Summary
Gene-Targeting-Mutagenese ist nun möglich, in einem breiten Spektrum von Organismen unter Verwendung von Genom Bearbeitungstechniken. Hier zeigen wir ein Protokoll für eine gezielte Genmutagenese mit Talens (Talens) in Astyanax mexicanus, Fischarten , die Oberflächenfische und cavefish enthält.
Introduction
die genetische Basis der Trait Evolution zu verstehen, ist ein kritischer Forschungsziel von Evolutionsbiologen. Es wurden beträchtliche Fortschritte bei der Identifizierung von Loci zugrunde liegenden , die Entwicklung von Merkmalen und Ortung Kandidatengene innerhalb dieser Loci (zB 1-3) hergestellt. Allerdings Funktionsprüfung die Rolle dieser Gene so viele Organismen, die für die Untersuchung der Evolution von Merkmalen verwendet geblieben ist herausfordernd sind derzeit nicht genetisch manipulierbaren. Das Aufkommen der Genome Editing-Technologien hat sich stark genetische Manipulierbarkeit von einem breiten Spektrum von Organismen erhöht. Transkriptionsaktivator-like Effektor Nukleasen (TALENS) und gruppierten regelmäßig kurzen palindromischen Repeats (CRISPRs) voneinander beabstandete haben gezielte Mutationen in Gene in einer Anzahl von Organismen zu erzeugen , verwendet (beispielsweise 4-11). Diese Werkzeuge, angewandt auf eine evolutionär relevante System, haben das Potenzial, die Art und Weise Evolutionsbiologen die genetische Grundlage der Evolution studieren, um zu revolutionieren.
Astyanax mexicanus ist eine Art der Fische, die in zwei Formen existiert: A. ein Fluss lebende Oberflächenform (surface Fisch) und mehrere höhlenbewohnenden Formen (cavefish). mexicanus cavefish von Oberflächenfische Vorfahren ( zusammengefasst in 12) entwickelt. Populationen von cavefish haben eine Reihe von Merkmalen , einschließlich Verlust von Augen, verringern oder Verlust der Pigmentierung entwickelt hat , eine erhöhte Anzahl von Geschmacksknospen und Schädelneuromasten und Veränderungen im Verhalten wie Verlust des Ausbildungsverhalten, erhöhte Aggression, Veränderungen in der Fütterung Haltung und hyperphagia 13 -19. Cavefish und Oberflächenfische sind interfertile und genetische Kartierung Experimente durchgeführt wurden Loci und Kandidatengene für Höhlen Züge 1,20-26 zu identifizieren. Einige Kandidatengene wurden für eine funktionelle Rolle in einen Beitrag zur Höhle Züge in der Zellkultur 1,19, in Modellorganismen anderer Arten 21 oder durch die Überexpression 27 oder transiente Knockdown u getestetMorpholinos 28 in A. singen mexicanus. Jedoch hat jedes dieser Verfahren Grenzen. Die Fähigkeit mutanten Allele dieser Gene in A. zu erzeugen mexicanus ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis ihrer Funktion in der Entwicklung der cavefish. Somit A. mexicanus ist ein idealer Kandidat Organismus für die Anwendung der Genombearbeitungstechnologien.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Genom Bearbeitung in A. mexicanus mit Talens. Dieses Verfahren kann verwendet werden mosaic injizierten Gründer Fisch für Phänotypen zu bewerten und für Linien von Fischen mit stabilen Mutationen in Genen von Interesse 29 zu isolieren.
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Protocol
Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Iowa State University und der University of Maryland genehmigt.
1. TALEN Entwurf
- Eingabe gewünschte Zielsequenz zu einem TALEN Design Website. (Zum Beispiel: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Eingang gewählt Spacer / Wiederholung Array Längen.
- Kopieren Sie die genomische Sequenz in das Feld mit der Bezeichnung "Sequence".
- Im Rahmen der "Bereitstellung von benutzerdefinierten Spacer / RVD Lengths" wählen Sie die Registerkarte Distanzlänge und Feldlänge.
Hinweis: Distanzlängen von 15 Basenpaaren und wiederholen Array Längen von 15-17 Arbeit gut und machen Montage weniger komplex.
- Wählen Sie ein TALEN Paar. TALEN Paare entworfen um einen einzigartigen Ort Restriktionsenzym ermöglichen für die Genotypisierung durch Restriktionsenzym-Verdauungein PCR-Produkt.
- Design - Primer der genomischen Region um die TALEN Zielstelle mit einer Website wie Primer3 30-32 zu verstärken. Wenn sie mit einem Restriktionsenzym, Genotypisierung, design Primer eine Region amplifizieren, die nur einmal die Restriktionsenzymstelle enthält. Es wird empfohlen , dass diese Region amplifiziert wird und vor dem Aufbau TALEN sequenziert keine Polymorphismen in der A. zu identifizieren mexicanus Labor Bevölkerung für die Mikroinjektion verwendet werden.
2. TALEN Assembly (Geändert vom TALEN Kit Protocol) 33,34
Weitere Details und Fehlerbehebung finden Sie das Protokoll 34.
