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Biology

में जीनोम एडिटिंग Published: June 20, 2016 doi: 10.3791/54113
Automatic Translation
1, 2, 3
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

Summary

जीन को लक्षित mutagenesis के जीनोम संपादन तकनीक का उपयोग कर जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में अब संभव है। यहाँ, हम Astyanax mexicanus, मछली की एक प्रजाति है कि सतह मछली और cavefish भी शामिल है में प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) की तरह प्रतिलेखन उत्प्रेरक का उपयोग कर लक्षित जीन mutagenesis के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है।

Introduction

विशेषता विकास के आनुवंशिक आधार को समझने विकासवादी जीव का एक महत्वपूर्ण अनुसंधान लक्ष्य है। काफी प्रगति लक्षण के विकास अंतर्निहित लोकी की पहचान करने और इन लोकी (उदाहरण के लिए 1-3) के भीतर उम्मीदवार जीन pinpointing में किया गया है। हालांकि, कार्यात्मक परीक्षण के इन जीनों की भूमिका के रूप में कई लक्षण के विकास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल जीवों को चुनौती देने वाली बनी हुई है वर्तमान में आनुवंशिक रूप से विनयशील नहीं हैं। जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों के आगमन बहुत जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के आनुवंशिक manipulability बढ़ गया है। ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPRs) जीवों (उदाहरण के लिए 4-11) की संख्या में जीन में म्यूटेशन लक्षित उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ये उपकरण, एक evolutionarily प्रासंगिक प्रणाली को लागू किया है, जिस तरह विकासवादी जीव विकास के आनुवंशिक आधार अध्ययन में क्रांतिकारी बदलाव की क्षमता है।

Astyanax mexicanus मछली की एक प्रजाति है कि दो रूपों में मौजूद है। एक नदी में रहने वाली सतह फार्म (सतह मछली) और कई गुफा में रहने वाली रूपों (cavefish) ए mexicanus cavefish सतह मछली पूर्वजों (12 में समीक्षा) से विकसित हुआ। Cavefish की आबादी आंखों की हानि सहित, कमी या रंजकता के नुकसान के लक्षण की एक संख्या विकसित किया है, वृद्धि हुई स्वाद और कपाल neuromasts, और परिवर्तन की संख्या में इस तरह के स्कूली शिक्षा के व्यवहार की हानि, बढ़ आक्रामकता, आसन और hyperphagia 13 खिलाने में परिवर्तन के रूप में व्यवहार में -19। Cavefish और सतह मछली interfertile हैं, और आनुवंशिक मानचित्रण प्रयोगों गुफा लक्षण 1,20-26 के लिए लोकी और उम्मीदवार जीनों की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। कुछ उम्मीदवार जीन अन्य प्रजातियों के 21 मॉडल जीवों में या overexpression 27 या क्षणिक पछाड़ना यू द्वारा सेल संस्कृति 1,19 में गुफा लक्षण में योगदान करने में एक कार्यात्मक भूमिका के लिए परीक्षण किया गया है,ए में morpholinos 28 गाना mexicanus। हालांकि, इन तरीकों में से प्रत्येक सीमाएँ हैं। ए में इन जीनों की उत्परिवर्ती alleles उत्पन्न करने की क्षमता mexicanus cavefish के विकास में उनके कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, ए mexicanus जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों के आवेदन के लिए एक आदर्श उम्मीदवार जीव है।

यहाँ हम ए में जीनोम संपादन के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार mexicanus TALENS का उपयोग कर। इस विधि phenotypes के लिए और ब्याज 29 के जीन में म्यूटेशन स्थिर साथ मछली की तर्ज अलग-थलग करने के लिए पच्चीकारी इंजेक्शन संस्थापक मछली का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार में थे और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी में और मैरीलैंड विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. TALEN डिजाइन

  1. एक TALEN डिजाइन वेबसाइट के लिए इनपुट वांछित लक्ष्य अनुक्रम। (उदाहरण के लिए: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen )। इनपुट स्पेसर / दोहराने सरणी लंबाई चुना।
    1. लेबल बॉक्स "अनुक्रम" में जीनोमिक अनुक्रम कॉपी करें।
    2. "कस्टम स्पेसर / RVD लंबाई प्रदान करें" टैब के भीतर स्पेसर लंबाई और सरणी की लंबाई का चयन करें।
      नोट: 15 आधार जोड़े की स्पेसर लंबाई और अच्छी तरह से 15-17 काम की सरणी लंबाई दोहराने और विधानसभा कम जटिल बनाते हैं।
  2. एक TALEN जोड़ी का चयन करें। एक अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइट के आसपास डिजाइन TALEN जोड़े प्रतिबंध एंजाइम द्वारा जीनोटाइपिंग पचाने के लिए अनुमतिएक पीसीआर उत्पाद।
  3. डिजाइन प्राइमरों TALEN लक्ष्य ऐसे Primer3 30-32 के रूप में एक वेबसाइट का उपयोग कर साइट आसपास के जीनोमिक क्षेत्र बढ़ाना। जब एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ जीनोटाइपिंग, डिजाइन प्राइमरों एक क्षेत्र है कि केवल एक बार प्रतिबंध एंजाइम साइट शामिल बढ़ाना। यह सिफारिश की है कि इस क्षेत्र प्रवर्धित और TALEN निर्माण किसी भी ए में मौजूद बहुरूपताओं की पहचान करने के लिए पहले अनुक्रम है mexicanus प्रयोगशाला आबादी microinjection के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

