔들어.
- 접시 스펙 티노 마이신 (50 μg의 / mL)로 LB 플레이트 상에 형질 전환 된 세포를 100 μL, X-gal을 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG). 37 ° C에서 O / N를 성장.
- 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환.
- 각각의 반응 2-3 흰색 식민지를 선택하고 프라이머 pCR8_F1 및 pCR8_R1 (표 2)를 사용하여 식민지 PCR에 의해 확인합니다.
- 시약의 마스터 믹스를 확인합니다. 예를 들어, 표 3 참조.
- 식민지를 선택하고, PCR 튜브의 바닥으로 얼룩 다음 스펙 티노 마이신과 2 ml의 LB에 식민지의 유물을 넣어(50 μg의 / ㎖). 식민지와 튜브에 마스터 믹스 15 μl를 놓습니다.
- 다음 PCR 프로그램을 실행 (표 4)
- 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔에 PCR을 (전체 볼륨을 실행) 확인합니다. 올바른 클론 예상 크기에 밴드뿐만 아니라 비방과 밴드의 사다리를해야합니다. 해당 스미어의 예를 들어, 34,33 참조하십시오.
- 진탕 배양기에서 37 ° C에서 LB 미디어 O / N에서 올바른 클론 2 ㎖ 문화를 성장.
- 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 미니 프렙.
- 순서 pCR8_F1 및 pCR8_R1과 TALEN 순서를 확인합니다. 앞에서 설명한 방법 (35)을 따릅니다.
- 시퀀싱에 의해 확인 정확한 클론을 사용하여, 대상 벡터에 A 및 B 벡터를 최종 RVD에서 RVDS를 두어 반응 # 2 (TALEN 키트)를 설치했다.
- 반응 2 (표 5)에 대한 믹스를 준비합니다.
참고 : 하LF 반응이 사용될 수있다. - 열 순환기의 반응을 놓고 다음 프로그램 실행 : 37 ° C / 10 분 + 16 ° C / 15 분 + 37 ° C / 15 분 + 80 ° C / 5 분.
- 반응 2 (표 5)에 대한 믹스를 준비합니다.
- 반응을 변환.
- 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환.
- 화학적 적격 세포를 25 ㎕의 반응물의 2.5 μl를 섞는다. 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 열은 42 ℃에서 30 초 동안 세포를 충격.
- 얼음에 튜브를 놓습니다. SOC의 125 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 진탕 배양기에서 튜브를 놓습니다.
- 플레이트 암피실린 (100 μg의 / ㎖), X-여자와 IPTG와 LB 플레이트 상에 형질 전환 세포 100 ㎕. 37 ℃에서 O / N 성장
- 화학적으로 25 μl의 유능한 세포로 각 반응의 2.5 μl를 변환.
- 각각의 반응 1-3 흰색 식민지를 선택하고 식민지 PCR 프라이머의 TAL_F1를 사용 TAL_R2 (표 2)에 의해 확인.
- 중합 효소 mastermix 물 및 프라이머의 용액을표 3에 설명했다. 식민지를 선택하고, PCR 튜브의 바닥으로 얼룩 다음 암피실린 (100 ㎕ / ml)이 2 ml의 LB에 식민지의 유물을 넣어. 식민지와 튜브에 용액 15 μl를 놓습니다.
- PCR을 프로그램 (표 6)를 실행합니다.
- 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔에 PCR을 확인합니다. 올바른 클론은 번짐 밴드의 사다리를해야합니다. 해당 스미어의 예를 들어, 34,33 참조하십시오.
- 진탕 배양기에서 37 ° C에서 LB 미디어 O / N에서 올바른 클론 2 ㎖ 문화를 성장.
- 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 미니 프렙.
- 순서 TAL_F1 및 TAL_R2 앞에서 설명한 방법 (35)을 다음과 같이 TALEN 순서를 확인합니다.
