Summary
Gene-targeting mutagenese er nu muligt i en bred vifte af organismer ved anvendelse af genom redigeringsteknikker. Her demonstrerer vi en protokol for målrettet gen mutagenese hjælp transskription aktivator som effektor nukleaser (Talens) i Astyanax mexicanus, en fiskeart, der omfatter overflade fisk og cavefish.
Introduction
Forståelse den genetiske basis for træk evolution er en kritisk forskning mål om evolutionære biologer. Der er gjort betydelige fremskridt med at identificere loci ligger til grund for udviklingen af træk og indkredsning kandidatgener inden for disse loci (for eksempel 1-3). Men funktionelt teste rolle af disse gener har forblev udfordrende så mange organismer, der anvendes til at studere udviklingen i træk er i øjeblikket ikke er genetisk medgørlig. Fremkomsten af genom redigering teknologier har i høj grad øget genetisk manipulability af en bred vifte af organismer. Transskriptionsaktivator-lignende effektor nukleaser (Talens) og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPRs) er blevet anvendt til at generere målrettede mutationer i gener i en række organismer (for eksempel 4-11). Disse værktøjer, der anvendes til et evolutionært relevant systemet, har potentiale til at revolutionere den måde evolutionære biologer studerer den genetiske basis for evolution.
Astyanax mexicanus er en art af fisk, der findes i to former:. En flod-bolig overflade formen (overflade fisk) og flere grotte-boligen formularer (cavefish) A. mexicanus cavefish udviklet sig fra overfladen fisk forfædre (anmeldt i 12). Populationer af cavefish har udviklet en række træk, herunder tab af øjnene, mindske eller tab af pigmentering, øget antal af smagsløg og kranielle neuromasts, og ændringer i adfærd, såsom tab af skolegang adfærd, øget aggression, ændringer i fodring kropsholdning og hyperfagi 13 -19. Cavefish og overflade fisk er interfertile, og er blevet udført genetiske kortlægning eksperimenter for at identificere loci og kandidatgener for hulen træk 1,20-26. Nogle kandidatgener er blevet testet for en funktionel rolle i at bidrage til hule træk i cellekultur 1,19, i modelorganismer af andre arter 21 eller ved overekspression 27 eller forbigående knockdown usynge morpholinoer 28 i A. mexicanus. Men hver af disse metoder har begrænsninger. Evnen til at generere mutante alleler af disse gener i A. mexicanus er afgørende for at forstå deres funktion i udviklingen af cavefish. Således A. mexicanus er en ideel kandidat organisme til anvendelse af genom redigering teknologier.
Her skitserer vi en metode til genom redigering i A. mexicanus bruger Talens. Denne metode kan anvendes til at evaluere mosaik injiceret grundlægger fisk til fænotyper og til isolering linjer af fisk med stabile mutationer i gener af interesse 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer dyr var i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Iowa State University og University of Maryland.
1. Talen Design
- Input ønsket mål-sekvens til en talen design hjemmeside. (For eksempel: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Input valgt spacer / gentag array-længder.
- Kopier den genomiske sekvens i feltet "Sequence".
- Inden for "Giv Brugerdefineret Spacer / RVD Længder" fanen vælge spacer længde og array længde.
Bemærk: Spacer længder af 15 basepar og gentag array-længder på 15-17 fungerer godt og gøre samlingen mindre kompleks.
- Vælg en Talen par. Talen par designet omkring et unikt restriktionsenzymsted muliggør genotypebestemmelse ved restriktionsenzym fordøjelseet PCR-produkt.
- Design primere til at forstærke den genomiske region omkring talen målområdet ved hjælp af en hjemmeside som Primer3 30-32. Når genotypebestemmelse med et restriktionsenzym, at design primere opformere en region, som indeholder restriktionsenzymstedet kun én gang. Det anbefales, at denne region amplificeres og sekventeres før talen konstruktion for at identificere eventuelle polymorfismer til stede i A. mexicanus lab population skal anvendes til mikroinjektion.
2. Talen Assembly (modificeret fra Talen Kit Protocol) 33,34
For yderligere detaljer og fejlfinding, se protokol 34.
- Forberede og sekventere nødvendige plasmider fra talen kit ifølge producentens instruktioner.
- Opsæt # 1 reaktioner til reaktioner A og B. Medtag gentage-variable diresidues (RVDs) 1-10 og destinationen vektor pFUS_A i reaktion A. Medtag RVDs 11- (N-1) og the destinationsvektor pFUS_B (N-1) i reaktionsskema B, hvor N er det samlede antal RVDs i Talen.
- Tilføj til hver reaktion: 1 pi af hvert plasmid indeholdende hver RVD (100 ng / pl), bestemmelsesstedet vektoren (100 ng / pl), 1 pi Bsa restriktionsenzym, 1 pi bovint serumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 pi ligase, 2 pi 10x ligasepuffer og x pi vand til et samlet volumen på 20 pi. Se for eksempel tabel 1.