- Vorbereitung und notwendigen Plasmide aus den TALEN kit-Sequenz nach den Anweisungen des Herstellers.
- Eingerichtet, um die # 1-Reaktionen für Reaktionen A und B. repeat-variable Include diresidues (RVDS) 1-10 und der Zielvektor pFUS_A in Reaktion A. einschließen RVDS 11- (N-1) -ten unde Zielvektor pFUS_B (N-1) in Reaktion B, wobei N die Gesamtzahl der in der RVDS TALEN ist.
- In jeder Reaktion: 1 & mgr; l jedes Plasmids jedes RVD (100 ng / & mgr; l) enthält, den Zielvektor (100 ng / ul), 1 ul Bsa I Restriktionsenzym, 1 & mgr; l Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul Ligase, 2 ul 10fach Ligasepuffer und x & mgr; l Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 & mgr; l. Zum Beispiel finden Sie in Tabelle 1.
Hinweis: Halbreaktionen können auch verwendet werden. - Reaktionen in einen Thermocycler und der Zyklus ausgeführt: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
- In jeder Reaktion: 1 & mgr; l jedes Plasmids jedes RVD (100 ng / & mgr; l) enthält, den Zielvektor (100 ng / ul), 1 ul Bsa I Restriktionsenzym, 1 & mgr; l Rinderserumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul Ligase, 2 ul 10fach Ligasepuffer und x & mgr; l Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 & mgr; l. Zum Beispiel finden Sie in Tabelle 1.
- Inkubieren Sie die Reaktionen mit Nuklease. Zu jeder Reaktion hinzufügen 1 ul 25 mM ATP und 1 ul Nuklease. Inkubieren Reaktionen bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Verwandeln Reaktionen.
- Trans 2,5 ul jeder Reaktion in 25 ul chemisch kompetente Zellen.
Hinweis: Selbst gemachte zuständigen cells verwendet werden. Allerdings Zellen mit geringer Kompetenz in Mangel an Kolonien führen.- Mischungs 2,5 ul der Reaktion mit 25 & mgr; l chemisch kompetente Zellen. Inkubieren auf Eis für fünf Minuten. Inkubieren der Zellen für 30 sec bei 42 ° C.
- Die Röhrchen auf Eis für 2 min. In 125 ul SOB-Medium mit Katabolitenrepression (SOC). Schütteln der Röhrchen bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Platte 100 & mgr; l der transformierten Zellen auf LB-Platten mit Spectinomycin (50 ug / ml), X-gal und Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Wachsen O / N bei 37 ° C.
- Trans 2,5 ul jeder Reaktion in 25 ul chemisch kompetente Zellen.
- Wählen Sie 2-3 weiße Kolonien für jede Reaktion und prüfen Sie durch Kolonie - PCR unter Verwendung von Primern pCR8_F1 und pCR8_R1 (Tabelle 2).
- Machen Sie einen Master-Mix der Reagenzien. Zum Beispiel finden Sie in Tabelle 3.
- Wählen Sie eine Kolonie und schmiert sie in den Boden eines PCR-Röhrchen, und setzen Sie dann die Reste der Kolonie in 2 ml LB mit Spectinomycin(50 ug / ml). Legen Sie 15 ul des Master-Mix in das Röhrchen mit der Kolonie.
- Führen Sie das folgende PCR - Programm (Tabelle 4)
- Überprüfen Sie die PCR (das gesamte Volumen laufen) auf einem 1,5% Agarose-Gel durch Elektrophorese. Die richtigen Klone eine Bande bei der erwarteten Größe haben sowie einen Abstrich und eine Leiter von Bands. Ein Beispiel für den entsprechenden Abstrich, siehe 34,33.
- Wachsen 2 ml Kulturen der richtigen Klone in LB-Medien O / N bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator.
- Miniprep der Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Sequenz zu überprüfen TALEN-Sequenz mit pCR8_F1 und pCR8_R1. Folgen zuvor beschriebenen Verfahren 35.
- Unter Verwendung der richtigen Klone durch Sequenzierung verifiziert, stellen Sie die Reaktion # 2 (TALEN Kit) auf, der den RVDS aus den A- und B-Vektoren und die endgültige RVD in den Zielvektor platzieren wird.
- Vorbereitung Mischung für die Reaktion 2 (Tabelle 5).
Hinweis: Half Reaktionen verwendet werden. - Legen Sie die Reaktionen in einem Thermocycler und führen Sie das folgende Programm: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
- Vorbereitung Mischung für die Reaktion 2 (Tabelle 5).
- Verwandeln Reaktionen.
- Trans 2,5 ul jeder Reaktion in 25 ul chemisch kompetente Zellen.
- Mischungs 2,5 ul der Reaktion mit 25 & mgr; l chemisch kompetente Zellen. Inkubieren auf Eis für 5 min. Hitzeschock der Zellen für 30 Sekunden bei 42 ° C.
