Summary
la mutagenèse du gène de ciblage est maintenant possible dans une large gamme d'organismes en utilisant des techniques de montage du génome. Ici, nous démontrons un protocole pour la mutagenèse du gène ciblé utilisant l' activateur de la transcription comme nucléases effectrices (Talens) dans Astyanax mexicanus, une espèce de poisson qui comprend les poissons de surface et cavefish.
Introduction
Comprendre la base génétique de l'évolution caractéristique est un objectif de recherche critique des biologistes évolutionnistes. Des progrès considérables ont été accomplis dans l' identification des loci sous - tendent l'évolution des traits et d' identifier des gènes candidats au sein de ces loci (par exemple 1-3). Cependant, le test fonctionnel du rôle de ces gènes est restée difficile que de nombreux organismes utilisés pour l'étude de l'évolution des traits ne sont actuellement pas génétiquement traitable. L'avènement des technologies de l'édition du génome a considérablement augmenté manipulabilité génétique d'un large éventail d'organismes. Transcription nucléases activateurs comme effecteurs (Talens) et regroupés régulièrement espacées répétitions courtes palindromiques (de CRISPRs) ont été utilisés pour générer des mutations ciblées dans des gènes dans un certain nombre d'organismes (par exemple 4-11). Ces outils, appliqués à un système évolutionnaire pertinent, ont le potentiel de révolutionner le chemin biologistes évolutionnistes étudier la base génétique de l'évolution.
Astyanax mexicanus est une espèce de poisson qui existe sous deux formes:. Un (poissons de surface) de la rivière-logement sous forme de surface et de multiples formes cavernicoles (de cavefish) A. mexicanus cavefish a évolué à partir d' ancêtres de poissons de surface (revue dans 12). Les populations de poissons cavernicoles ont évolué un certain nombre de traits , y compris la perte d'yeux, de diminuer ou de la perte de la pigmentation, nombre de papilles gustatives et neuromastes crâniens, et les changements accru de comportement tels que la perte du comportement de la scolarité, l' augmentation de l' agressivité, des changements dans l' alimentation posture et hyperphagie 13 -19. Cavefish et les poissons de surface sont interfécondes, et des expériences de cartographie génétique ont été réalisées pour identifier les gènes loci et candidats pour les caractères de la grotte 1,20-26. Certains gènes candidats ont été testés pour un rôle fonctionnel dans la contribution aux caractéristiques des cavernes dans la culture cellulaire 1,19, dans des organismes modèles d'autres espèces 21 ou 27 par une surexpression ou knock - down temporaire uchanter morpholinos 28 A. mexicanus. Cependant, chacune de ces méthodes a des limites. La capacité de générer des alleles mutants de ces gènes chez A. mexicanus est essentiel pour la compréhension de leur fonction dans l'évolution de cavefish. Ainsi, A. mexicanus est un organisme candidat idéal pour l' application des technologies de modification du génome.
Nous présentons ici une méthode pour l' édition du génome dans A. mexicanus utilisant TALENs. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer la mosaïque injectée fondateur du poisson pour les phénotypes et pour isoler les lignes de poissons avec des mutations stables dans les gènes d'intérêt 29.
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Protocol
Toutes les procédures d'animaux étaient en conformité avec les lignes directrices des Instituts nationaux de la santé et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de l'Iowa et l'Université du Maryland.
1. TALEN Conception
- Entrée souhaitée séquence cible à un site Web de conception TALEN. (Par exemple: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). Entrée choisie longueurs de tableau entretoise / répétition.
- Copiez la séquence génomique dans la case "Séquence".
- Dans l'onglet "Fournir personnalisé Spacer / RVD Longueurs" sélectionner la longueur d'espacement et longueur du tableau.
Remarque: Les longueurs Spacer de 15 paires de bases, et répéter longueurs de réseaux de 15-17 fonctionnent bien et rendre l'assemblage moins complexe.