Bemærk: Halvdelen reaktioner kan også anvendes. - Placer reaktioner i en thermocycler og køre cyklus: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
- Tilføj til hver reaktion: 1 pi af hvert plasmid indeholdende hver RVD (100 ng / pl), bestemmelsesstedet vektoren (100 ng / pl), 1 pi Bsa restriktionsenzym, 1 pi bovint serumalbumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 pi ligase, 2 pi 10x ligasepuffer og x pi vand til et samlet volumen på 20 pi. Se for eksempel tabel 1.
- Inkubér reaktioner med nuklease. Til hver reaktion tilsættes 1 ul 25 mM ATP og 1 pi nuclease. Inkuber reaktioner ved 37 ° C i 1 time.
- Transform reaktioner.
- Transform 2,5 pi af hver reaktion i 25 pi kemisk kompetente celler.
Bemærk: Hjemmelavet kompetent calen kan anvendes. celler med lav kompetence, kan imidlertid resultere i mangel på kolonier.- Bland 2,5 pi af reaktionen med 25 pi kemisk kompetente celler. Der inkuberes på is i fem min. Inkubér cellerne i 30 sekunder ved 42 ° C.
- Anbring glassene på is i 2 min. Tilføj 125 pi Super Optimal bouillon med katabolitrepression (SOC). Ryst rørene ved 37 ° C i 1 time.
- Plade 100 pi de transformerede celler på LB-plader med spectinomycin (50 ug / ml), X-gal og isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Grow O / N ved 37 ° C.
- Transform 2,5 pi af hver reaktion i 25 pi kemisk kompetente celler.
- Pick 2-3 hvide kolonier for hver reaktion og tjekke ved koloni-PCR under anvendelse af primere pCR8_F1 og pCR8_R1 (tabel 2).
- Lav en master mix af reagenserne. Se for eksempel tabel 3.
- Vælg en koloni, og smøre det ind i bunden af et PCR-rør, og derefter sætte resterne af kolonien i 2 ml LB med spectinomycin(50 ug / ml). Placer 15 pi af master mix ind i røret med kolonien.
- Kør følgende PCR program (tabel 4)
- Kontroller PCR (køre hele volumen) på en 1,5% agarosegel ved elektroforese. De korrekte kloner vil have et bånd ved den forventede størrelse samt en udstrygning og en stige af bånd. For et eksempel på en passende smear, se 34,33.
- Grow 2 ml kulturer af de korrekte kloner i LB media O / N ved 37 ° C i en rysteinkubator.
- Miniprep plasmiderne ifølge producentens anvisninger.
- Sekvens for at kontrollere talen rækkefølge med pCR8_F1 og pCR8_R1. Følg tidligere beskrevne metoder 35.
- Brug af korrekte kloner verificerede ved sekventering, oprettet reaktionen # 2 (Talen kit), som vil placere RVDs fra A- og B-vektorer og den endelige RVD ind destinationen vektor.
- Forbered mix for reaktion 2 (tabel 5).
Bemærk: Half reaktioner kan anvendes. - Placer reaktionerne i en thermocycler og kør følgende program: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
- Forbered mix for reaktion 2 (tabel 5).
- Transform reaktioner.
- Transform 2,5 pi af hver reaktion i 25 pi kemisk kompetente celler.
- Bland 2,5 pi af reaktionen med 25 pi kemisk kompetente celler. Der inkuberes på is i 5 min. Varmechok cellerne i 30 sek ved 42 ° C.
- Anbring glassene på is. Tilføj 125 pi SOC. Anbring rørene i en rysteinkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Plade 100 pi de transformerede celler på LB-plader med ampicillin (100 ug / ml), X-gal og IPTG. Grow O / N ved 37 ° C.
- Transform 2,5 pi af hver reaktion i 25 pi kemisk kompetente celler.
- Pick 1-3 hvide kolonier for hver reaktion og tjekke ved koloni-PCR under anvendelse af primerne TAL_F1 og TAL_R2 (tabel 2).
- Lav en opløsning af polymerasen mastermiksens, vand og primere sombeskrevet i tabel 3. Vælg en koloni og smøre det ind i bunden af et PCR-rør, og derefter sætte resterne af kolonien i 2 ml LB med ampicillin (100 ug / ml). Placer 15 pi af opløsningen i rør med kolonien.
- Kør PCR-programmet (tabel 6).
- Kontroller PCR på en 1,5% agarosegel ved elektroforese. De korrekte kloner vil have en udtværing og en stige af bands. For et eksempel på en passende smear, se 34,33.
- Grow 2 ml kulturer af de korrekte kloner i LB media O / N ved 37 ° C i en rysteinkubator.