- Die Röhrchen auf Eis. In 125 ul SOC. Die Röhrchen in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Platte 100 & mgr; l der transformierten Zellen auf LB-Platten mit Ampicillin (100 ug / ml), X-gal und IPTG. Wachsen O / N bei 37 ° C
- Trans 2,5 ul jeder Reaktion in 25 ul chemisch kompetente Zellen.
- Wählen Sie 1-3 weiße Kolonien für jede Reaktion und prüfen Sie durch Kolonie - PCR unter Verwendung von Primern TAL_F1 und TAL_R2 (Tabelle 2).
- Machen Sie eine Lösung der Polymerase Mastermix, Wasser und Primer, wiein Tabelle 3 beschrieben. eine Kolonie Auswahl und in den Boden eines PCR - Röhrchen verschmieren, und setzen Sie dann die Reste der Kolonie in 2 ml LB mit Ampicillin (100 ug / ml). Platzieren 15 ul der Lösung in das Röhrchen mit der Kolonie.
- Führen Sie das PCR - Programm (Tabelle 6).
- Überprüfen Sie die PCR auf einem 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese. Die richtigen Klone ein Verschmieren und eine Leiter von Bands haben. Ein Beispiel für den entsprechenden Abstrich, siehe 34,33.
- Wachsen 2 ml Kulturen der richtigen Klone in LB-Medien O / N bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator.
- Miniprep der Plasmide gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Sequenz zu überprüfen TALEN - Sequenz mit TAL_F1 und TAL_R2 folgenden zuvor 35 beschriebenen Verfahren.
3. mRNA Transkription von Talens
- Digest 4 ug von sequenzüberprüft Vorlage mit 2 ul Sac I für 2 Stunden bei 37 ° C. Lauf 2 ul der Sac I-verdaute Plasmid auf einem 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese. Plasmide, die richtig verdaut werden, wird eine einzelne Bande angezeigt werden soll.
- Reinige den verbleibenden Sac I-verdaute Plasmid nach dem PCR Purification Kit - Protokoll. Wasche zweimal mit der Waschlösung vor der Elution. Eluieren in 30 ul Nuklease-freies Wasser.
- Folgen Sie dem Standardprotokoll für die T3-mRNA-Produktion.
- Richten Sie die Hälfte Reaktionen 0,5 ug linearisierte Vorlage (oben hergestellt). Inkubieren bei 37 ° C für 2 Stunden.
- In 0,5 ul DNase (im Bausatz enthalten) und Inkubation bei 37 ° C für 15 min.
- Reinige die mRNA, nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 30 ul Nuklease-freies Wasser.
- Führen Sie einen 1,5% Agarose-Gel durch Elektrophorese der mRNA zu überprüfen.
- Reinigen Sie die Gel-Apparatur mit einem Produkt RNase Kontamination zu beseitigen und eine 1,2% Gel herzustellen.
- Mix 1 & mgr; l mRNA + 4 &# 181; l Nuklease-freies Wasser + 5 ul Glyoxyl Laden Farbstoff. Inkubieren Proben bei 50 ° C für 30 min. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz und auf Eis, bevor das Gel läuft.
- Überprüfen Sie die Konzentration ein Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäurekonzentrationen und speichern Sie die RNA in Aliquots bei -80 ° C verwendet wird. Wählen Sie eine aliquote Größe, so dass RNA wird nicht mehr eingefroren / aufgetaut als einmal.
Hinweis: Die Konzentrationen von 500-1000 ng / nl sind in der Regel erhalten. RNA mit einer geringeren Konzentration kann so lange verwendet werden, wie RNA-Integrität aufrechterhalten wird (wie durch eine Bande beurteilt eher als ein Abstrich auf dem Gel).
4. Inject Astyanax mexicanus Embry mit TALEN mRNA
- Bereiten Sie Werkzeuge für die Injektion.
- Gießen Injektion Platten durch Gießen 1,2% Agarose in Fischwasser (Wasseranlage mit Natriumbicarbonat und Meersalz auf pH 7,4 und die Leitfähigkeit 700 uS) in eine Petrischale. Legen Sie eine Form (Kunststoffteil mit Vorsprüngen Vertiefungen für Fische zu machenEier) im Inneren der Schale. Entfernen Sie die Form, wenn die Agarose bei 4 ° C gehärtet und zu speichern ist. Einzelheiten zu der Form siehe 36.
- Ziehen Nadeln für die Injektion einer Nadel Abzieher nach den Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Passende Nadellänge für Injektionszwecke wichtig ist. Nadeln, die zu lang sind, werden für Injektionen zu flexibel sein. Das Protokoll zum Ziehen Nadeln werden mit der Ausstattung variieren verwendeten Nadeln zu ziehen. Ein Beispiel einer geeigneten Nadel wird in 1 gezeigt. Für unsere Ausrüstung, wir ziehen Nadeln , die 5-6 cm lang sind, und einen Außendurchmesser an der Spitze von etwa 0,011 mm , wenn sie gebrochen. Nadeln sollten jedoch kalibriert werden (Schritt 4.3.4) Öffnungsweite zu bestimmen. Ein Beispielprogramm Nadeln zum Ziehen in Tabelle 7 zu finden. - Bereiten Glaspipetten für Embryotransfer durch die Pipette zu brechen, so dass die Öffnung groß genug ist, um ein Ei durch. Flamme das gebrochene Ende bises ist nicht mehr scharf.