2. TALEN सभा (TALEN किट प्रोटोकॉल से संशोधित) 33,34

अतिरिक्त विवरण और समस्या निवारण के लिए, प्रोटोकॉल 34 देखें।

  1. तैयार है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार TALEN किट से आवश्यक plasmids अनुक्रम।
  2. सेट अप # 1 प्रतिक्रियाओं ए और बी के लिए प्रतिक्रियाओं शामिल दोहराने-चर diresidues (RVDS) 1-10 और रिएक्शन ए में गंतव्य वेक्टर pFUS_A RVDS शामिल 11 (एन -1) और वेंई गंतव्य वेक्टर pFUS_B (एन -1) रिएक्शन बी में जहां एन TALEN में RVDS की कुल संख्या है।
    1. प्रत्येक प्रतिक्रिया में जोड़ें: प्रत्येक RVD (100 एनजी / μl), गंतव्य वेक्टर (100 एनजी / μl), 1 μl Bsa मैं प्रतिबंध एंजाइम, 1 μl गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) (2 मिलीग्राम / एमएल युक्त प्रत्येक प्लाज्मिड की 1 μl ), 1 μl ligase, 20 μl की कुल मात्रा के लिए पानी की μl 10x ligase बफर और एक्स के 2 μl। उदाहरण के लिए, 1 टेबल देखें।
      नोट: आधा प्रतिक्रियाओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. thermocycler में प्रतिक्रियाओं की जगह और चक्र को चलाने: 10x (37 डिग्री सेल्सियस / 5 मिनट + 16 डिग्री सेल्सियस / 10 मिनट) 50 डिग्री सेल्सियस / 5 मिनट + 80 डिग्री सेल्सियस / 5 मिनट।
  3. nuclease साथ प्रतिक्रियाओं सेते हैं। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 1 μl 25 मिमी एटीपी और 1 μl nuclease जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
  4. प्रतिक्रियाओं रूपांतरण।
    1. 25 μl रासायनिक सक्षम कोशिकाओं में प्रत्येक प्रतिक्रिया के 2.5 μl रूपांतरण।
      नोट: घर का बना सक्षम गएल का इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, कम क्षमता के साथ कोशिकाओं कालोनियों की कमी हो सकती है।
      1. रासायनिक सक्षम कोशिकाओं के 25 μl के साथ प्रतिक्रिया के 2.5 μl मिक्स। पांच मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      2. बर्फ पर ट्यूबों 2 मिनट के लिए रखें। Catabolite दमन (समाज) के साथ सुपर इष्टतम शोरबा के 125 μl जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नलियों हिला।
    2. प्लेट spectinomycin (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ लेग प्लेटों पर बदल कोशिकाओं के 100 μl, एक्स-लड़की और isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)। 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें हे / एन।
  5. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 2-3 सफेद कालोनियों उठाओ और प्राइमरों pCR8_F1 और pCR8_R1 (तालिका 2) का उपयोग कॉलोनी पीसीआर द्वारा जाँच करें।
    1. अभिकर्मकों के एक मास्टर मिश्रण बनाओ। उदाहरण के लिए, 3 टेबल देखें।
    2. एक कॉलोनी उठाओ और एक पीसीआर ट्यूब के नीचे में यह धब्बा है, और फिर spectinomycin के साथ 2 मिलीलीटर लेग में कॉलोनी के अवशेष डाल(50 माइक्रोग्राम / एमएल)। कॉलोनी के साथ ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 15 μl रखें।
    3. निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम चलाएं (तालिका 4)
    4. वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 1.5% agarose जेल पर पीसीआर (पूरी मात्रा चलाने के लिए) की जाँच करें। सही क्लोन होने की उम्मीद आकार में एक बैंड के रूप में अच्छी तरह से एक धब्बा और बैंड की एक सीढ़ी होगा। उचित धब्बा का एक उदाहरण के लिए, 34,33 देखें।
    5. एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर लेग मीडिया हे / एन में सही क्लोन के 2 मिलीलीटर संस्कृतियों आगे बढ़ें।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार plasmids miniprep।
  7. अनुक्रम pCR8_F1 और pCR8_R1 साथ TALEN अनुक्रम जाँच करें। पहले से वर्णित विधि 35 का पालन करें।
  8. अनुक्रमण द्वारा सत्यापित सही क्लोन का उपयोग करना, प्रतिक्रिया # 2 (TALEN किट) है, जो गंतव्य वेक्टर में ए और बी वैक्टर और अंतिम RVD से RVDS जगह होगी की स्थापना की।
    1. प्रतिक्रिया 2 (5 तालिका) के लिए मिश्रण तैयार करें।
      नोट: हावामो प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. thermocycler में प्रतिक्रियाओं की जगह और निम्न कार्यक्रम चलाने: 37 डिग्री सेल्सियस / 10 मिनट + 16 डिग्री सेल्सियस / 15 मिनट + 37 डिग्री सेल्सियस / 15 मिनट + 80 डिग्री सेल्सियस / 5 मिनट।
  9. प्रतिक्रियाओं रूपांतरण।
    1. 25 μl रासायनिक सक्षम कोशिकाओं में प्रत्येक प्रतिक्रिया के 2.5 μl रूपांतरण।
      1. रासायनिक सक्षम कोशिकाओं के 25 μl के साथ प्रतिक्रिया के 2.5 μl मिक्स। 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। गर्मी 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए कोशिकाओं को झटका।
      2. बर्फ पर ट्यूबों रखें। समाज के 125 μl जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में ट्यूबों रखें।
    2. प्लेट एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल), एक्स-लड़की और IPTG के साथ लेग प्लेटों पर बदल कोशिकाओं के 100 μl। हे / एन आगे बढ़ें 37 डिग्री सेल्सियस पर
  10. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 1-3 सफेद कालोनियों उठाओ और कॉलोनी पीसीआर प्राइमरों TAL_F1 का उपयोग कर और TAL_R2 (तालिका 2) से जाँच करें।
    1. पोलीमर्स mastermix, पानी और प्राइमरों के रूप का समाधान करेंतालिका 3 में वर्णित है। एक कॉलोनी उठाओ और एक पीसीआर ट्यूब के नीचे में यह धब्बा है, और फिर एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ 2 मिलीलीटर लेग में कॉलोनी के अवशेष डाल दिया। कॉलोनी के साथ ट्यूब में समाधान के 15 μl रखें।
    2. पीसीआर कार्यक्रम (तालिका 6) चलाएँ।
    3. वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 1.5% agarose जेल पर पीसीआर की जाँच करें। सही क्लोन एक smearing और बैंड की एक सीढ़ी होगा। उचित धब्बा का एक उदाहरण के लिए, 34,33 देखें।
    4. एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर लेग मीडिया हे / एन में सही क्लोन के 2 मिलीलीटर संस्कृतियों आगे बढ़ें।
  11. निर्माता के निर्देशों के अनुसार plasmids miniprep।
  12. अनुक्रम TAL_F1 और TAL_R2 पहले वर्णित विधियों 35 निम्नलिखित के साथ TALEN अनुक्रम जाँच करें।