- Miniprep plasmiderne ifølge producentens anvisninger.
- Sekvens for at kontrollere talen rækkefølge med TAL_F1 og TAL_R2 følgende tidligere beskrevne metoder 35.
3. mRNA Transkription af Talens
- Fordøje 4 ug sekvens-verificeret skabelon med 2 pi Sac I i 2 timer ved 37 ° C. Køre 2 pi af SacI-fordøjet plasmid på en 1,5% agarosegel ved elektroforese. Plasmider, der er fordøjet korrekt vil vise en enkelt bånd.
- Oprens resterende SacI-fordøjet plasmid Efter PCR-oprensningskittet protokol. Vask to gange med før eluering vaskeopløsningen. Eluere ind 30 pi nuclease-frit vand.
- Følg standard protokol for T3 mRNA produktion.
- Oprettet halve reaktioner under anvendelse 0,5 ug lineariseret skabelon (fremstillet ovenfor). Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Tilsæt 0,5 pi DNase (inkluderet i kit) og inkuberes ved 37 ° C i 15 minutter.
- Oprens mRNA'et, efter fabrikantens anvisninger. Eluere i 30 pi nuclease-frit vand.
- Kør en 1,5% agarosegel ved elektroforese for at kontrollere mRNA.
- Rengør gel apparat med et produkt til at fjerne RNase forurening og forberede en 1,2% gel.
- Mix 1 pi mRNA +4 &# 181; l nuclease-frit vand + 5 pi glyoxyl loading dye. Inkuber prøverne ved 50 ° C i 30 minutter. Centrifuger rørene kortvarigt og sted på is, før du kører gelen.
- Kontroller koncentration på en fremgangsmåde til kvantificering nucleinsyre koncentrationer og opbevares RNA i alikvoter ved -80 ° C. Vælg en portion størrelse, at RNA ikke er frosset / optøet mere end én gang.
Bemærk: Koncentrationer af 500-1.000 ng / nl opnås typisk. RNA med en lavere koncentration kan anvendes, så længe RNA integritet bevares (som vurderet ved et bånd snarere end en udstrygning på gelen).
4. Inject Astyanax mexicanus Embryoner med Talen mRNA
- Forbered Værktøjer til injektion.
- Hæld injektion plader ved at hælde 1,2% agarose i fisk vand (vand konditioneret med natriumbicarbonat og havsalt til pH 7,4 og ledningsevne 700 uS) i en petriskål. Placer en støbeform (plastik stykke med fremskrivninger at gøre brønde til fiskæg) inde i skålen. Fjerne formen, når agarosen er størknet og opbevares ved 4 ° C. For nærmere oplysninger om formen se 36.
- Træk nåle til injektion ved hjælp af en nål aftrækker ifølge producentens anvisninger.
Bemærk: Passende nål længde er vigtig for injektioner. Nåle, der er for lang vil være for fleksibel til injektioner. Protokollen for at trække nåle vil variere med det anvendte udstyr til at trække nåle. Et eksempel på en passende kanyle er vist i figur 1. For vores udstyr, vi trække nåle, der er 5-6 cm i længden, og har en ydre diameter på spidsen af ca. 0,011 mm, når de knækkes. Imidlertid bør nåle kalibreres (trin 4.3.4) for at bestemme åbningsbredde. Et eksempel program til at trække nåle kan findes i tabel 7. - Forbered glas pipetter til ægoplægning ved at bryde pipetten, således at åbningen er stor nok til et æg til at passere igennem. Flamme brudt ende indtildet ikke længere skarp.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge glas pipetter og glasskåle ved arbejde med A. mexicanus æg og embryoner, som de er klistret og vil holde sig til plast.
- Saml 1-celle Stage Æg.
- Race A. mexicanus efter standard protokoller 37.
Bemærk: For eksempel, hvis fiskene holdes på en 14 lys: 10 mørke cyklus og bruge Zeitgerber tid (ZT) med ZT0 som lys på og ZT14 som lys slukket, vores overflade fiskeyngel mellem ZT15 og ZT19. skal bestemmes eksakt gydetidspunktet for hver enkelt lab. - Fremkald gydning ved overfodring fisk i 3-4 dage før parring og placere fisk i ferskvand. Hæv temperaturen 2 ° F. Bemærk: Vores første temperatur vand er ca. 74 ° F.
- Indsamle overflade fiskeæg i mørke, kontrol hver 15 minutter til dannelse af æg ved 1 celle stadium. kan opnås hundredvis af æg fra en enkelt par overflade fisk.
- Indsamleæg i glasskåle at forhindre stikning til plastoverflader og sortere for at isolere embryoner på en celle stadie før injektion ved at observere æg under mikroskop og indsamling af æg, der er en enkelt celle. Holde æg i frisk systemet vand (tank vand, hvor voksne fisk er opstaldet, som er blevet behandlet for pH og ledningsevne).