TALENs의 3 mRNA의 전사
- 37 ° C에서 2 시간 동안 2 μL 골목 I와 순서 검증 된 템플릿의 4 μg의 다이제스트. 전기 영동에 의해 1.5 % 아가 로스 겔에서 골목 I 소화 플라스미드 2 μL를 실행. 제대로 소화 플라스미드는 하나의 밴드가 표시됩니다.
- PCR을 정제 키트 프로토콜 다음 나머지 골목 I-소화 플라스미드를 정제. 용출 전에 세척 용액으로 두 번 세척 하였다. 뉴 클레아 제 무 물 30 μL로 용출.
- T3 mRNA의 생산을위한 표준 프로토콜을 따르십시오.
- 선형화 된 템플릿의 0.5 μg의를 사용하여 반 반응을 설정합니다 (위의 준비). 2 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- DNase의 (키트에 포함)의 0.5 μl를 추가하고 15 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 제조업체의 지침에 따라 mRNA의 정화. 30 μL 클레아없는 물에 용출.
- mRNA의를 확인하기 위해 전기 영동으로 1.5 % 아가 로스 젤을 실행합니다.
- 된 RNase 오염을 제거하고 1.2 % 겔을 제조 제품 겔 청소 장치.
- 믹스 1 μL mRNA의 + 4# 181; 리터 클레아없는 물 + 5 ㎕를 glyoxyl 로딩 염료. 30 분 동안 50 ℃에서 샘플을 인큐베이션. 젤을 실행하기 전에 얼음에 원심 분리기 튜브 짧게과 장소.
- 핵산 농도의 정량 방법을 사용하여 농도를 검사하고 -80 ℃에서 분취 량으로 RNA를 저장한다. RNA는 / 냉동 번 이상 해동되지 않도록 나누어지는 크기를 선택합니다.
참고 : 500 ~ 1,000 NG의 농도 / NL은 일반적으로 얻을 수있다. RNA의 무결성이 유지되는 (밴드보다는 겔상의 스미어이 정한) 저급 RNA 농도를 오랫동안 사용할 수있다.
TALEN의 mRNA 4.를 주입 아 스티 아낙 스 mexicanus 배아
- 주입을위한 도구를 준비합니다.
- 페트리 접시에 생선 물 (중탄산 나트륨과 바다 소금의 pH 7.4와 전도성 700 μS와 에어컨 물)을 1.2 % 아가로 오스를 부어 주사 판을 따르십시오. 물고기 우물을 만들기 위해 돌기 금형 (플라스틱 조각을 배치접시 안에 계란). 4 ° C에서 아가로 오스가 강화했다 금형 및 저장소를 제거합니다. 금형에 대한 자세한 내용은 36를 참조하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 바늘 풀러를 사용하여 주사 바늘을 빼냅니다.
참고 : 적절한 바늘 길이가 주사 중요하다. 너무 긴 바늘은 주사를 너무 유연 할 것입니다. 당기 바늘을위한 프로토콜은 바늘을 당겨하는 데 사용되는 장비에 따라 달라집니다. 적절한 바늘의 일례의 장비를 위해, 우리는 길이 5~6cm이다 바늘을 당긴다.도 1에 도시 한 고장시 약 0.011 mm의 선단부 외경을 가지고있다. 그러나 바늘은 개구 폭을 결정한다 (단계 4.3.4)를 교정해야한다. 바늘을 인상하기위한 예시적인 프로그램 표 7에서 확인할 수있다. - 달걀이 통과하는 개구부가 충분히 큰 있도록 피펫을 위반하여 배아 전송에 유리 피펫을 준비합니다. 깨진 끝날 때까지 불꽃더 이상 날카로운 없다.
참고 : A. 작업 할 때 유리 피펫과 유리 그릇을 사용하는 것이 중요합니다 mexicanus 계란과 배아는 끈적하고 플라스틱을 준수하므로.
- 1 셀 단계 계란을 수집합니다.
- 품종 A. mexicanus 표준 프로토콜 (37)을 다음과 같습니다.