3. TALENS की mRNA ट्रांसक्रिप्शन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 2 μl सैक के साथ मैं डाइजेस्ट अनुक्रम सत्यापित टेम्पलेट के 4 माइक्रोग्राम। वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 1.5% agarose जेल पर सैक मैं पचा प्लाज्मिड के 2 μl चलाएँ। प्लास्मिड कि सही ढंग से पच जाता है एक एकल बैंड को प्रदर्शित करेगा।
  2. पीसीआर शुद्धि किट प्रोटोकॉल के बाद शेष सैक मैं पचा प्लाज्मिड शुद्ध। धोने के समाधान के लिए पहले क्षालन के साथ दो बार धोएं। nuclease मुक्त पानी के 30 μl में Elute।
  3. T3 mRNA उत्पादन के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन करें।
    1. (ऊपर) तैयार linearized टेम्पलेट के 0.5 माइक्रोग्राम का उपयोग कर आधा प्रतिक्रियाओं सेट करें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. DNase (किट में शामिल है) के 0.5 μl जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. mRNA शुद्ध, निर्माता के निर्देशों का पालन। 30 μl nuclease मुक्त पानी में Elute।
  5. mRNA की जाँच करने के वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 1.5% agarose जेल चला।
    1. एक उत्पाद के साथ जेल तंत्र को साफ RNase संदूषण को खत्म करने और एक 1.2% जेल तैयार करने के लिए।
    2. मिक्स 1 μl mRNA 4 &# 181; एल nuclease मुक्त पानी + 5 μl glyoxyl लोडिंग डाई। 30 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। अपकेंद्रित्र ट्यूब के संक्षिप्त और बर्फ पर जगह जेल चलाने से पहले।
  6. एकाग्रता न्यूक्लिक एसिड सांद्रता बढ़ाता की एक विधि का उपयोग कर चेक करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में शाही सेना की दुकान। एक विभाज्य आकार इस तरह है कि शाही सेना जम नहीं रहा है / एक बार से अधिक thawed चुनें।
    नोट: 500-1,000 एनजी की सांद्रता / nl आम तौर पर प्राप्त कर रहे हैं। एक कम एकाग्रता के साथ शाही सेना के रूप में लंबे समय तक इस्तेमाल किया जा सकता रूप में शाही सेना अखंडता को बनाए रखा है (जैसा कि जेल पर एक धब्बा एक बैंड के बजाय द्वारा मूल्यांकन)।