- Race A. mexicanus efter standard protokoller 37.
- Sprøjt Talen mRNA.
- Sprøjt forskellige mængder af total mRNA (lige store mængder af hver Talen i par) at bestemme den optimale koncentration til injektion som toksicitet og effektivitet varierer efter Talen par. Start med at injicere koncentrationer af total mRNA, der er 400-800 pg. Fortynd og kombinere mRNA til ønskede koncentrationer til indsprøjtning 1,5 nl.
- Load fortyndet mRNA ind i bagsiden af nålen, og sæt nålen til en mikro-injektor.
- Bryd nålen med pincet.
- Kalibrer nålen. For eksempel, skubbe 10 gange og indsamle det resulterende fald i en mikro kapillarrør. For 10 x 100 engangs 1,081; l, 32 mm micro kapillær, bør drop fylde mikro kapillær til 0,5 mm i 1,5 nl / 1 injektion. Juster injektionen tid og tryk efter behov.
- Stik nålen ind i enkelt celle og injicere mRNA. Injicere mRNA direkte ind i cellen, ikke ind i blommen.
- Saml injicerede embryoner i glasskåle. Hold embryoer ved 23-25 ° C. Fjern døde embryoner (fostre, der bliver overskyet og uregelmæssigt formet) regelmæssigt for de første par dage efter injektion. Rekordstort antal af døde og misdannede fostre fra kontrol (ikke-injiceret) og injiceret plader.
Bemærk: Øget koncentration mRNA kan føre til øget toksicitet og deformitet / død af embryoner. Således må toksicitet versus effektivitet være afbalanceret for at bestemme den bedste koncentration af mRNA at injicere.
5. Fænotype Grundlægger Fisk og evaluere Talen Effektivitet
- Sacrifice embryoner i henhold til institutionel dyr protokol.
Bemærk: Vi euthanizeembryoner af hurtig afkøling på is. - Saml embryoner til 0,8 pi PCR strimler rør ved hjælp af en overførsel pipette.
Bemærk: Genotypebestemmelse kan udføres på de enkelte embryoner eller puljer af embryoner. - Uddrag DNA.
- Placer embryoner i 100 pi 50 mM natriumhydroxid (NaOH) og inkuberes ved 95 ° C i 30 minutter, hvorefter der afkøles til 4 ° C.
- Tilføj 1/10 volumen (10 pi) 1 M Tris-HCI pH 8.
- Udfør en PCR på regionen ved hjælp af primere designet i trin 1.3 (se tabel 8 og 9 til prøve protokoller). For individuelle embryoer 1 pi DNA er tilstrækkelig til PCR-reaktionen.
- Fordøje resulterende PCR-produkt med det passende restriktionsenzym og køre en 1,5% agarosegel ved elektroforese.
- For eksempel til genotypebestemmelse af oculocutaneous albinisme 2 (oca2) locus i injicerede embryoner fordøje PCR-produktet ved hjælp af restriktionsenzymet Bsr I ved tilsætning af 0.5 Pi Bsr I direkte til 12,5 pi af den afsluttede PCR-reaktion, inkubering ved 65 ° C i 2 timer. Kør ufordøjet og fordøjede produkter på en gel. Restriktionsenzym resistente bånd (dvs. bånd, der ikke fordøjer) viser, at talen-inducerede mutationer er til stede (Figur 2).
- (Valgfrit) Beregn procent mutation sats ved at bestemme den procentdel af uslebne produkt ved at analysere billeder af geler i Fiji 38 hjælp af gel analyse værktøj til at beregne intensiteten værdi hvert bånd som tidligere 29 beskrevet.
- Bestemmelse af sekvensen af mutante alleler af TA kloning gelen oprenset restriktionsenzym resistent mutant band og sekventering af kloner.
- Gel rense restriktionsenzym resistent mutant bånd efter producentens anvisninger. TA klone båndet efter producentens anvisninger. Pick kolonier og vokse i 1,5 ml LB O / N ved 37 ° C i et ryste-inkubator.
- Miniprep kulturer efter fabrikantens instruktioner. Send DNA'et til sekventering.
- Brug af et program som APE, tilslutter de mutante sekvenser til vildtypesekvensen.
- Kopier og indsæt begge sekvenser i APE-filer. Vælg "Juster to sekvenser" værktøj fra menuen "Funktioner".
- Angiv de to DNA-sekvenser ved hjælp af dropdown menuer.
Bemærk: Den omvendte komplement af den klonede sekvens kan være nødvendigt at der anvendes afhængigt af den retning, PCR gik ind i kloningsvektoren. Hvis sekvenserne ikke tilpasse Gentag trin markere feltet "Rev-Com" i boksen "Juster DNA".