참고 : 예를 들어, 물고기가 14 불을 유지하는 경우 : 10 어두운주기 및 소등로하고 ZT14 등으로 ZT0와 Zeitgerber 시간 (ZT)를 사용하여, ZT15과 ZT19 사이에 우리의 표면 물고기의 산란. 정확한 산란 시간은 각 실험실에 대해 결정해야합니다. - 이전 짝짓기 3-4 일 동안 물고기를 과식과 신선한 물에 물고기를 배치하여 산란을 유도한다. 온도 2 °의 F를 올립니다. 참고 : 우리의 초기 수온이 약 74 ° F입니다.
- 1 세포 단계에서 달걀을 얻기 위해 15 분마다 확인, 어둠 속에서 표면 물고기 알을 수집합니다. 계란의 수백 표면 물고기의 한 쌍에서 얻을 수 있습니다.
- 수집유리 그릇에 계란 플라스틱 표면에 부착 방지하고 정렬 현미경으로 알을 관찰하고 단일 셀입니다 계란을 수집하여 사전 주입에 1 세포 단계에서 배아를 분리 할 수 있습니다. (pH와 전도도 처리 된 성인 물고기가 보관되어있는 탱크의 물) 신선한 시스템 물에 계란을 유지합니다.
- 품종 A. mexicanus 표준 프로토콜 (37)을 다음과 같습니다.
- TALEN의 mRNA를 주입한다.
- 독성과 효율 TALEN 쌍마다 다를으로 주입을위한 최적의 농도를 측정하는 총 mRNA를 (상기 한 쌍의 각 TALEN 동일한 양)의 상이한 양을 주입한다. 400-800 페이지입니다 전체의 mRNA의 농도를 주입하여 시작합니다. 희석하고 1.5 NL를 분사 목적의 mRNA 농도를 결합한다.
- 로드 바늘의 뒷면에의 mRNA를 희석시키고 마이크로 주사기에 바늘을 연결합니다.
- 집게를 사용하여 바늘 브레이크.
- 바늘을 보정합니다. 예를 들어, 10 회 배출 및 마이크로 모세관의 결과 강하를 수집합니다. 10 × 100 일회용 1.081, L 32 mm 마이크로 모세관, 드롭 1.5 NL / 1 주입 0.5 mm에 마이크로 모세관을 작성해야합니다. 필요에 따라 분사 시간 및 압력을 조정한다.
- 하나의 셀에 바늘을 삽입하고 mRNA를 주입. 하지 노른자로, 셀에 직접 mRNA를 주입한다.
- 유리 그릇에 주입 된 배아를 수집합니다. 23 ~ 25 ℃에서 배아를 유지합니다. 죽은 태아 정기적으로 주입 다음 처음 몇 일 동안 (흐린 및 불규칙한 모양이 될 배아)를 제거합니다. 제어 (uninjected) 및 주입 판에서 죽은 변형 배아의 기록 번호.
참고 : 증가 된 mRNA의 농도가 증가 독성과 태아의 기형 / 죽음으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 효율성에 비해 독성은 주입의 mRNA의 최고 농도를 결정하기 위해 균형을 이루어야한다.
5. 표현형의 설립자 물고기와 TALEN 효율성 평가
- 기관 동물 프로토콜에 따라 배아를 희생.
참고 : 우리는 안락사빠른에 의한 배아 얼음에 냉각. - 전송 피펫을 사용하여 0.8 μl의 PCR 스트립 튜브로 배아를 수집합니다.
참고 : 유전자형 개별 배아 또는 태아의 풀을 수행 할 수 있습니다. - DNA의 압축을 풉니 다.
- 100 ㎕의 50 mM의 수산화 나트륨 (NaOH)와에 장소 배아는 4 ° C까지 다음 냉각, 30 분 동안 95 ° C에서 품어.
- 1 M 트리스 - 염산 pH가 8 1/10 일 볼륨 (10 μL)를 추가합니다.