4. इंजेक्षन Astyanax mexicanus TALEN mRNA के साथ भ्रूण

  1. इंजेक्शन के लिए उपकरण तैयार करें।
    1. एक पेट्री डिश में मछली पानी में 1.2% agarose डालने का कार्य (सोडियम बाइकार्बोनेट और समुद्री नमक 7.4 पीएच और चालकता 700 μS साथ वातानुकूलित पानी) द्वारा इंजेक्शन प्लेटों डालो। एक मोल्ड (अनुमानों के साथ प्लास्टिक के टुकड़े मछली के लिए कुओं बनाने के लिए जगहअंडे) डिश के अंदर। ढालना जब agarose कठोर है और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान निकालें। के लिए मिट्टी पर विवरण 36 देखें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सुई खींचने का उपयोग इंजेक्शन के लिए सुइयों खींचो।
      नोट: उपयुक्त सुई लंबाई इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है। सुई कि बहुत लंबे होते हैं इंजेक्शन के लिए भी लचीला हो जाएगा। खींच सुइयों के लिए प्रोटोकॉल सुई खींचने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के साथ अलग अलग होंगे। एक उचित सुई का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है। हमारे उपकरणों के लिए, हम सुइयों कि लंबाई में 5-6 सेमी हैं खींच, और जब टूट लगभग 0.011 मिमी की नोक पर एक बाहरी व्यास की है। हालांकि, सुई (कदम 4.3.4) खोलने चौड़ाई निर्धारित करने के लिए calibrated किया जाना चाहिए। सुई खींचने के लिए एक उदाहरण कार्यक्रम टेबल 7 में पाया जा सकता है।
    3. पिपेट तोड़ने के लिए इतना है कि उद्घाटन के एक अंडे के माध्यम से पारित करने के लिए काफी बड़ी है द्वारा भ्रूण हस्तांतरण के लिए कांच pipettes तैयार करें। टूट अंत तक ज्वालायह अब तेज है।
      नोट: यह जब ए के साथ काम कर कांच pipettes और कांच के कटोरे का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है mexicanus अंडे और भ्रूण वे अवरुद्ध कर रहे हैं और प्लास्टिक का पालन करना होगा।
  2. 1 सेल चरण अंडे ले लीजिए।
    1. नस्ल ए mexicanus मानक प्रोटोकॉल 37 के बाद।
      नोट: उदाहरण के लिए, अगर मछली एक 14 प्रकाश पर रखा जाता है, हमारे ZT15 और ZT19 के बीच सतह मछली के अंडे 10 अंधेरे चक्र और रोशनी के रूप में ZT0 साथ Zeitgerber समय (ZT) के प्रयोग पर और ZT14 के रूप में बंद रोशनी। सटीक स्पॉन समय प्रत्येक व्यक्ति प्रयोगशाला के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।
    2. संभोग करने से पहले 3-4 दिनों के लिए मछली overfeeding और ताजा पानी में मछली रखकर स्पॉन प्रेरित। तापमान 2 डिग्री एफ उठाएँ। नोट: हमारी प्रारंभिक पानी का तापमान लगभग 74 डिग्री फेरनहाइट है।
    3. अंधेरे में सतह मछली अंडे ले लीजिए, हर 15 मिनट की जाँच 1 सेल मंच पर अंडे प्राप्त करने के लिए। अंडे के सैकड़ों सतह मछली की एक जोड़ी से प्राप्त किया जा सकता है।
    4. लीजिएकांच के कटोरे में अंडे प्लास्टिक की सतहों से चिपके रोकने के लिए और क्रमबद्ध खुर्दबीन के नीचे अंडे देख और अंडे कि एक एकल कोशिका हैं इकट्ठा करके इंजेक्शन से पहले 1 सेल चरण में भ्रूण को अलग-थलग करने के लिए। ताजा सिस्टम पानी (पानी की टंकी, जिसमें वयस्क मछली रखे जाते हैं, जो पीएच और चालकता के लिए इलाज किया गया है) में अंडे रखें।
  3. TALEN mRNA इंजेक्षन।
    1. इंजेक्शन के लिए इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए विषाक्तता और दक्षता के रूप में TALEN जोड़ी के हिसाब से बदलती कुल mRNA (जोड़ी में प्रत्येक talen के बराबर मात्रा) के विभिन्न मात्रा इंजेक्षन। कि 400-800 स्नातकोत्तर हैं, कुल mRNA की सांद्रता इंजेक्शन लगाने के द्वारा शुरू करो। पतला और 1.5 nl इंजेक्शन लगाने के लिए वांछित सांद्रता के लिए mRNA गठबंधन।
    2. लोड सुई के पीछे में mRNA पतला और एक माइक्रो सुई लगानेवाला के लिए सुई देते हैं।
    3. सुई तोड़ संदंश का उपयोग।
    4. सुई जांचना। उदाहरण के लिए, 10 बार बेदखल करना और एक माइक्रो केशिका में जिसके परिणामस्वरूप बूंद इकट्ठा। 10 x 100 डिस्पोजेबल 1.081, एल, 32 मिमी सूक्ष्म केशिका, ड्रॉप 1.5 nl / 1 इंजेक्शन के लिए 0.5 मिमी के लिए माइक्रो केशिका भरना चाहिए। जरूरत के रूप में इंजेक्शन समय और दबाव को समायोजित करें।
    5. एकल कक्ष में सुई डालें और mRNA इंजेक्षन। mRNA सीधे जर्दी में नहीं, सेल में इंजेक्षन।
    6. कांच के कटोरे में इंजेक्शन भ्रूण लीजिए। 23-25 ​​डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण रखें। मृत भ्रूण (भ्रूण कि बादल छाए रहेंगे और अनियमित आकार के हो जाते हैं) इंजेक्शन के बाद पहले कुछ दिनों के लिए नियमित रूप से निकालें। नियंत्रण (uninjected) और इंजेक्शन प्लेटों से मर चुका है और विकृत भ्रूण की रिकार्ड संख्या।
      नोट: वृद्धि mRNA एकाग्रता में वृद्धि हुई विषाक्तता और भ्रूण की विकृति / मौत हो सकती है। इस प्रकार, विषाक्तता दक्षता बनाम mRNA की सबसे अच्छी एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इंजेक्षन करने के लिए संतुलित किया जाना चाहिए।

5. Phenotype संस्थापक मछली और TALEN दक्षता का मूल्यांकन

  1. संस्थागत पशु प्रोटोकॉल के अनुसार भ्रूण बलिदान।
    नोट: हम euthanizeतेजी से भ्रूण बर्फ पर द्रुतशीतन।
  2. 0.8 μl पीसीआर पट्टी एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग ट्यूबों में भ्रूण लीजिए।
    नोट: जीनोटाइपिंग व्यक्तिगत भ्रूण या भ्रूण की ताल पर किया जा सकता है।
  3. डीएनए निकालें।
    1. 100 μl 50 मिमी सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) और में जगह भ्रूण 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, तो 4 डिग्री सेल्सियस तक शांत।
    2. 1 एम Tris एचसीएल पीएच 8 के 1/10 वें मात्रा (10 μl) जोड़ें।
  4. क्षेत्र प्राइमरों 1.3 चरण में तैयार (नमूना प्रोटोकॉल के लिए टेबल्स 8 और 9 देखें) का उपयोग करने पर एक पीसीआर प्रदर्शन करना। व्यक्तिगत भ्रूण के लिए डीएनए की 1 μl पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त है।
  5. उचित प्रतिबंध एंजाइम के साथ जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट और वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक 1.5% agarose जेल चला रहे हैं।
    1. उदाहरण के लिए, इंजेक्शन भ्रूण में oculocutaneous रंगहीनता 2 (oca2) ठिकाना जीनोटाइपिंग के लिए पीसीआर उत्पाद 0 जोड़कर प्रतिबंध एंजाइम बीएसआर मैं का उपयोग कर पचानेपूरा पीसीआर प्रतिक्रिया के 12.5 μl, 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर incubating को बीएसआर मैं सीधे .5 μl। पचाया नहीं है और एक जेल पर पचा उत्पाद चलाएँ। प्रतिबंध एंजाइम प्रतिरोधी बैंड (यानी, बैंड है कि पचा नहीं है) से संकेत मिलता है कि TALEN प्रेरित म्यूटेशन वर्तमान (चित्रा 2) कर रहे हैं।
  6. (वैकल्पिक) फ़िजी 38 में जैल की छवियों का विश्लेषण करने के रूप में पहले 29 में वर्णित प्रत्येक बैंड की तीव्रता मूल्य की गणना करने के लिए जेल विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके काटा हुआ उत्पाद के प्रतिशत के निर्धारण से गणना प्रतिशत उत्परिवर्तन दर।
  7. टीए जेल शुद्ध प्रतिबंध एंजाइम प्रतिरोधी उत्परिवर्ती बैंड क्लोनिंग और क्लोन अनुक्रमण द्वारा उत्परिवर्ती alleles के अनुक्रम का निर्धारण।
    1. जेल प्रतिबंध निर्माता के निर्देशों का पालन प्रतिरोधी उत्परिवर्ती बैंड एंजाइम शुद्ध। प्रादेशिक सेना के बैंड निर्माता के निर्देशों का पालन क्लोन। कालोनियों उठाओ और एक मिलाते में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर लेग हे / एन में हो जानाइनक्यूबेटर।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन miniprep संस्कृतियों। अनुक्रमण के लिए डीएनए भेजें।
    3. इस तरह के बंदर के रूप में एक कार्यक्रम का उपयोग करना, wildtype अनुक्रम को उत्परिवर्ती दृश्यों संरेखित।
      1. कॉपी और बंदर फाइलों में दोनों दृश्यों पेस्ट करें। "उपकरण" मेनू से "संरेखित दो दृश्यों" उपकरण चुनें।
      2. लटकती मेनू का उपयोग कर दो डीएनए दृश्यों निर्दिष्ट करें।
        नोट: क्लोन अनुक्रम के रिवर्स पूरक दिशा पीसीआर क्लोनिंग वेक्टर में चला गया के आधार पर किया जाना पड़ सकता है। दृश्यों के लिए पंक्ति में नहीं है, कदम जाँच "संरेखित डीएनए" बॉक्स में "रेव कॉम" बॉक्स को दोहराएँ।
  8. उचित स्तर पर phenotypes और उम्मीद phenotype 29 के लिए उचित तरीकों (उदाहरण के लिए, चित्रा 3) का उपयोग करने के लिए संस्थापक मछली का मूल्यांकन। phenotyping के तरीके protoc का उपयोग जीन के लिए उम्मीद की phenotype के शोधकर्ता द्वारा लक्षित आधार पर किया जाएगाराजभाषा।