- Sélectionnez une paire TALEN. paires Talen conçus autour d'un site unique d'enzyme de restriction permettent pour le génotypage par l'enzyme de restriction digestionun produit de PCR.
- Concevoir des amorces pour amplifier la région génomique entourant le site cible TALEN au moyen d' un site Web tel que Primer3 30-32. Lors de génotypage avec une enzyme de restriction, les amorces de conception pour amplifier une région qui contient le site d'enzyme de restriction qu'une seule fois. Il est recommandé que cette région est amplifiée et séquencée avant la construction TALEN pour identifier les polymorphismes présents dans A. mexicanus population de laboratoire à utiliser pour microinjection.
2. Assemblée TALEN (Modifié à partir du protocole TALEN Kit) 33,34
Pour plus de détails et de dépannage, voir le protocole 34.
- Préparer et séquencer les plasmides nécessaires à partir du kit TALEN selon les instructions du fabricant.
- Mettre en place le # 1 des réactions pour les réactions A et B Inclure répéter variables diresidues (DRV) 1-10 et pFUS_A vecteur de destination dans la réaction A. Inclure DRV 11- (N-1) et evecteur e destination pFUS_B (N-1) dans la réaction B où N est le nombre total de DRV dans le TALEN.
- Ajouter à chaque réaction: 1 pi de chaque plasmide contenant chaque DRV (100 ng / ul), le vecteur de destination (100 ng / pl), 1 pl Bsa I des enzymes de restriction, 1 ul de sérumalbumine bovine (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul de ligase, 2 ul de tampon 10 x de ligase et x ul d'eau pour un volume total de 20 ul. Par exemple, voir le tableau 1.
Remarque: Les demi-réactions peuvent également être utilisés. - Placez les réactions dans un thermocycleur et exécuter le cycle: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min.
- Ajouter à chaque réaction: 1 pi de chaque plasmide contenant chaque DRV (100 ng / ul), le vecteur de destination (100 ng / pl), 1 pl Bsa I des enzymes de restriction, 1 ul de sérumalbumine bovine (BSA) (2 mg / ml ), 1 ul de ligase, 2 ul de tampon 10 x de ligase et x ul d'eau pour un volume total de 20 ul. Par exemple, voir le tableau 1.
- Incuber les réactions avec la nucléase. Pour chaque réaction ajouter 1 pl 25 mM ATP et 1 ul nucléase. Incuber réactions à 37 ° C pendant 1 heure.
- Transformer les réactions.
- Transformer 2,5 pi de chaque réaction dans 25 ul chimiquement cellules compétentes.
Note: Homemade c compétenteaunes peuvent être utilisés. Cependant, les cellules ayant une faible compétence peuvent entraîner un manque de colonies.- Mélanger 2,5 pi de la réaction avec 25 pi de cellules chimiquement compétentes. Incuber sur la glace pendant cinq minutes. Incuber les cellules pendant 30 secondes à 42 ° C.
- Placer les tubes sur la glace pendant 2 min. Ajouter 125 pi de bouillon de Super optimale avec répression catabolique (SOC). Agiter les tubes à 37 ° C pendant 1 heure.
- Plaque 100 ul de cellules transformées sur des plaques LB contenant de la spectinomycine (50 pg / ml), X-gal et isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG). Cultivez O / N à 37 ° C.
- Transformer 2,5 pi de chaque réaction dans 25 ul chimiquement cellules compétentes.
- Choisissez 2-3 colonies blanches pour chaque réaction et vérifier par colonie PCR utilisant des amorces pCR8_F1 et pCR8_R1 (tableau 2).
- Faire un mélange maître des réactifs. Par exemple, voir le tableau 3.
- Choisissez une colonie et de l'étaler dans le fond d'un tube PCR, puis mettre les restes de la colonie dans 2 ml de LB avec spectinomycine(50 ug / ml). Placer 15 ul du mélange maître dans le tube avec la colonie.