- 단계 1.3에서 디자인 된 프라이머를 (샘플 프로토콜에 대한 표 8 및 9 참조)를 사용하여 영역에 PCR을 수행합니다. 개별 배아를 들어 DNA 1 μL는 PCR 반응에 충분하다.
- 적절한 제한 효소로 생성 된 PCR 생성물을 소화하고 전기 영동하여 1.5 % 아가 로스 겔을 실행.
- 예를 들면, 주입 된 배아의 oculocutaneous 백색증 2 (oca2) 궤적 유전형에 0을 추가하여 제한 효소 BSR I을 사용하여 PCR 생성물을 소화2 시간 동안 65 ° C에서 배양 완성 된 PCR 반응의 12.5 μL에 BSR 직접 I의 0.5 μL. 소화되지 않은 및 겔에 소화 제품을 실행합니다. 제한 효소 저항 밴드 (즉, 소화되지 않는 밴드) TALEN에 의한 돌연변이가 존재한다 (그림 2) 있음을 나타냅니다.
- (선택적) 이전 29 바와 같이 각 밴드의 강도 값을 계산하기 위해 겔 분석 도구를 사용하여 피지 38 겔의 이미지를 분석하여 미가공 생성물의 비율을 측정하여 백분율 돌연변이 비율을 계산한다.
- TA는 겔 정제 제한 효소 내성 돌연변이 밴드를 복제하고 클론을 시퀀싱하여 돌연변이 대립 유전자의 순서를 결정합니다.
- 젤은 제한이 제조업체의 지침에 따라 내성 돌연변이 밴드 효소 정화. TA는 제조업체의 지침에 따라 밴드를 복제. 식민지를 선택하고 진탕에서 37 ° C에서 1.5 ml의 LB O / N에서 성장부란기.
- 제조업체의 지침에 따라 미니 프렙 문화. 염기 서열의 DNA를 보냅니다.
- 예컨대 APE 같은 프로그램을 이용하여 야생형 서열에 돌연변이 서열 정렬.
- 복사 및 APE 파일에 두 시퀀스를 붙여 넣습니다. "도구"메뉴에서 "정렬 두 시퀀스"도구를 선택합니다.
- 드롭 다운 메뉴를 사용하여 두 개의 DNA 시퀀스를 지정합니다.
참고 : 복제 된 순서의 반대로 보완이 PCR은 클로닝 벡터에 들어갔다 방향에 따라 사용해야 할 수도 있습니다. 서열이 일치하지 않을 경우, "정렬 DNA"상자에서 "계-COM"확인란을 선택 단계를 반복합니다.
- 적절한 단계에서 표현형 및 예상 표현형 (29)에 대한 적절한 방법 (예를 들어, 그림 3)를 사용 설립자 물고기를 평가합니다. 표현형의 방법은 protoc를 사용하여 연구원의 대상 유전자의 예상 표현형을 기반으로합니다올.
생식선 전송 6. 화면
참고 : A. mexicanus 4~8개월에서 성적 성숙에 도달.
- 야생형 물고기에 성적으로 성숙 설립자 물고기를 교차.
- 화면 배아 또는 단계 5.1-5.7의 방법을 사용하여 성인 물고기 (그림 4). 성인 물고기 꼬리의 조각은 마취 다음 잘릴 수 있습니다.
- 핀 클리핑 동안 응력을 감소시키기 tricaine (3- 아미노 벤조산 에틸 에스테르)의 용액에 침지하여 생선 고기 마취. 핀 클리핑에 따라, 물고기가 민물에 복구 할 수 있습니다. 물고기는 빠르게 회복; 그들은 (일반적으로 수영) 회복 될 때까지 관찰합니다.