6. जर्मलाइन ट्रांसमिशन के लिए स्क्रीन

नोट: ए mexicanus 4-8 महीनों में यौन परिपक्वता तक पहुँचने।

  1. जंगली प्रकार मछली के लिए यौन परिपक्व संस्थापक मछली को पार।
  2. स्क्रीन भ्रूण या वयस्क मछली कदम 5.1-5.7 में तरीकों का उपयोग कर (चित्रा 4)। वयस्क मछली के लिए, पूंछ का एक टुकड़ा anesthetization निम्नलिखित काटा जा सकता है।
    1. tricaine (3 aminobenzoic एसिड एथिल एस्टर) का एक समाधान में मछली जलमग्न पंख क्लिपिंग के दौरान तनाव को कम करने के द्वारा मछली anesthetize। पंख कतरन के बाद, मछली ताजे पानी में ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं। मछली तेजी से ठीक हो; निरीक्षण जब तक वे बरामद किया है (आम तौर पर तैर रहे हैं)।

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Representative Results

TALEN जोड़ी इंजेक्शन विशिष्ट डीएनए न्यूक्लियोटाइड को RVDS की FokI डोमेन की dimerization बाध्यकारी है और इस तरह के परिणाम, डबल असहाय टूटता 39 जो शामिल होने (NHEJ) गैर मुताबिक़ अंत के माध्यम से ठीक किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप। NHEJ अक्सर त्रुटियों कि सम्मिलन या विलोपन (indels) में परिणाम का परिचय। Indels TALEN लक्ष्य साइट आसपास के क्षेत्र amplifying और प्रतिबंध एंजाइम है कि TALEN स्पेसर क्षेत्र के भीतर कटौती के साथ जिसके परिणामस्वरूप amplicon पचाने के द्वारा पहचाना जा सकता है। एक INDEL बिना alleles जबकि alleles indels कि प्रतिबंध एंजाइम लक्ष्य अनुक्रम बदल हजम नहीं होगा युक्त, चित्रा (2) एक प्रतिबंध एंजाइम प्रतिरोधी बैंड के उत्पादन पचा जाएगा।

TALEN इंजेक्शन की संभावना ए में biallelic जीन म्यूटेशन में परिणाम कर सकते हैं mexicanus 29। इस प्रकार, कुछ phenotypes संस्थापक मछली में मूल्यांकन किया जा सकता है। के लिये उदाहरण के लिए, हम सतह मछली TALENS को निशाना oca2, जीन cavefish 1,28 के कई सूरजमुखी मनुष्य आबादी में रंगहीनता के लिए जिम्मेदार होने की धारणा के साथ इंजेक्शन में रंजकता मूल्यांकन किया है। हम oca2 TALEN इंजेक्शन मछली uninjected मछली 29 (चित्रा 3) में नहीं वर्तमान में सूरजमुखी मनुष्य पैच पाया।

कई प्रयोगों के लिए, यह phenotypes के मूल्यांकन के लिए मछली के उत्परिवर्ती लाइनों के लिए वांछनीय है। उत्परिवर्ती alleles प्रेषित साथ संस्थापक मछली जंगली प्रकार मछली (चित्रा 4) के संस्थापक मछली के पार से संतान जीनोटाइपिंग द्वारा की पहचान की जा सकती है।