- Exécutez le programme de PCR suivant (tableau 4)
- Vérifiez la PCR (exécuter la totalité du volume) sur un gel agarose à 1,5% par électrophorèse. Les clones corrects auront une bande à la taille attendue ainsi qu'un frottis et une échelle de bandes. Pour un exemple du frottis approprié, voir 34,33.
- Cultivez 2 ml de cultures des clones corrects dans des milieux LB O / N à 37 ° C dans un incubateur à agitation.
- Miniprep les plasmides selon les instructions du fabricant.
- Séquence pour vérifier la séquence TALEN avec pCR8_F1 et pCR8_R1. Suivez les méthodes 35 décrites précédemment.
- En utilisant les clones corrects vérifiées par séquençage, mis en place la réaction # 2 (kit TALEN), qui placera les DRV des vecteurs A et B et la DRV finale dans le vecteur de destination.
- Préparer mélange pour la réaction 2 (Tableau 5).
Note: HaLes réactions lf peuvent être utilisés. - Placez les réactions dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min.
- Préparer mélange pour la réaction 2 (Tableau 5).
- Transformer les réactions.
- Transformer 2,5 pi de chaque réaction dans 25 ul chimiquement cellules compétentes.
- Mélanger 2,5 pi de la réaction avec 25 pi de cellules chimiquement compétentes. Incuber sur la glace pendant 5 min. Choc thermique des cellules pendant 30 secondes à 42 ° C.
- Placer les tubes de la glace. Ajouter 125 pi de SOC. Placer les tubes dans un incubateur sous agitation à 37 ° C pendant 1 heure.
- Plaque 100 ul de cellules transformées sur des plaques LB avec l'ampicilline (100 pg / ml), X-gal et IPTG. Cultivez O / N à 37 ° C
- Transformer 2,5 pi de chaque réaction dans 25 ul chimiquement cellules compétentes.
- Choisissez 1-3 colonies blanches pour chaque réaction et vérifier par colonie PCR utilisant des amorces TAL_F1 et TAL_R2 (tableau 2).
- Préparer une solution de la polymerase Mastermix, l'eau et amorcesdécrit dans le tableau 3. Choisissez une colonie et de l' étaler dans le fond d'un tube PCR, puis mettre les restes de la colonie dans 2 ml de LB avec de l' ampicilline (100 pg / ml). Placer 15 ul de la solution dans le tube de la colonie.
- Exécuter le programme de PCR (tableau 6).
- Vérifier la PCR sur un gel d'agarose à 1,5% par électrophorèse. Les clones corrects auront un étalement et une échelle de bandes. Pour un exemple du frottis approprié, voir 34,33.
- Cultivez 2 ml de cultures des clones corrects dans des milieux LB O / N à 37 ° C dans un incubateur à agitation.
- Miniprep les plasmides selon les instructions du fabricant.
- Séquence pour vérifier la séquence TALEN avec TAL_F1 et TAL_R2 suivant les méthodes 35 décrites précédemment.
3. ARNm de transcription de TALENs
- Digest 4 pg de modèle de séquence vérifiée avec 2 pi Sac I pendant 2 heures à 37 ° C. Essai 2 pi du plasmide digéré par Sacl sur un gel d'agarose à 1,5% par électrophorèse. Plasmides qui sont correctement digérées afficheront une seule bande.
- On purifie le reste du plasmide digéré par Sac I suivant le protocole de PCR kit de purification. Laver deux fois avec la solution de lavage avant l'élution. Eluer dans 30 pi d'eau sans nucléase.
- Suivez le protocole standard pour la production T3 ARNm.
- Mettre en place des réactions de la moitié en utilisant 0,5 pg de modèle linéarisé (préparé ci-dessus). Incuber à 37 ° C pendant 2 heures.
- Ajouter 0,5 pi de DNase (inclus dans le kit) et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
- Purifier l'ARNm, en suivant les instructions du fabricant. Eluer dans 30 l'eau sans nucléase ul.