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Representative Results
TALEN 쌍 주사 (NHEJ)를 결합 비 상동 단부를 통해 복구 될 수 이중 가닥 나누기 39의 결과 FokI 따라서 도메인의 이량 체화를 특정 DNA 뉴클레오티드에 RVDS 바인딩을 초래한다. NHEJ 자주 삽입 또는 삭제 (삽입과 삭제)에서 발생하는 오류를 소개합니다. 삽입과 삭제가 TALEN 대상 부위 주변의 영역을 증폭하며 TALEN 스페이서 영역 내에서 절단하는 제한 효소로 생성 된 앰플 리콘 절단함으로써 식별 될 수있다. 대립 유전자는 제한 효소에 강한 밴드를 생성 (도 2) 소화되지 제한 효소 표적 서열을 변경 삽입과 삭제를 포함하면서 INDEL없는 대립 소화한다.
TALEN 주사 가능성이 A의 biallelic 유전자 돌연변이가 발생할 수 있습니다 mexicanus 29. 따라서, 일부 표현형은 설립자 물고기에서 평가 될 수있다. 에 대한 예를 들어, 우리는 TALENs 대상으로 oca2, cavefish 1,28의 여러 변종 집단에서 백색증에 대한 책임을 가정하는 유전자를 주입 표면 생선에 색소 침착을 평가 하였다. 우리는 uninjected 물고기 (29) (그림 3)에 존재하지 oca2 TALEN 주입 물고기 흰둥이 패치를 발견했다.
많은 실험을 위해, 표현형을 평가 물고기의 돌연변이 라인을 갖는 것이 바람직하다. 전송 돌연변이 대립 유전자와 설립자 물고기는 야생형 물고기 (그림 4)에 설립자 물고기의 십자가에서 자손 유전형에 의해 식별 될 수있다.
mRNA를 주입 그림 1. 바늘. 이전에 마이크로 피펫의 사진은 하나의 단세포 배아에 TALEN mRNA의 주입에 사용 깨진된다._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
TALEN mRNA의 상이한 양이 29을 주사했을 때의 아 스티 아낙 스 mexicanus에서 oca2의 엑손 9에서 Oca2. 306 bp의 PCR 제품도 2 TALEN 효율은 제한 효소 부위의 손실에 대해 조사 하였다. 앰플 리콘의 일부 TALEN 배아 주입 (10)의 풀에 대한 제한 소화 내성 동안 제어 배아로부터 앰플 리콘 소화 하였다. 효소 TALEN의 mRNA를 주입 한 배아에서 저항 밴드를 소화 제한은 oca2가 삽입과 삭제 (29)를 포함하는 것으로 나타났다 대상. 의 mRNA의 증가 농도가 증가 TALEN 효율 (더 소화되지 않은 DNA)의 결과를 주입합니다. "-"와 차선으로 차선을 소화되지 않은있다 "+"diges은테드 제한 효소로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
색소 침착의 변화 그림 3. 표현형의 설립자 물고기입니다. (A) uninjected 표면 A. 제어 mexicanus. (B) 패치 oca2 (화살표)를 대상으로 400 페이지 TALEN mRNA를 주입 설립자면 물고기 melanophores 결여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
TALEN 유도 mutatio 그림 4. 생식 계열 전송A.에서 oca2의 엑손 9에서 NS. 306 bp의 PCR 제품 mexicanus는 주입 설립자 물고기 10 F 1의 물고기 풀의 제한 효소 사이트의 손실을 조사 하였다. 앰플 리콘 (10)의 일부가 F 한 배아의 풀에 대한 제한 소화 내성 동안 제어 배아로부터 앰플 리콘 소화 하였다. 제한 효소 1 초는 삽입과 삭제 (29)를 포함하는 것으로 나타났다 oca2 F에서 저항 밴드를 소화. 와 레인은 "-" "+"제한 효소로 소화하여, 차선을 소화되지 않은 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 반응 A를 | 를 ReactiB에 | |||
| 양 | 시약 | 양 | 시약 | |
| 4 μL | 물 | 10 μL | 물 | |
| 1 μL | pFUS_A | 1 μL | pFUS_B4 | |
| 1 μL | BsaI | 1 μL | BsaI | |
| 1 μL | BSA | 1 μL | BSA | |
| 1 μL | 리가 | 1 μL | 리가 | |
| 2 μL | 10 배 리가 버퍼 | 1 μL | 10 배 리가 버퍼 | |
| 1 μL | pNH1 | 1 μL | pNG1 | |
| 1 μL | pNH2 | 1 μL | PHD2 | |
| 1 μL | pNG3 | 1 μL | pNH3 | |
| 1 μL | pHD4 | 1 μL | pNI4 | |
| 1 μL | pHD5 | |||
| 1 μL | pHD6 | |||
| 1 μL | pNG7 | |||
| 1 μL | pHD8 | |||
| 1 μL | pNG9 | |||
| 1 μL | pHD10 | |||
A에 대한 표 1 실시 예 반응 어셈블리 A 및 BTALEN 포함 RVDS NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| 프라이머 이름 | 서열 (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
(34)로부터 식민지 PCR 표 2. PCR 프라이머.