Hinweis: Es ist wichtig , Glaspipetten und Glasschalen zu verwenden , wenn sie mit A. Arbeits mexicanus Eier und Embryonen , wie sie sind klebrig und wird Kunststoff haften.
- Sammeln Sie 1-Zell-Stadium Eier.
- Rasse A. mexicanus nach Standardprotokollen 37.
Hinweis: Wenn zum Beispiel Fisch auf einem 14 Licht gehalten werden: 10 Dunkel-Zyklus und mit Zeitgerber Zeit (ZT) mit ZT0 als Lichter an und ZT14 als Licht aus, unsere Oberflächen Fischlaich zwischen ZT15 und ZT19. Genaue Laichzeit ist für jeden einzelnen Labor bestimmt werden. - Induce Laich von Fisch für 3-4 Tage vor der Paarung überfüttert und Fische in Süßwasser platzieren. Erhöhen Sie die Temperatur 2 ° F. Hinweis: Unsere anfängliche Wassertemperatur liegt bei etwa 74 ° C.
- Sammeln Oberfläche Fischeier im Dunkeln, alle 15 min Kontrolle Eier an der 1-Zellstadium zu erhalten. Hunderte von Eiern aus einem einzigen Paar von Oberflächen Fisch erhalten werden.
- Sammelnin Glasschalen Eier kleben an Kunststoffoberflächen zu verhindern und zu sortieren Embryonen in der 1-Zellstadium vor der Injektion zu isolieren, indem Eier unter dem Mikroskop und sammeln Eier, die eine einzelne Zelle beobachten. Halten Sie Eier in frischem Systemwasser (Tank Wasser, in dem erwachsene Fische untergebracht sind, die für pH-Wert und Leitfähigkeit behandelt wurde).
- Rasse A. mexicanus nach Standardprotokollen 37.
- Injizieren TALEN mRNA.
- Injizieren Sie unterschiedliche Mengen an Gesamt-mRNA (gleiche Mengen von jedem TALEN im Paar) die optimale Konzentration zur Injektion, um zu bestimmen, wie Toxizität und Wirksamkeit von TALEN Paar variieren. Beginnen Sie mit Konzentrationen von Gesamt-mRNA Injektion, die 400-800 pg sind. Verdünnen und kombinieren mRNA, um die gewünschten Konzentrationen zur Injektion von 1,5 nl.
- Laden verdünnte mRNA in die Rückseite der Nadel und befestigen Sie die Nadel in einem Mikro Injektor.
- Brechen Sie die Nadel mit einer Pinzette.
- Kalibrieren Sie die Nadel. Beispielsweise 10 mal auswerfen und die sich ergebende Abfall in einer Mikrokapillare sammeln. Für 10 x 100 Einweg-1.081; l, 32 mm Mikrokapillare, der Tropfen sollte die Mikrokapillare bis 0,5 mm für 1,5 nl / 1 Injektion zu füllen. Stellen Sie die Einspritzzeit und Druck nach Bedarf.
- Führen Sie die Nadel in die einzelne Zelle und injizieren, um die mRNA. Injizieren Sie die mRNA direkt in die Zelle, nicht in den Dotter.
- Sammeln Sie injizierten Embryonen in Glasschalen. Halten Embryonen bei 23-25 ° C. Entfernen Sie tote Embryonen (Embryonen, die trüb und unregelmäßig geformte) regelmäßig für die ersten paar Tage nach der Injektion. Eine Rekordzahl von toten und deformierten Embryonen aus Kontrolle (ohne Injektion) und injiziert Platten.
Hinweis: Erhöhte mRNA-Konzentration zu erhöhter Toxizität und Deformierung / Tod von Embryonen führen kann. Somit muss die Toxizität gegenüber Effizienz ausgeglichen werden, um die beste Konzentration der mRNA zu bestimmen, zu injizieren.
5. Phänotyps Gründer Fisch und TALEN Effizienz auswerten
- Sacrifice Embryonen nach dem institutionellen Tier Protokoll.
Hinweis: Wir einschläferndurch schnelle Embryonen auf Eis schmetternd. - Sammeln Embryonen in 0,8 ul PCR-Streifen Röhrchen eine Transferpipette.
Hinweis: Die Genotypisierung kann auf einzelne Embryonen oder Pools von Embryonen durchgeführt werden. - Extrakt DNA.
- Ort Embryonen in 100 ul 50 mM Natriumhydroxid (NaOH) und 30 min bei 95 ° C inkubieren, dann kühlen auf 4 ° C.
- Hinzufügen 1/10 Volumen (10 ul) von 1 M Tris-HCl pH 8.
- Durchführen einer PCR auf die Region unter Verwendung der in Schritt entwickelt Primern 1.3 (siehe Tabellen 8 und 9 für die Probenprotokolle). Für einzelne Embryonen 1 ul DNA für die PCR-Reaktion ausreichend.