- Exécuter un gel agarose à 1,5% par électrophorèse pour vérifier l'ARNm.
- Nettoyer le dispositif de gel avec un produit pour éliminer la contamination de RNase et de préparer un gel à 1,2%.
- Mix 1 ul ARNm + 4 &# 181; l sans nucléase l'eau + 5 pi glyoxyl colorant de charge. Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 30 min. Centrifuger les tubes brièvement et placer sur la glace avant d'exécuter le gel.
- Vérifier la concentration en utilisant un procédé de quantification des concentrations d'acide nucléique et de stocker l'ARN dans des aliquotes à -80 ° C. Choisir une taille de l'aliquote de telle sorte que l'ARN n'a pas été congelé / décongelé plusieurs fois.
Remarque: Les concentrations de 500-1000 ng / nl sont généralement obtenus. ARN avec une concentration plus faible peut être utilisé aussi longtemps que l'intégrité de l'ARN est maintenue (telle qu'évaluée par une bande plutôt que sur un frottis sur le gel).
4. Inject Astyanax mexicanus Embryons avec TALEN ARNm
- Préparer Outils pour injection.
- Verser des plaques d'injection en versant 1,2% d'agarose dans de l'eau du poisson (eau traitée avec du bicarbonate de sodium et le sel de mer à un pH de 7,4 et une conductivité de 700 uS) dans une boîte de Pétri. Placez un moule (pièce en plastique avec des projections pour faire des puits pour les poissonsoeufs) à l'intérieur du plat. Retirer le moule lorsque la gélose a durci et conserver à 4 ° C. Pour plus de détails sur le moule voir 36.
- Tirez aiguilles pour l'injection à l'aide d'un extracteur d'aiguille selon les directives du fabricant.
Remarque: la longueur de l'aiguille appropriée est important pour les injections. Les aiguilles qui sont trop longues seront trop souples pour les injections. Le protocole pour les aiguilles de traction variera en fonction de l'équipement utilisé pour tirer des aiguilles. Un exemple d'une aiguille appropriée est représenté sur la figure 1. Pour notre équipement, nous nous retirons des aiguilles qui sont 5-6 cm de longueur, et ont un diamètre extérieur à la pointe d'environ 0,011 mm lorsqu'il est cassé. Cependant, les aiguilles doivent être étalonnés (étape 4.3.4) afin de déterminer la largeur d'ouverture. Un exemple de programme pour extraire les aiguilles peuvent être trouvés dans le Tableau 7. - Préparer les pipettes en verre pour le transfert d'embryons par rupture de la pipette, de sorte que l'ouverture est assez grande pour un oeuf de passer à travers. Flamber l'extrémité cassée jusqu'à ceil est plus forte.
Note: Il est important d'utiliser des pipettes en verre et des bols en verre lorsque vous travaillez avec A. oeufs mexicanus et les embryons car ils sont collants et adhèrent au plastique.
- Collecter 1 cellule étape Eggs.
- Race A. mexicanus suivant des protocoles standards 37.
Remarque: Par exemple, si les poissons sont maintenus sur un 14 cycle de lumière: obscurité 10 et en utilisant le temps Zeitgerber (ZT) avec ZT0 comme lumières allumées et ZT14 comme lumières éteintes, notre frai de surface entre ZT15 et ZT19. moment de la ponte exacte doit être déterminée pour chaque laboratoire individuel. - Provoquer frai par suralimenter les poissons pendant 3-4 jours avant l'accouplement et à placer du poisson dans l'eau douce. Augmenter la température de 2 ° C. Note: Notre température initiale de l'eau est d'environ 74 ° F.
- Collecter les œufs de poissons de surface dans l'obscurité, en vérifiant toutes les 15 minutes pour obtenir des œufs au stade 1 cellule. Des centaines d'oeufs peuvent être obtenus à partir d'une seule paire de poissons de surface.