- Vurdere grundlægger fisk til fænotyper på passende tidspunkt og ved hjælp af passende metoder til den forventede fænotype 29 (For eksempel, figur 3). Metoder til fænotypebestemmelse vil være baseret på den forventede fænotype for genet målrettet af forskeren hjælp af protocol.
6. Skærm til kimlinietransmission
Bemærk: A. mexicanus bliver kønsmodne i 4-8 måneder.
- Kryds kønsmodne grundlægger fisk til vildtype fisk.
- Screen embryoner eller voksne fisk ved anvendelse af fremgangsmåder i trin 5,1-5,7 (figur 4). For voksne fisk, kan et stykke af halen blive klippet efter bedøvelse.
- Bedøve fisk ved nedsænkning fisk i en opløsning af tricaine (3-aminobenzoesyre-ethylester) for at reducere stress i fin klipning. Efter fin klipning, tillader fisk at komme sig i ferskvand. Fisk inddrive hurtigt; observere, indtil de har inddrevet (svømmer normalt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Talen par injektioner medfører binding af RVDs til specifikke DNA nukleotider og dermed dimerisering af Foki domæner, hvilket resulterer i dobbeltstrengede pauser 39, som kan repareres gennem ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ). NHEJ ofte introducerer fejl, der resulterer i insertioner eller deletioner (indels). Indels kan identificeres ved at amplificere regionen omkring talen målstedet og fordøje det resulterende amplikon med et restriktionsenzym, der skærer inden for talen spacerregionen. Alleler uden en Indel vil fordøje mens alleler indeholdende indels der ændrer restriktionsenzymet målsekvensen vil ikke fordøje, producerer et restriktionsenzym resistent bånd (figur 2).
Talen injektioner kan sandsynligvis resultere i biallele genmutationer i A. mexicanus 29. Således kan nogle fænotyper vurderes i grundlægger fisk. Til eksempel, vi evalueret pigmentering i overfladen fisk injiceret med Talens målrettet oca2, genet hypotese at være ansvarlig for albinisme i flere albino populationer af cavefish 1,28. Vi fandt albino plastre i oca2 Talen-injicerede fisk ikke er til stede i ikke-injicerede fisk 29 (figur 3).
For mange eksperimenter, er det ønskeligt at have mutante linjer af fisk til evaluering fænotyper. Stifter fisk med transmitterede mutante alleler kan identificeres ved genotyping afkom af krydsninger af grundlægger fisk mod vildtype fisk (Figur 4).
Figur 1. Nål til injektion af mRNA. Fotografi af en mikropipette forud for at blive brudt anvendes til at injicere Talen mRNA til encellede embryoer._upload / 54.113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. talen effektivitet for Oca2. 306 bp PCR-produkter fra exon 9 af oca2 i Astyanax mexicanus blev undersøgt for tab af restriktionsenzym websted, når forskellige mængder af Talen mRNA blev injiceret 29. Amplikonet fra en kontrol embryo blev fordøjet mens en del af amplikonet var resistent over for restriktionsfordøjelse i puljer af 10 Talen injicerede embryoner. Restriktionsenzymspaltning resistente bands fra embryoner injiceret med Talen mRNA målrettet oca2 er blevet vist at indeholde indels 29. Bemærk, at stigende koncentrationer af mRNA injiceret resulterer i forøget talen effektivitet (mere ufordøjet DNA). Baner med "-" er ufordøjet, baner med "+" er Digested med restriktionsenzym. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. fænotype grundlægger fisk for ændringer i pigmentering. (A) Kontrollen ikke-injicerede overflade A. mexicanus. (B) Patch mangler melanoforerne i en grundlægger overflade fisk injiceret med 400 pg Talen mRNA målretning oca2 (pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. kønscelleoverførsel af Talen induceret mutations. 306 bp PCR-produkter fra exon 9 af oca2 i A. mexicanus blev undersøgt for tab af restriktionsenzymstedet i puljer af 10 F 1 fisk fra en injiceret grundlægger fisk. Amplikonet fra en kontrol embryo blev fordøjet mens en del af amplikonet var resistent over for restriktionsfordøjelse i puljer på 10 F 1 embryoner. Restriktionsenzym fordøje resistente bands fra oca2 F 1 s har vist sig at indeholde indels 29. Lanes med "-" er ufordøjet, baner med "+" fordøjes med restriktionsenzym. Klik her for at se en større version af dette tal.