- Digest das resultierende PCR-Produkt mit dem geeigneten Restriktionsenzym und führen ein 1,5% Agarosegel durch Elektrophorese.
- Beispielsweise für die Genotypisierung die oculocutaneous Albinismus 2 (OCA2) locus in injizierten Embryonen verdauen das PCR Produkt das Restriktionsenzym Bsr unter Verwendung von I 0 Zugabe0,5 ul Bsr I direkt auf 12,5 & mgr; l der PCR - Reaktion fertiggestellt, für 2 Stunden bei 65 ° C inkubiert. Führen Sie das unverdaute und das verdaute Produkt auf einem Gel. Restriktionsenzym beständigen Bands (dh Bänder, die nicht verdauen) zeigen , dass TALEN-induzierten Mutationen vorhanden sind (Abbildung 2).
- (Optional) Berechnen Rate Prozentsatz Mutation durch den Prozentsatz der ungeschnittenen Produkt Bestimmung von Bildern von Gelen in Fidschi 38 Analyse der Gel - Analyse - Tool mit dem Intensitätswert jedes Bandes zu berechnen , wie zuvor 29 beschrieben.
- Bestimmen Sie die Sequenz von mutierten Allelen durch TA das Gel gereinigt Restriktionsenzym resistente Mutante Band Klonierung und Sequenzierung Klone.
- Gel reinigt das Restriktionsenzym resistente Mutante Bande nach den Anweisungen des Herstellers. TA klonen die Band nach den Anweisungen des Herstellers. Pick-Kolonien und wachsen in 1,5 ml LB O / N bei 37 ° C in einem geschütteltenInkubator.
- Miniprep Kulturen den Anweisungen des Herstellers folgen. Senden Sie die DNA für die Sequenzierung.
- Mit einem Programm wie Menschenaffe, richten Sie die mutierten Sequenzen zu der Wildtyp-Sequenz.
- Kopieren Sie beide Sequenzen in ApE Dateien. Wählen Sie die "Align zwei Sequenzen" Werkzeug aus dem Menü "Extras".
- Geben Sie die beiden DNA-Sequenzen, die die Drop-Down-Menüs.
Anmerkung: Die umgekehrte Komplement der klonierten Sequenz müssen die PCR ging in den Klonierungsvektor abhängig von der Richtung verwendet werden. Wenn die Sequenzen nicht fluchten, wiederholen Sie die Schritte, die "Rev-Com" in der Gruppe "Align DNA" Kästchens.
- Gründer Fisch für Phänotypen bei geeigneten Zeitpunkt und unter Verwendung geeigneter Methoden für den erwarteten Phänotyp 29 (Beispiel : Abbildung 3) auswerten. Verfahren zur Phänotypisierung wird auf dem erwarteten Phänotyp für das Gen durch den Forscher mit Hilfe der Protoc gezielt basierenol.
6. Bildschirm Germline Transmission
Anmerkung: A. mexicanus Geschlechtsreife bei 4-8 Monaten erreichen.
- Überqueren Sie sexuell reifen Gründer Fisch zu Wildtyp-Fisch.
- Screen - Embryonen oder ausgewachsene Fische unter Verwendung von Verfahren in den Schritten 5,1-5,7 (Abbildung 4). Für erwachsene Fisch, kann ein Stück des Schwanzes folgenden anesthetization abgeschnitten.
- Anästhesieren Fisch von Fisch in einer Lösung von Tricaine (3-Aminobenzoesäure-ethylester) Eintauchen Stress während fin Abschneiden zu reduzieren. Nach Finne Clipping, erlauben Fische in Süßwasser zu erholen. Fisch erholen sich schnell; beobachten, bis sie gewonnen haben (schwimmen normalerweise).
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Representative Results
TALEN Paar Injektionen Ergebnis der RVDS an spezifische DNA - Nukleotide in der Bindung und damit die Dimerisierung von FokI - Domänen, in Doppelstrangbrüche 39 führt , die durch nicht-homologe Ende repariert werden kann Beitritt (NHEJ). NHEJ führt häufig Fehler, die in Insertionen oder Deletionen (indels) zur Folge haben. Indels kann durch Amplifizieren der Region um die Website TALEN Ziel identifiziert werden, und das resultierende Amplikon mit einem Restriktionsenzym zu verdauen, die innerhalb des TALEN Spacerregion schneidet. Allelen ohne indel verdauen , während Allele indels, die die Restriktionsenzym - Zielsequenz wird sich nicht ändern zu verdauen, wodurch ein Restriktionsenzym resistent Band (Abbildung 2) enthält.
TALEN Injektionen können in biallelic Gen - Mutationen in A. führen wahrscheinlich mexicanus 29. Somit können einige Phänotypen in Gründer Fisch beurteilt werden. Für Beispiel werteten wir die Pigmentierung in Oberflächenfische injiziert mit Talens Targeting OCA2, das Gen verantwortlich sein für Albinismus in mehreren Albino Populationen von cavefish 1,28 vermutet. Wir fanden Albino - Patches in OCA2 TALEN injizierten Fische nicht in uninjizierten Fisch 29 (Abbildung 3).