| 시약 | 양 |
| DNA 형성 촉매 mastermix 2 배 | 50 μL |
| pCR8_F1 프라이머,10 μM의 | 4 μL |
| pCR8_R1 프라이머, 10 μM의 | 4 μL |
| 클레아없는 물 | 42 μL |
| 다른 Taq를 사용하는 경우 * 마스터 믹스를 조정 | |
식민지 100 μL (15 μL / 반응) PCR 1 표 3. 마스터 믹스.
| 단계 | 온도 (° C) | 시간 (초) |
| 1 | (95) | (120) |
| 이 | (95) | (30) |
| 삼 | (55) | (30) |
| 4 | (72) | (105) |
| (5) | 30 사이클 2 단계로 이동 | |
| 6 | (72) | (300) |
식민지 PCR 1 표 4. PCR 프로그램입니다.
| 양 | 시약 | 집중 |
| 12 μL | 물 | |
| 1 μL | 벡터 A를 | 100 NG / μL |
| 1 μL | 벡터 B | 100 NG / μL |
| 1 μL | 대상 벡터 pT3Ts-GT | 50 NG / μL |
| 1 μL | 최종 RVD (PLR-RVD) | 100 NG / μL |
| 1 μL | Esp3I | |
| 1 μL | 리가 | |
| 2 μL | 10 배 리가 버퍼 | |
두 번째 조립 반응을 표 5. 프로토콜.
| 단계 | 온도 (° C) | 시간 (초) |
| 1 | (95) | (120) |
| 이 | (95) | (30) |
| 삼 | (55) | (30) |
| 4 | (72) | (180) |
| (5) | 30 사이클 2 단계로 이동 | |
| 6 | (72) | (300) |
표 6. PCR 프로그램식민지 PCR 2.
| 열 | (290) |
| 당기다 | (150) |
| 속도 | (100) |
| 시각 | (150) |
| 이러한 매개 변수는 저점 필라멘트를 사용하여 불타는 / 브라운 마이크로 피펫 풀러 모델 P-97입니다 | |
프로그램을 당겨 표 7. 샘플 바늘.
| 시약 | 양 |
| DNA 형성 촉매 mastermix 2 배 | 12.5 μL |
| 유전자 특정 정방향 프라이머, 10 μM | 1 μ엘 |
| 유전자 특정 역방향 프라이머, 10 μM | 1 μL |
| 클레아없는 물 | 9.5 μL |
| DNA | 1 μL |
| 다른 Taq를 사용하는 경우 * 마스터 믹스를 조정 | |
유전자 특정 PCR 표 8. 샘플 프로토콜입니다.
| 단계 | 온도 (° C) | 시간 (초) |
| 1 | (95) | (120) |
| 이 | (95) | (30) |
| 삼 | (56) | (30) |
| 4 | (72) | (60) |
| (5) | s로 이동35 사이클 TEP (2) | |
| 6 | (72) | (300) |
| * 특정 프라이머 및 PCR 생성물 크기 어닐링 온도 및 연기 시간을 조정 | ||
유전자 특정 PCR 표 9. 샘플 PCR 프로그램입니다.