आकृति 1
चित्रा 1. mRNA इंजेक्शन लगाने के लिए सुई। पहले एक micropipette की तस्वीर एक कोशीय भ्रूण में TALEN mRNA इंजेक्शन लगाने के लिए इस्तेमाल किया तोड़ा जा रहा है।_upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. TALEN Astyanax mexicanus में oca2 की एक्सॉन 9 से Oca2। 306 बीपी पीसीआर उत्पादों के लिए दक्षता प्रतिबंध एंजाइम साइट के नुकसान के लिए जांच की गई जब TALEN mRNA के विभिन्न मात्रा 29 इंजेक्शन थे। एक नियंत्रण भ्रूण से amplicon पचा जबकि amplicon के एक हिस्से को 10 के पूल TALEN इंजेक्शन भ्रूण में प्रतिबंध पचाने के लिए प्रतिरोधी किया गया था। प्रतिबंध एंजाइम TALEN mRNA के साथ इंजेक्शन भ्रूण से प्रतिरोधी बैंड पचाने लक्षित oca2 indels 29 को रोकने के लिए दिखाया गया है। नोट इंजेक्शन कि mRNA की बढ़ती सांद्रता बढ़ गई TALEN दक्षता (अधिक पचाया डीएनए) में परिणाम है। "-" के साथ गलियों के साथ पचाया नहीं कर रहे हैं, गलियों "+" diges हैंप्रतिबंध एंजाइम के साथ टेड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
रंजकता में परिवर्तन के लिए चित्रा 3. phenotyping संस्थापक मछली। (ए) पर नियंत्रण uninjected सतह ए mexicanus। (बी) पैच को निशाना oca2 (तीर) के एक संस्थापक सतह मछली 400 पीजी TALEN mRNA के साथ इंजेक्शन में melanophores कमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. TALEN प्रेरित mutatio की जर्मलाइन संचरणएनएस। ए में oca2 की एक्सॉन 9 से 306 बीपी पीसीआर उत्पादों mexicanus एक इंजेक्शन संस्थापक मछली से 10 एफ 1 मछली के पूल में प्रतिबंध एंजाइम साइट के नुकसान के लिए जांच की गई। एक नियंत्रण भ्रूण से amplicon पचा जबकि amplicon के एक हिस्से को 10 एफ 1 भ्रूण के पूल में प्रतिबंध पचाने के लिए प्रतिरोधी किया गया था। प्रतिबंध एंजाइम प्रतिरोधी बैंड oca2 एफ से 1 एस indels 29 को रोकने के लिए दिखाया गया है पचाने। साथ लेन "-" के साथ "+" प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा रहे हैं पचाया नहीं कर रहे हैं, गलियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रतिक्रिया एक reactiबी पर
रकम अभिकर्मक रकम अभिकर्मक
4 μl पानी 10 μl पानी
1 μl pFUS_A 1 μl pFUS_B4
1 μl BsaI 1 μl BsaI
1 μl बीएसए 1 μl बीएसए
1 μl ligase 1 μl ligase
2 μl 10x Ligase बफर 1 μl 10x Ligase बफर
1 μl pNH1 1 μl pNG1
1 μl pNH2 1 μl pHD2
1 μl pNG3 1 μl pNH3
1 μl pHD4 1 μl pNI4
1 μl pHD5
1 μl pHD6
1 μl pNG7
1 μl pHD8
1 μl pNG9
1 μl pHD10

तालिका 1. उदाहरण प्रतिक्रिया विधानसभा ए और बी एक के लिएTALEN युक्त RVDS राष्ट्रीय राजमार्ग एनएच NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-राष्ट्रीय राजमार्ग नी एनजी।

प्राइमर नाम अनुक्रम (5'-3 ')
pCR8_F1 ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1 cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1 ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2 ggcgacgaggtggtcgttgg

तालिका 2 कॉलोनी पीसीआर के लिए पीसीआर प्राइमरों, 34 से।

अभिकर्मक रकम
Taq mastermix, 2x 50 μl
pCR8_F1 प्राइमर,10 उम 4 μl
pCR8_R1 प्राइमर, 10 उम 4 μl
Nuclease मुक्त पानी 42 μl
* मास्टर मिश्रण है, तो एक अलग Taq प्रयोग किया जाता है समायोजित करें

टेबल कॉलोनी के लिए 100 μl (15 μl / प्रतिक्रिया) पीसीआर 1 के लिए 3. मास्टर मिश्रण।

कदम तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय (सेकंड)
1 95 120
2 95 30
3 55 30
4 72 105
5 30 चक्र के लिए चरण 2 पर जाएँ
6 72 300

तालिका 4 पीसीआर कॉलोनी पीसीआर 1 के लिए कार्यक्रम।

रकम अभिकर्मक एकाग्रता
12 μl पानी
1 μl वेक्टर 100 एनजी / μl
1 μl वेक्टर बी 100 एनजी / μl
1 μl गंतव्य वेक्टर pT3Ts-GT 50 एनजी / μl
1 μl अंतिम RVD (पीएलआर-RVD) 100 एनजी / μl
1 μl Esp3I
1 μl ligase
2 μl 10x Ligase बफर

सारणी 5. दूसरे विधानसभा प्रतिक्रियाओं के लिए प्रोटोकॉल।

कदम तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय (सेकंड)
1 95 120
2 95 30
3 55 30
4 72 180
5 30 चक्र के लिए चरण 2 पर जाएँ
6 72 300

6 तालिका पीसीआर कार्यक्रमकॉलोनी पीसीआर 2 के लिए।

गर्मी 290
खींचें 150
वेग 100
पहर 150
इन मानकों एक गर्त फिलामेंट का उपयोग कर एक ज्वलंत / ब्राउन micropipette डांड़ी मॉडल P-97 के लिए कर रहे

टेबल 7. नमूना सुई कार्यक्रम खींच रहा है।

अभिकर्मक रकम
Taq mastermix, 2x 12.5 μl
जीन विशिष्ट आगे प्राइमर, 10 माइक्रोन 1 μएल
जीन विशिष्ट रिवर्स प्राइमर, 10 माइक्रोन 1 μl
Nuclease मुक्त पानी 9.5 μl
डीएनए 1 μl
* मास्टर मिश्रण है, तो एक अलग Taq प्रयोग किया जाता है समायोजित करें