| reaktion A | Reactipå B | |||
| beløb | reagens | beløb | reagens | |
| 4 pi | vand | 10 pi | vand | |
| 1 pi | pFUS_A | 1 pi | pFUS_B4 | |
| 1 pi | Bsal | 1 pi | Bsal | |
| 1 pi | BSA | 1 pi | BSA | |
| 1 pi | ligase | 1 pi | ligase | |
| 2 pi | 10x ligasebuffer | 1 pi | 10x ligasebuffer | |
| 1 pi | pNH1 | 1 pi | pNG1 | |
| 1 pi | pNH2 | 1 pi | pHD2 | |
| 1 pi | pNG3 | 1 pi | pNH3 | |
| 1 pi | pHD4 | 1 pi | pNI4 | |
| 1 pi | pHD5 | |||
| 1 pi | PHD6 | |||
| 1 pi | pNG7 | |||
| 1 pi | pHD8 | |||
| 1 pi | pNG9 | |||
| 1 pi | pHD10 | |||
Tabel 1. Eksempel reaktion samling A og B for enTalen indeholder RVDs NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| primer navn | sekvens (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Tabel 2. PCR-primere for koloni-PCR, fra 34.
| reagens | beløb |
| Taq mastermiksens, 2x | 50 pi |
| pCR8_F1 primer,10 uM | 4 pi |
| pCR8_R1 primer, 10 uM | 4 pi |
| Nuklease-frit vand | 42 pi |
| * Justér mester mix, hvis der anvendes en anden taq | |
Tabel 3. Master mix for 100 pi (15 pl / reaktion) for koloni-PCR 1.
| trin | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Gå til trin 2 for 30 cykler | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabel 4. PCR program for koloni-PCR 1.
| beløb | reagens | koncentration |
| 12 pi | vand | |
| 1 pi | vektor A | 100 ng / pl |
| 1 pi | vektor B | 100 ng / pl |
| 1 pi | destination vektor pT3Ts-gt | 50 ng / pl |
| 1 pi | endelige RVD (PLR-RVD) | 100 ng / pl |
| 1 pi | Esp3I | |
| 1 pi | ligase | |
| 2 pi | 10x ligasebuffer | |
Tabel 5. Protokol for anden montage reaktioner.
| trin | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Gå til trin 2 for 30 cykler | |
| 6 | 72 | 300 |
Tabel 6. PCR programfor koloni-PCR 2.
| varme | 290 |
| trække | 150 |
| hastighed | 100 |
| tid | 150 |
| Disse parametre er for en Flaming / Brown Mikropipette Puller Model P-97 ved hjælp af et trug glødetråd | |
Tabel 7. Prøve nål trække program.
| reagens | beløb |
| Taq mastermiksens, 2x | 12,5 pi |
| genspecifikke forward primer, 10 pM | 1 μl |
| genspecifikke revers primer, 10 pM | 1 pi |
| Nuklease-frit vand | 9,5 pi |
| DNA | 1 pi |
| * Justér mester mix, hvis der anvendes en anden taq | |
Tabel 8. Sample protokol for gen-specifik PCR.
| trin | temperatur (° C) | tid (sek) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Gå til sTEP 2 i 35 cykler | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Justere annealingstemperatur og forlængelse tid for specifikke primere og PCR-produkt størrelse | ||
Tabel 9. Eksempel PCR program for genspecifik PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Store fremskridt er blevet gjort i de seneste år til at forstå den genetiske basis af udviklingen i træk. Mens kandidatgener ligger til grund for udviklingen af en række træk er blevet identificeret, har det været en udfordring at teste disse gener in vivo på grund af mangel på genetisk sporbarhed af mest evolutionært interessante arter. Her rapporterer vi en metode til genom redigering i A. mexicanus, en art anvendt til at undersøge udviklingen i hulen dyr. Genetisk kortlægning studerer 1,21,23 og kandidat gen nærmer 19,40 har identificeret en række kandidatgener for udviklingen af træk i hulen form af A. mexicanus. Den nylige offentliggørelse af cavefish genomet 41 giver en ekstra kraftfuldt værktøj til at identificere kandidatgener for udviklingen af grotte træk. At teste funktionen af mange af disse kandidatgener kræver teknikker til at reducere genekspression. Den eneste nuværende mulighed for at studereing reduceret genekspression i A. mexicanus er ved brug af morpholinoer. Men morpholino gen knockdown er forbigående, er begrænset til et par dage efter befrugtning, og er ikke nyttigt til at studere træk hos voksne dyr, såsom adfærdsmæssige forskelle mellem voksne grotte og overflade fisk som skolegang 17, hyperfagi 19 og vibrationer attraktion adfærd 42. Generering af tab af funktion alleler af gener, såsom dem, der kan fremstilles ved anvendelse Talens, vil være afgørende for at teste rollen som kandidatgener for disse træk.