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Discussion
커다란 진보는 특성의 전개의 유전 적 기초를 이해 향해 최근에 이루어지고있다. 형질 다수의 진화를 기초 후보 유전자가 확인되었지만, 인해 가장 흥미로운 진화 종의 유전자 취급 용이성의 부족으로 생체 내에서 이들 유전자를 테스트 도전 남아있다. 여기에서 우리는 A의 게놈 편집하는 방법을보고 mexicanus, 종 동굴 동물의 진화를 연구하는 데 사용. 유전자지도는 1,21,23 연구와 후보 유전자 A. 동굴 형태 특성의 진화에 대한 후보 유전자의 숫자를 식별 한 19,40 접근 mexicanus. cavefish 게놈 (41)의 최근 간행물은 동굴 특성의 진화에 대한 후보 유전자를 식별하기위한 추가 강력한 도구를 제공합니다. 이들 후보 유전자의 대부분의 기능을 시험하는 유전자 발현을 감소시키는 기술이 필요하다. 연구를위한 유일한 현재 옵션A의 감소 유전자 발현을 보내고 mexicanus는 morpholinos를 사용하는 것입니다. 그러나, 모르 폴리 노 유전자 최저 몇 일 후 수정 제한, 일시적인, 및 17, 과식증 (19) 및 진동 명소 행동 (42) 학교 교육 등 성인 동굴 및 표면 물고기 사이의 행동 차이와 같은 성인 동물의 특성을 연구하는데 유용하지 않습니다. 이러한 TALENs을 사용하여 제조 될 수 것과 같은 유전자의 대립 유전자 기능의 손실의 발생은 이러한 특징에 대한 후보 유전자의 역할을 테스트하기 위해 중요하다.
방법이 TALEN 쌍 (33)의 쉬운 조립 및이 방법에 대한 자세한 프로토콜 개발 된 것은 34 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜이 다른 최종 대상 벡터를 이용하여, 베델 등. (7) 지브라 피쉬에 최적화되었다 pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). 이 벡터는 하나의 단세포 제브라 피쉬 배아에 주입 TALEN의 mRNA의 전사 수 있습니다.우리는 조립하고 A.으로 주입 TALENs을 전사하기 위해, 여기에 상세하게 설명이 수정 조립 방법을 사용했다 mexicanus. 우리는 발견 단세포 표면 A.에 주입 할 때 mexicanus 배아는,이 프로토콜에서 설명 된 바와 같이, 우리는 A를 돌연변이 수 mexicanus 유전자 29. 이 프로토콜에 설명되지 않은 후보 유전자에 대한 향후 연구를 들어, 시퀀스는 41 cavefish 게놈에서 발견 TALEN 목표 위치를 식별하기 위해 사용될 수있다.
성공적인 주사에 대해 긴급 높은 품질 TALEN의 mRNA이다. 그러므로, 주입 전에 겔에서 RNA의 소량을 실행하여 RNA의 품질을 체크하는 것이 중요하고 (스텝 3.6)이다. 동결 해빙를 (3.7 단계) 방지하기 위해 분취 액을 동결하고, 주사 (4 단계) 동안 깨끗한 물과 RNAse가없는 튜브 및 팁을 사용하여 무균 상태를 유지하는 등의 유지 RNA의 무결성을위한 기타주의 사항,주의해야한다. 상승 주입 물고기에 추가 중요한 단계이다죽은 배아 빠르게 수질에 영향을 미칠 수 있으므로, 사출 다음 죽은 배아 청소. 따라서, 우리는 주사를 다음 아침 죽은 태아를 제거하고 정기적으로 다음 몇 일 동안 건강하게 살아있는 배아 (단계 4.3.6)를 유지하기 위해 주사를 다음과 같습니다.