जीन विशिष्ट पीसीआर के लिए टेबल 8. नमूना प्रोटोकॉल।

कदम तापमान (डिग्री सेल्सियस) समय (सेकंड)
1 95 120
2 95 30
3 56 30
4 72 60
5 s पर जाएं35 चक्र के लिए TEP 2
6 72 300
* विशिष्ट प्राइमरों और पीसीआर उत्पाद आकार के लिए annealing तापमान और विस्तार के समय समायोजित

जीन विशिष्ट पीसीआर के लिए टेबल 9. नमूना पीसीआर कार्यक्रम।

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Discussion

उल्लेखनीय प्रगति लक्षण के विकास के आनुवंशिक आधार को समझने की दिशा में हाल के वर्षों में किया गया है। लक्षण के एक नंबर के विकास अंतर्निहित उम्मीदवार जीन की पहचान की गई है, यह सबसे दिलचस्प evolutionarily प्रजाति के आनुवंशिक शिक्षणीयता की कमी के कारण इन विवो में इन जीनों का परीक्षण करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। यहाँ हम ए में जीनोम संपादन के लिए एक विधि रिपोर्ट mexicanus, एक प्रजाति गुफा जानवरों के विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया। जेनेटिक मैपिंग के 1,21,23 अध्ययन और उम्मीदवार जीन दृष्टिकोण 19,40 ए की गुफा के रूप में लक्षण के विकास के लिए उम्मीदवार जीन की पहचान की है mexicanus। Cavefish जीनोम 41 की हाल ही में प्रकाशन गुफा लक्षण के विकास के लिए उम्मीदवार जीन की पहचान करने के लिए एक अतिरिक्त शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। इन उम्मीदवार जीन के कई के कार्य की जांच के जीन अभिव्यक्ति को कम करने के लिए तकनीक की आवश्यकता है। अध्ययन के लिए केवल वर्तमान विकल्पआईएनजी ए में कम जीन अभिव्यक्ति mexicanus morpholinos का उपयोग कर रहा है। हालांकि, morpholino जीन पछाड़ना कुछ ही दिनों के बाद निषेचन के लिए सीमित, क्षणिक है, और इस तरह के 17, hyperphagia 19 और कंपन आकर्षण व्यवहार 42 स्कूली शिक्षा की तरह वयस्क गुफा और सतह के बीच मछली व्यवहार मतभेद के रूप में वयस्क जानवरों में लक्षण के अध्ययन के लिए उपयोगी नहीं है। ऐसे में उन है कि TALENS का उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि जीन, के समारोह alleles के नुकसान की पीढ़ी, इन तत्वों के लिए उम्मीदवार जीन की भूमिका के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण होगा।

तरीके TALEN जोड़े 33 की आसान विधानसभा और इस विधि के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए विकसित किया गया है उपलब्ध 34 है। इस प्रोटोकॉल बेडेल एट अल। 7 से zebrafish उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था, एक अलग अंतिम गंतव्य सदिश का उपयोग, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-जीटी)। इस वेक्टर एक कोशीय zebrafish भ्रूण में इंजेक्शन के लिए TALEN mRNA की प्रतिलेखन के लिए अनुमति देता है।हम इकट्ठा और ए में इंजेक्शन के लिए TALENS टाइप करने के लिए इस संशोधित विधानसभा विधि का इस्तेमाल किया है, यहाँ विस्तार से समझाया, mexicanus। हमने पाया है कि जब एक कोशिकीय सतह ए में इंजेक्शन mexicanus भ्रूण, इस प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित के रूप में, हम ए बदलना सकता mexicanus जीन 29। इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं उम्मीदवार जीन पर भविष्य के अनुसंधान के लिए, दृश्यों cavefish जीनोम 41 में पाया जाता है और TALEN लक्ष्य साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

सफल इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण उच्च गुणवत्ता TALEN mRNA है। इस प्रकार, इंजेक्शन से पहले एक जेल पर शाही सेना की एक छोटी राशि चलाने के द्वारा शाही सेना गुणवत्ता की जाँच के लिए महत्वपूर्ण (चरण 3.6) है। ऐसी ठंड aliquots फ्रीज thaws (3.7 चरण) से बचने के लिए, और इंजेक्शन (चरण 4) के दौरान साफ ​​पानी और RNase मुक्त ट्यूब और युक्तियों का उपयोग करके बाँझ शर्तों को बनाए रखने के रूप में बनाए रखने आरएनए अखंडता के लिए अन्य सावधानियों, लिया जाना चाहिए। ऊपर उठाने के इंजेक्शन मछली के लिए एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम हैइंजेक्शन के बाद मृत भ्रूण को बाहर की सफाई, मृत भ्रूण को तेजी से पानी की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रकार, हम मृत भ्रूण को सुबह निम्नलिखित इंजेक्शन हटाने, और निम्न इंजेक्शन स्वस्थ रहते भ्रूण (चरण 4.3.6) को बनाए रखने के लिए अगले कुछ दिनों के लिए समय समय पर।