Der er udviklet metoder til nem montering af talen par 33 og den detaljerede protokol for denne metode er tilgængelig 34. Denne protokol blev optimeret til zebrafisk brug af Bedell et al. 7, ved hjælp af en anden slutdestination vektor, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). Denne vektor muliggør transskription af Talen mRNA til injektion i encellede zebrafisk embryoner.Vi har brugt denne modificerede samling metode, forklaret i detaljer her, at samle og transskribere Talens til injektion i A. mexicanus. Vi fandt, at når det injiceres i encellede overflade A. mexicanus embryoner, som beskrevet i denne protokol, kunne vi mutere A. mexicanus gener 29. Til fremtidig forskning i kandidatgener ikke er beskrevet i denne protokol, kan sekvenser findes i cavefish genom 41 og anvendes til at identificere talen målwebsteder.
Kritisk for vellykkede injektioner er høj kvalitet Talen mRNA. Således, kontrol for RNA kvalitet ved at køre en lille mængde RNA på en gel forud for injektion er vigtigt (trin 3.6). Andre forholdsregler til opretholdelse af RNA integritet, såsom frysning portioner for at undgå fryse smelter (Trin 3.7), og opretholdelse af sterile forhold ved hjælp af rent vand og RNAse-fri rør og tip under injektioner (Trin 4), der bør tages. En yderligere afgørende skridt til at hæve injiceret fisk errense ud døde fostre efter injektion, som døde embryoer hurtigt kan påvirke vandkvaliteten. Således har vi fjerne døde fostre morgenen efter injektioner, og med jævne mellemrum for de næste par dage efter injektioner at opretholde sunde levende fostre (trin 4.3.6).
Talen mutagenese i Astyanax mexicanus kan være meget effektiv; dog effektivitet varierer afhængigt af talen pair injiceret 29. Forøgede mRNA-koncentrationer kan føre til øget toksicitet og deformitet og død af injicerede embryoner. Således må toksicitet versus effektivitet afprøves og afbalanceret til at bestemme den optimale koncentration af mRNA at injicere. For højeffektive Talen par, kan fænotyper vurderes i injiceres grundlægger fisk. For eksempel injektion af Talens målretning oca2 resulterede i albino pletter i overfladen fisk 29 (figur 3). For andre egenskaber eller gener, men vurdering af fænotyper i grundlæggeren fisk kan være en udfordring på grund aftil subtilt af fænotypen eller lav effektivitet talen pair injiceres. Således til mange anvendelser vil det være ønskeligt at frembringe kimlinie mutationer i et gen af interesse til analyse af den rolle, en kandidat-gen i et ikke-mosaik dyr. Opnåelse kimlinie transmission af talen-inducerede mutationer i A. mexicanus er muligt 29 (figur 4). Således kan denne teknik anvendes til at vurdere andre kandidatgener.
Et par begrænsninger udføre genetiske manipulationer i Astyanax mexicanus eksisterer på dette tidspunkt. Overflade og cavefish race i mørke, sent på natten. I et laboratorium, hvor det ikke er muligt at vende lys mørke cyklus, skal forskerne kommer sent om natten for at udføre injektioner, som det er afgørende at injicere umiddelbart efter gydning. Desuden er det vigtigt at indsamle overfladefisk embryoner i mørke, som lys vil påvirke gydning.
Andre teknikker, i particular CRISPR / Cas-systemet (revideret i 43), findes for genom redigering og vil sandsynligvis være gældende for A. mexicanus. Faktisk protokoller for guide RNA samling findes der er hurtige og nemme 44 og protokollen rapporteret her kan ændres til CRISPR / Cas injektion. Derudover nye ansøgninger om genom-redigering er hurtigt ved at blive udviklet, og mange af disse kan være nyttigt for A. mexicanus forskere. For eksempel i zebrafisk præcise mutationer er blevet foretaget i et gen af interesse ved coinjecting Talens med en enkeltstrenget oligo indeholdende en mutation 7. Denne teknik kan være nyttigt for at vurdere, hvilken rolle grotte alleler i at generere grotte fænotyper, såsom den rolle, en missense mutation i visse grotte alleler af MC4R i forskelle i stofskiftet observeres mellem cavefish og flade fisk 19. Talens er også blevet anvendt til at generere alleller af gener via homolog rekombination, der udtrykker fluorescerende markører in mønstre ligner den endogene loci 45. Disse metoder kan anvendes i A. mexicanus at evaluere undergrupper af celler eller ekspression af kandidatgener. CRISPR / Cas-systemet er blevet anvendt i zebrafisk at opnå vævsspecifik gen knockout 46. Disse teknikker, der anvendes til A. mexicanus, kunne være nyttigt at vurdere det genetiske grundlag for processer såsom øjet tab i cavefish. Linsen spiller en kritisk rolle i processen med øjet tab i cavefish 47 og den vævsspecifikke CRISPR / Cas-systemet kan anvendes til at vurdere betydningen af kandidatgener for øje tab specifikt i linsen i forhold til andre væv i øjet. Disse og andre genom-redigering teknikker kan anvendes i A. mexicanus i fremtidige undersøgelser at besvare kritiske spørgsmål om udviklingen i hulen træk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Institut for Genetik, udvikling og cellebiologi og Iowa State University og ved NIH tilskud EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner forudsat kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mutation contributes to adaptive beach mouse color pattern. Science. 313 (5783), 101-104 (2006).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- Liu, J., et al. Efficient and specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy TALEN strategy. J Genet Genomics. 39 (5), 209-215 (2012).