Bei vielen Experimenten ist es wünschenswert Mutantenlinien von Fischen zur Bewertung Phänotypen haben. Gründer Fisch mit übertragen Mutantenallelen kann durch Genotypisierung Nachkommen aus Kreuzungen des Gründers Fisch zu Wildtyp - Fisch (Abbildung 4) identifiziert werden.
Abbildung 1. Nadel für mRNA injiziert wird . Fotografie einer Mikropipette vor gebrochen zum Injizieren TALEN mRNA in einzelliger Embryonen verwendet._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. TALEN Effizienz für OCA2. 306 bp PCR - Produkte von Exon 9 des OCA2 in Astyanax mexicanus wurden auf Verlust der Restriktionsenzymstelle untersucht , wenn verschiedene Mengen an mRNA TALEN 29 injiziert. Das Amplikon aus einem Kontrollembryo wurde verdaut, während ein Teil des Amplikons zu Restriktionsverdau in den Pools von 10 TALEN Embryonen injiziert resistent war. Restriktionsenzym resistent Banden von Embryonen mit TALEN mRNA injiziert verdauen gezielte OCA2 wurden indels 29 gezeigt enthalten. Beachten Sie, dass Konzentrationen von mRNA injiziert führt zu einer erhöhten TALEN Effizienz (mehr unverdaute DNA) zu erhöhen. Lanes mit "-" unverdaut sind, Spuren mit "+" sind Digested mit dem Restriktionsenzym. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Phänotypisierung Gründer Fisch für Veränderungen in der Pigmentierung. (A) Kontrolle injizierten Oberfläche A. mexicanus. (B) Patch fehlt Melanophoren in einem Fisch Gründer Oberfläche mit 400 pg TALEN mRNA injiziert Targeting OCA2 (Pfeil). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Germline Übertragung von TALEN induzierten mutations. 306 bp PCR - Produkte von Exon 9 des OCA2 in A. mexicanus wurden für den Verlust der Restriktionsenzymstelle in Pools von 10 F 1 Fisch aus einem injizierten Gründer Fisch untersucht. Das Amplikon aus einem Kontrollembryo wurde verdaut , während ein Teil des Amplikons zu Restriktionsverdau in den Pools von 10 F 1 Embryos resistent war. Restriktionsenzymverdau resistent Bands aus OCA2 F 1 s gezeigt wurden indels 29 enthalten. Lanes mit "-" sind unverdaut, Spuren mit "+" werden mit dem Restriktionsenzym verdaut. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Reaktion A | Reactiauf B | |||
| Menge | Reagens | Menge | Reagens | |
| 4 ul | Wasser | 10 ul | Wasser | |
| 1 ul | pFUS_A | 1 ul | pFUS_B4 | |
| 1 ul | BsaI | 1 ul | BsaI | |
| 1 ul | BSA | 1 ul | BSA | |
| 1 ul | Ligase | 1 ul | Ligase | |
| 2 ul | 10fach Ligasepuffer | 1 ul | 10fach Ligasepuffer | |
| 1 ul | pNH1 | 1 ul | pNG1 | |
| 1 ul | pNH2 | 1 ul | PhD2 | |
| 1 ul | pNG3 | 1 ul | pNH3 | |
| 1 ul | PHD4 | 1 ul | pNI4 | |
| 1 ul | PHD5 | |||
| 1 ul | PHD6 | |||
| 1 ul | pNG7 | |||
| 1 ul | PHD8 | |||
| 1 ul | pNG9 | |||
| 1 ul | pHD10 | |||
Tabelle 1 Beispiel Reaktionsanordnung A und B für eineTALEN enthält RVDS NH-NH-NG HD-HD-HD-NG HD-NG HD-NG HD-NH-NI-NG.
| Primer Name | Sequenz (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Tabelle 2. PCR - Primer für die Kolonie - PCR, ab 34.
| Reagens | Menge |
| Taq Mastermix, 2x | 50 ul |
| pCR8_F1 Primer,10 & mgr; M | 4 ul |
| pCR8_R1 Primer, 10 & mgr; M | 4 ul |
| Nuklease-freies Wasser | 42 & mgr; l |
| * Stellen Sie Master-Mix, wenn eine andere Taq verwendet wird | |
Tabelle 3. Master - Mix für 100 & mgr; l (15 & mgr; l / Reaktion) für Kolonie - PCR 1.
| Schritt | Temperatur (° C) | Zeit (s) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Go 2 für 30 Zyklen zu Schritt | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabelle 4. PCR - Programm für Kolonie - PCR 1.
| Menge | Reagens | Konzentration |
| 12 ul | Wasser | |
| 1 ul | Vektor A | 100 ng / ul |
| 1 ul | Vektor-B | 100 ng / ul |
| 1 ul | Zielvektor pT3Ts-gt | 50 ng / ul |
| 1 ul | final RVD (PLR-RVD) | 100 ng / ul |
| 1 ul | Esp3I- | |
| 1 ul | Ligase | |
| 2 ul | 10fach Ligasepuffer | |
Tabelle 5. Protokoll für die zweite Aufbaureaktionen.