Astyanax mexicanus में TALEN म्युटाजेनेसिस अत्यधिक कुशल हो सकता है; हालांकि, दक्षता TALEN जोड़ी के आधार पर इंजेक्शन बदलता रहता है 29। वृद्धि mRNA सांद्रता बढ़ गई विषाक्तता और विकृति और इंजेक्शन भ्रूण की मौत हो सकती है। इस प्रकार, विषाक्तता दक्षता बनाम परीक्षण किया और mRNA का इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इंजेक्षन करने के लिए संतुलित किया जाना चाहिए। अत्यधिक कुशल TALEN जोड़े के लिए, phenotypes इंजेक्शन संस्थापक मछली में मूल्यांकन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, TALENS को निशाना oca2 के इंजेक्शन (चित्रा 3) सतह मछली 29 में सूरजमुखी मनुष्य पैच में हुई। अन्य लक्षण या जीनों के लिए, तथापि, संस्थापक मछली में phenotypes के आकलन को चुनौती देने के कारण हो सकता हैphenotype या TALEN जोड़ी इंजेक्शन की कम क्षमता का आसानी से करने के लिए। इस प्रकार, कई अनुप्रयोगों के लिए यह एक गैर-पच्चीकारी जानवर में एक उम्मीदवार जीन की भूमिका का विश्लेषण के लिए ब्याज की एक जीन में म्यूटेशन germline उत्पन्न करने के लिए वांछनीय होगा। ए में TALEN प्रेरित म्यूटेशन के प्राप्त germline संचरण mexicanus संभव 29 (चित्रा 4) है। इस प्रकार, इस तकनीक को अन्य उम्मीदवार जीन का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Astyanax mexicanus में आनुवंशिक जोड़तोड़ प्रदर्शन करने के लिए कुछ सीमाएँ इस समय मौजूद हैं। भूतल और अंधेरे में cavefish नस्ल, रात में देर हो गई। एक प्रयोगशाला है जहां यह प्रकाश अंधेरे चक्र उल्टा करने के लिए संभव नहीं है, शोधकर्ताओं ने में देर रात को इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए, आना चाहिए, क्योंकि यह स्पॉन के तुरंत बाद इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, यह अंधेरे में सतह मछली भ्रूण इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है, प्रकाश के रूप में स्पॉन को प्रभावित करेगा।

अन्य तकनीकों, खासकर मेंLAR CRISPR / कैस प्रणाली (43 में समीक्षा), जीनोम संपादन के लिए मौजूद हैं और संभावना ए पर लागू होगी mexicanus। दरअसल, गाइड आरएनए विधानसभा के लिए प्रोटोकॉल मौजूद है कि तेजी से और आसान कर रहे हैं और 44 प्रोटोकॉल यहां बताया CRISPR / कैस इंजेक्शन के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, जीनोम संपादन के लिए नए अनुप्रयोगों के तेजी से विकसित किए जा रहे हैं, और इनमें से कई ए के लिए उपयोगी साबित हो सकता है mexicanus शोधकर्ताओं। उदाहरण के लिए, zebrafish सटीक म्यूटेशन में एक भी फंसे oligo एक उत्परिवर्तन 7 युक्त साथ TALENS coinjecting द्वारा ब्याज की एक जीन में किया गया है। इस तकनीक को इस तरह के cavefish और सतह मछली 19 के बीच मनाया चयापचय में मतभेद में mc4r के कुछ गुफा alleles में एक missense उत्परिवर्तन की भूमिका के रूप में गुफा phenotypes, पैदा करने में गुफा alleles की भूमिका के मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो सकता है। TALENS भी मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से जीन की alleles कि फ्लोरोसेंट मार्करों मैं व्यक्त उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैअंतर्जात लोकी 45 के समान पैटर्न एन। इन विधियों ए में इस्तेमाल किया जा सकता mexicanus कोशिकाओं या उम्मीदवार जीनों की अभिव्यक्ति के सबसेट का मूल्यांकन करने के लिए। CRISPR / कैस प्रणाली ऊतक विशेष जीन पीटा 46 प्राप्त करने के लिए zebrafish में इस्तेमाल किया गया है। इन तकनीकों में, ए के लिए आवेदन किया mexicanus, ऐसे cavefish में आंख नुकसान के रूप में प्रक्रियाओं के आनुवंशिक आधार का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी हो सकता है। लेंस cavefish 47 में आंख घटाने की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और ऊतक विशेष CRISPR / कैस प्रणाली विशेष रूप से आंख के अन्य ऊतकों बनाम लेंस में आंख घटाने के लिए उम्मीदवार जीन की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन और अन्य जीनोम संपादन तकनीक ए में उपयोग किया जा सकता भविष्य के अध्ययनों में mexicanus गुफा लक्षण के विकास के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब।

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Acknowledgments

इस काम के जेनेटिक्स, विकास और सेल बायोलॉजी और आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के विभाग द्वारा और एनआईएच अनुदान EY024941 (WJ) .Dr द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जेफरी Essner पांडुलिपि पर टिप्पणियों प्रदान की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Thermocycler
Injection station
Gel apparatus
Needle puller
Nanodrop
Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated
Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 Addgene Kit #1000000024
Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) Fisher BP9724-500
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller Fisher BP1426-500
Teknova TET-15 in 50% EtOH Teknova (ordered through Fisher) 50-843-314
Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents Fisher BP2957-1
Super Ampicillin (1,000x solution) DNA Technologies 6060-1
ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) FERR0941
IPTG, Fisher BioReagents Fisher BP1620-1
Petri dishes Fisher 08-757-13
BsaI New England Biolabs (ordered through Fisher) 50-812-203 Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
BSA New England Biolabs provided with restriction enzymes
10x T4 ligase buffer Promega (ordered through Fisher) PR-C1263
GoTaq Green Master mix Promega (ordered through Fisher) PRM7123 Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly
Quick ligation kit New England Biolabs (ordered through Fisher) 50-811-728 We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions
One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli Invitrogen C4040-06 Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used
Esp 3I Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) FERER0451
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase Epicentre (Ordered through Fisher) NC9046399
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose BioExpress E-3119-125
Sac I Promega (Ordered through Fisher) PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit Ambion AM1348M
Rneasy MinElute Cleanup Kit Qiagen 74204
NorthernMax-Gly Sample Loading Dye  Ambion (ordered through Fisher) AM8551
Eliminase Decon (ordered through Fisher) 04-355-32
Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets Fisher 13-678-6B
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Microcaps Drummond Scientific Company 1-000-0010
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Eppendorf (ordered through Fisher) E5242956003
Sodium hydroxide Fisher S318-500
Tris base Fisher BP152-1

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 112, Cavefish TALENS talen जीनोम संपादन
में जीनोम एडिटिंग<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; का प्रयोग ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS)
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Kowalko, J. E., Ma, L., Jeffery, W.… More

Kowalko, J. E., Ma, L., Jeffery, W. R. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). J. Vis. Exp. (112), e54113, doi:10.3791/54113 (2016).

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