아 스티 아낙 스의 mexicanus에서 TALEN의 돌연변이는 고도로 효율적인 할 수있다; 그러나, 효율은 TALEN 쌍에 따라서 (29)를 주입 달라집니다. 증가 mRNA의 농도가 증가 독성과 기형 및 주입 된 배아의 죽음으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 효율성에 비해 독성 시험 및 주입의 mRNA의 최적 농도를 결정하기 위해 균형을 이루어야한다. 고효율 TALEN 쌍의 경우, 표현형은 주입 설립자 물고기에서 평가 될 수있다. 예를 들어, TALENs 대상으로 oca2의 주입은 표면 물고기 29 흰둥이 패치 (그림 3) 결과. 다른 특성 또는 유전자 위해, 그러나, 설립자 물고기의 표현형의 평가로 인해 도전 할 수있다미묘하게 표현형 또는 주입 된 TALEN 쌍의 낮은 효율성이다. 따라서, 많은 응용을 위해 비 모자이크 동물에서의 후보 유전자의 역할의 분석에 관심있는 유전자의 생식 세포 돌연변이를 생성하는 것이 바람직 할 것이다. A.에서 TALEN에 의한 돌연변이의 취득 배아 전송 mexicanus 29 (그림 4) 할 수있다. 따라서,이 기술은 다른 후보 유전자를 평가하기 위해 적용될 수있다.
아 스티 아낙 스의 mexicanus에 유전자 조작을 수행하는 몇 가지 제한이 시간에 존재한다. 표면 늦은 밤 어둠 속에서 cavefish 품종. 이 산란 후 즉시 주입하는 것이 중요합니다으로 빛 어두운주기를 반전 할 수 없습니다 실험실에서 연구자들은, 주사를 수행하기 위해 밤 늦게 와서해야합니다. 빛이 산란에 영향을 미칠 것 같이 또한, 어둠 속에서 표면 물고기 배아를 수집하는 것이 중요하다.
이 특별히 다른 기술,(43에서 검토)에 CRISPR / 카스 시스템을 LAR, 게놈 편집을 위해 존재 가능성 A.에 적용됩니다 mexicanus. 사실, 가이드 RNA 조립 프로토콜은 신속하고 44 쉽게 그 존재 프로토콜은 CRISPR / 카스 주입 수정할 수 있습니다 여기에보고했다. 또한, 게놈 편집을위한 새로운 애플리케이션을 빠르게 개발되고 있으며, 이들의 대부분은 A에 대한 유용 할 수있다 mexicanus 연구원. 예컨대, 제브라 피쉬 정확한 돌연변이 돌연변이 (7)를 포함하는 단일 가닥 올리고으로 TALENs을 coinjecting하여 관심의 유전자를 만들어왔다. 이 기술은 cavefish 및 표면 물고기 (19) 사이에 관찰 신진 대사의 차이에서 MC4R의 특정 동굴 대립 유전자의 과오 돌연변이의 역할과 동굴 표현형을 생성하는 동굴 대립 유전자의 역할을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다. TALENs 또한 형광 마커 내가 표현 상동 재조합을 통해 유전자의 대립 유전자를 생성하는 데 사용 된내인성 좌위 (45)와 유사한 n 개의 패턴입니다. 이러한 방법은 A.에 사용될 수있는 mexicanus 세포 또는 후보 유전자의 발현의 하위 집합을 평가합니다. CRISPR / CAS 시스템은 조직 특이 적 유전자 넉 아웃 (46)을 얻기 위해 제브라 사용되고있다. A. 적용이 기술, mexicanus, 이러한 cavefish의 눈 손실과 같은 프로세스의 유전 적 기초를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 렌즈 cavefish 47 시력 상실의 과정에서 중요한 역할을하고, 조직 - 특이 CRISPR / CAS 시스템은 특히 눈의 다른 조직에 비해 렌즈 안구 손실 후보 유전자의 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다. 이들 및 다른 게놈 편집 기술은 A. 이용 될 수있다 미래 연구에 mexicanus 동굴 특성의 진화에 관한 중요한 질문에 대답합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 유전학, 개발 및 세포 생물학 및 아이오와 주립 대학의학과 및 NIH 보조금 EY024941 (WJ) 싱거에 의해 투자되었다. 제프리 Essner는 원고에 대한 의견을 제공했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
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