| Schritt | Temperatur (° C) | Zeit (s) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Go 2 für 30 Zyklen zu Schritt | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabelle 6. PCR - Programmfür Kolonie-PCR 2.
| Hitze | 290 |
| ziehen | 150 |
| Geschwindigkeit | 100 |
| Zeit | 150 |
| Diese Parameter sind für einen Flaming / Brown Mikropipette Puller Modell P-97 einen Trog Filament mit | |
Tabelle 7. Beispiel Nadel ziehen Programm.
| Reagens | Menge |
| Taq Mastermix, 2x | 12,5 ul |
| Gen-spezifischen Vorwärtsprimer, 10 & mgr; M | 1 μl |
| Gen-spezifischen Rückwärtsprimer, 10 & mgr; M | 1 ul |
| Nuklease-freies Wasser | 9,5 ul |
| DNA | 1 ul |
| * Stellen Sie Master-Mix, wenn eine andere Taq verwendet wird | |
Tabelle 8. Beispielprotokoll für die Gen - spezifischen PCR.
| Schritt | Temperatur (° C) | Zeit (s) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Gehe zu STEP 2 für 35 Zyklen | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Glühtemperatur und Verlängerungszeit für spezifische Primer und PCR-Produktgröße anpassen | ||
Tabelle 9. Beispiel PCR - Programm für die Gen - spezifischen PCR.
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Discussion
Große Fortschritte wurden in den letzten Jahren zum Verständnis der genetischen Grundlage der Entwicklung der Merkmale vorgenommen. Während Kandidatengene die Entwicklung einer Reihe von Merkmalen zugrundeliegenden identifiziert wurden, ist es schwierig geblieben , diese Gene in vivo zu testen , aufgrund des Fehlens von genetischen Lenkbarkeit der meisten evolutionarily interessante Arten. Hier berichten wir über ein Verfahren zur Genom Bearbeitung in A. mexicanus, eine Spezies verwendet , um die Evolution von Höhlentieren zu studieren. Die genetische Kartierung Studien 1,21,23 und Kandidaten - Gen nähert sich 19,40 eine Reihe von Kandidatengenen für die Entwicklung von Merkmalen in der Höhle Form von A. identifiziert mexicanus. Die jüngste Veröffentlichung des cavefish Genoms 41 stellt ein zusätzliches leistungsfähiges Werkzeug Kandidatengene für die Entwicklung der Höhle Merkmale zur Identifizierung. Testen der Funktion vieler dieser Kandidatengene erfordert Techniken Genexpression zu reduzieren. Die einzige aktuelle Option für Studieing reduzierte Genexpression in A. mexicanus ist durch die Verwendung von Morpholino. Allerdings Morpholino Knock-Down ist vergänglich, beschränkt auf wenige Tage nach der Befruchtung, und ist nicht nützlich für die Züge bei erwachsenen Tieren, wie zum Beispiel Verhaltensunterschiede zwischen erwachsenen Höhle und Oberflächenfische wie Schul 17, hyperphagia 19 und Schwingungsanziehungsverhalten 42 zu studieren. Erzeugung von Funktionsverlust-Allele von Genen, wie beispielsweise diejenigen, die TALENS gemacht werden können verwenden, wird für die Prüfung der Rolle der Kandidatengene für diese Eigenschaften kritisch sein.
Methoden haben für die einfache Montage von TALEN Paare 33 und dem detaillierten Protokoll für diese Methode entwickelt worden ist 34 zur Verfügung. Dieses Protokoll wurde für Zebrabärbling optimiert von Bedell et al. 7, ein anderes Endziel Vektor verwenden, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-gt). Dieser Vektor ermöglicht die Transkription von TALEN mRNA für die Injektion in einzelliger Genaktivität.Wir haben dieses modifizierte Montageverfahren verwendet wird , hier im Detail erläutert, Talens für die Injektion in A. zu montieren und zu transkribieren mexicanus. Wir fanden heraus , dass , wenn sie in Einzeller Oberfläche A. injiziert mexicanus Embryonen, wie in diesem Protokoll beschrieben, könnten wir A. mutieren mexicanus Gene 29. Für die zukünftige Forschung auf Kandidatengene nicht in diesem Protokoll beschriebenen Sequenzen können in dem cavefish Genom 41 und verwendet gefunden werden , um TALEN Zielstellen zu identifizieren.