- Bannister, S., et al. TALENs mediate efficient and heritable mutation of endogenous genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Genetics. 197 (1), 77-89 (2014).
- Lei, Y., et al. Efficient targeted gene disruption in Xenopus embryos using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17484-17489 (2012).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Ansai, S., et al. Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases. Genetics. 193 (3), 739-749 (2013).
- Zhang, X., et al. Isolation of doublesex- and mab-3-related transcription factor 6 and its involvement in spermatogenesis in tilapia. Biol Reprod. 91 (6), 136 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Gross, J. B.
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces) - support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Teyke, T. Morphological differences in neuromasts of the blind cave fish Astyanax hubbsi and the sighted river fish Astyanax mexicanus. Brain Behav Evol. 35 (1), 23-30 (1990).
- Schemmel, C. Genetische Untersuchungen zur Evolution des Geschmacksapparates bei cavernicolen Fischen. Z Zool Syst Evolutionforsch. 12, 196-215 (1974).
- Burchards, H., Dolle, A., Parzefall, J. Aggressive behavior of an epigean population of Astyanax mexicanus (Characidae, Pisces) and some observations of three subterranean populations. Behavioral Processes. 11, 225-235 (1985).
- Parzefall, J., Fricke, D. Alarm reaction and schooling in population hybrids of Astyanax fasciatus (Pisces, Characidae). Memoires e Biospeologie. , 29-32 (1991).
- Schemmel, C. Studies on the Genetics of Feeding Behavior in the Cave Fish Astyanax mexicanus F. anoptichthys. Z. Tierpsychol. 53, 9-22 (1980).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Protas, M., et al. Multi-trait evolution in a cave fish, Astyanax mexicanus. Evol Dev. 10 (2), 196-209 (2008).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genet. 5 (1), e1000326 (2009).
- Yoshizawa, M., Yamamoto, Y., O'Quin, K. E., Jeffery, W. R. Evolution of an adaptive behavior and its sensory receptors promotes eye regression in blind cavefish. BMC Biol. 10, 108 (2012).
- Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), 57281 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Convergence in feeding posture occurs through different genetic loci in independently evolved cave populations of Astyanax mexicanus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), 16933-16938 (2013).
- Kowalko, J. E., et al. Loss of Schooling Behavior in Cavefish through Sight-Dependent and Sight-Independent Mechanisms. Curr Biol. , (2013).
- Gross, J. B., Krutzler, A. J., Carlson, B. M. Complex craniofacial changes in blind cave-dwelling fish are mediated by genetically symmetric and asymmetric loci. Genetics. 196 (4), 1303-1319 (2014).
- Yamamoto, Y., Stock, D. W., Jeffery, W. R. Hedgehog signalling controls eye degeneration in blind cavefish. Nature. 431 (7010), 844-847 (2004).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS One. 8 (11), e80823 (2013).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS One. 10 (3), e0119370 (2015).
- Primer3 v. 0.4.0. , Available from: http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ (2015).
- Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B. C., Remm, M., Rozen, S. G. Primer3- new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (12), 82 (2011).
- Addgene. Golden TALEN assembly. , Available at: https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/98/5a/985a6117-7490-4001-8f6a-24b2cf7b005b/golden_gate_talen_assembly_v7.pdf (2011).
- Addgene. Sequencing TALENs. , Available at: http://www.addgene.org/static/cms/filer_public/eb/d2/ebd246f3-db1e-499c-85ce-f79c023a726f/sequencing_talens.pdf (2012).
- Weinberg, E. A device to hold zebrafish embryos during microinjection. ZFIN Protocol Wiki. , Available at: https://wiki.zfin.org/display/prot/A+Device+To+Hold+Zebrafish+Embryos+During+Microinjection (2009).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bitinaite, J., Wah, D. A., Aggarwal, A. K., Schildkraut, I. FokI dimerization is required for DNA cleavage. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10570-10575 (1998).
- Elipot, Y., et al. A mutation in the enzyme monoamine oxidase explains part of the Astyanax cavefish behavioural syndrome. Nat Commun. 5, 3647 (2014).
- McGaugh, S. E., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nat Commun. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., Goricki, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Curr Biol. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Blackburn, P. R., Campbell, J. M., Clark, K. J., Ekker, S. C. The CRISPR system--keeping zebrafish gene targeting fresh. Zebrafish. 10 (1), 116-118 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Dev Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289 (5479), 631-633 (2000).