Entscheidend für erfolgreiche Injektionen ist eine hohe Qualität TALEN mRNA. Somit ist es durch für RNA Qualitätsprüfung auf einem Gel mit einer geringen Menge an RNA ausgeführt wird vor der Injektion ist wichtig (Schritt 3.6). Weitere Vorsichtsmaßnahmen für die Aufrechterhaltung der Integrität der RNA, wie Aliquots Einfrieren Einfrieren taut zu vermeiden (Schritt 3.7) und sterile Bedingungen aufrechterhalten werden durch Verwendung von sauberem Wasser und RNAse-freie Röhrchen und Tipps während Injektionen (Schritt 4), getroffen werden sollten. Ein weiterer wichtiger Schritt zur Erhöhung der injizierten FischReinigung aus toten Embryonen nach der Injektion, als tote Embryonen schnell die Wasserqualität beeinflussen können. So entfernen wir den Morgen tot Embryonen Injektionen folgen, und in regelmäßigen Abständen für die nächsten paar Tage nach Injektionen gesund lebenden Embryos (Schritt 4.3.6) zu halten.
TALEN Mutagenese in Astyanax mexicanus kann sehr effizient sein; jedoch Effizienz auf der TALEN Paar variiert in Abhängigkeit injiziert 29. Erhöhte mRNA-Konzentrationen können zu erhöhter Toxizität und Deformierung und den Tod von injizierten Embryonen führen. Somit Toxizität gegenüber Effizienz muss die optimale Konzentration von mRNA getestet und ausgeglichen werden, um zu bestimmen, zu injizieren. Für hocheffiziente TALEN Paare können Phänotypen in injiziert Gründer Fisch beurteilt werden. Zum Beispiel führte die Injektion von TALENS Targeting OCA2 in albino patches in Oberflächenfische 29 (Abbildung 3). Für andere Züge oder Gene können jedoch Beurteilung von Phänotypen in Gründer Fisch aufgrund anspruchssubtil des Phänotyps oder geringe Effizienz des injizierten TALEN Paar. So sind viele Anwendungen wird es wünschenswert sein, Keimbahnmutationen in einem Gen von Interesse für die Analyse der Rolle eines Kandidaten-Gens in einem nicht-mosaic Tier zu erzeugen. Erhalten Keimbahn - Übertragung von TALEN-induzierte Mutationen in A. mexicanus ist möglich , 29 (Figur 4). Somit kann diese Technik angewandt werden, um andere Kandidatengene zu bewerten.
Einige Einschränkungen genetische Manipulationen in Astyanax mexicanus zur Durchführung existieren zu diesem Zeitpunkt. Oberflächen- und cavefish Rasse in der Dunkelheit, spät in der Nacht. In einem Labor, in dem es nicht möglich ist, die Licht-Dunkel-Zyklus umkehren, Forscher kommen in spät in der Nacht müssen Injektionen durchzuführen, wie es wichtig ist, sofort zu injizieren nach dem Laichen. Darüber hinaus ist es wichtig, Oberfläche Fischembryonen im Dunkeln zu sammeln, wie Licht Laich beeinflussen.
Andere Techniken, insbesonlar die CRISPR / Cas System (in 43 überprüft), gibt es für Genom - Bearbeitung und wird auf A. wahrscheinlich anwendbar sein mexicanus. In der Tat, Protokolle für die Führung RNA Baugruppe bestehen, die eine schnelle und einfache 44 und das Protokoll berichtet hier für CRISPR / Cas Injektion modifiziert werden. Zusätzlich werden neue Anwendungen für die Genom Bearbeitung schnell entwickelt, und viele davon können für A. nützlich erweisen mexicanus Forscher. Beispielsweise in Zebrabärbling präzise Mutationen in einem Gen von Interesse durch coinjecting TALENS mit einem einzelsträngigen Oligo eine Mutation enthalten , 7 vorgenommen. Diese Technik könnte für die Bewertung der Rolle der Höhle Allele in Erzeugen Höhle Phänotypen, wie beispielsweise die Rolle einer Missense - Mutation in bestimmten Höhle Allele MC4R in Unterschiede im Metabolismus beobachtet zwischen cavefish und Oberflächenfische 19 nützlich sein. Talens haben auch Allele von Genen verwendet worden, durch homologe Rekombination zu erzeugen, die Fluoreszenzmarker exprimieren in - Muster ähnlich dem endogenen Loci 45. Diese Verfahren können in A. verwendet werden mexicanus Untergruppen von Zellen oder Expression von Kandidatengenen zu bewerten. Der CRISPR / Cas System in Zebrabärbling verwendet 46 gewebespezifische Gen - Knockout zu erhalten. Diese Techniken, angewandt auf A. mexicanus, könnte nützlich sein , um die genetische Basis von Prozessen wie Augenverlust in cavefish zu bewerten. Die Linse spielt eine entscheidende Rolle im Prozess der Augenverlust in cavefish 47 und der gewebespezifische CRISPR / CAS - System verwendet werden könnte , um die Rolle von Kandidatengenen für Augenverlust speziell in der Linse im Vergleich zu anderen Geweben des Auges zu beurteilen. Diese und andere Genom-Bearbeitungstechniken können in A. verwendet werden mexicanus in zukünftigen Studien kritische Fragen über die Entwicklung der Höhle Züge zu beantworten.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Genetik, Entwicklung und Zellbiologie und Iowa State University und von NIH Zuschusses EY024941 (WJ) .Dr finanziert. Jeffrey Essner Bemerkungen zu dem Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
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