- Collecteœufs dans des bols en verre pour empêcher de coller aux surfaces en plastique et trier pour isoler embryons au stade 1 cellule avant l'injection en observant les œufs sous le microscope et la collecte des œufs qui sont une seule cellule. Gardez les oeufs dans l'eau douce du système (eau du réservoir dans lequel les poissons adultes sont logés, qui a été traité pour le pH et conductivité).
- Race A. mexicanus suivant des protocoles standards 37.
- Injecter TALEN ARNm.
- Injecter des quantités différentes d'ARNm totale (quantités égales de chacun de la paire TALEN) afin de déterminer la concentration optimale pour l'injection comme la toxicité et l'efficacité varient en fonction TALEN paire. Commencer par l'injection de concentrations d'ARNm total qui sont 400-800, p. Diluer et de combiner l'ARNm à des concentrations désirées pour injecter 1,5 nl.
- Charge diluée ARNm dans le dos de l'aiguille et fixez l'aiguille à un micro-injecteur.
- Casser l'aiguille en utilisant une pince.
- Calibrer l'aiguille. Par exemple, éjectez 10 fois et récupérer la baisse résultant en un micro capillaire. 10 x 100 1,0 jetable81; l, 32 mm micro capillaire, la chute doit remplir le micro capillaire à 0,5 mm pour 1,5 / 1 injection nl. Réglez le temps et la pression d'injection au besoin.
- Insérez l'aiguille dans la cellule unique et injecter l'ARNm. Injecter directement l'ARNm dans la cellule, et non pas dans le jaune d'oeuf.
- Recueillir des embryons injectés dans des bols en verre. Gardez embryons à 23-25 ° C. Retirer les embryons morts (embryons qui deviennent trouble et de forme irrégulière) régulièrement pendant les premiers jours suivant l'injection. Un nombre record d'embryons morts et déformés de contrôle (sans injection) et des plaques injectées.
Remarque: la concentration d'ARNm accrue peut conduire à une toxicité accrue et une déformation / mort des embryons. Ainsi, la toxicité par rapport à l'efficacité doit être équilibrée pour déterminer la meilleure concentration de l'ARNm pour l'injection.
5. Phénotype Fondateur poisson et évaluer l'efficacité TALEN
- Sacrifiez embryons selon le protocole d'animaux dans les institutions.
Note: Nous euthanasierembryons par refroidissement rapide sur la glace. - Recueillir des embryons dans 0,8 ul de PCR tubes de bande à l'aide d'une pipette de transfert.
Remarque: Le génotypage peut être effectuée sur des embryons ou des pools d'embryons individuels. - Extraire l'ADN.
- La place des embryons dans 100 ul d'hydroxyde de sodium 50 mM (NaOH) et incuber à 95 ° C pendant 30 min, puis refroidir à 4 ° C.
- Ajouter 1/10 volume (10 ul) de 1 M de Tris-HCl pH 8.
- Effectuer une PCR sur la région en utilisant les amorces conçues à l' étape 1.3 (voir les tableaux 8 et 9 pour les protocoles d'échantillonnage). Pour les embryons individuels 1 pi d'ADN est suffisante pour la réaction PCR.
- Digest produit PCR résultant avec l'enzyme de restriction appropriée et exécuter un gel agarose à 1,5% par électrophorèse.
- Par exemple, pour le génotypage du locus albinisme oculo 2 (OCA2) dans les embryons injectés digérer le produit de PCR en utilisant l'enzyme de restriction Bsr I en ajoutant 0.5 Ul de Bsr I directement à 12,5 pi de la réaction PCR terminée, l' incubation à 65 ° C pendant 2 heures. Exécutez le digérées et le produit digéré sur un gel. Les bandes résistantes à des enzymes de restriction ( par exemple, des bandes qui ne digère pas) indiquent que des mutations induites par TALEN sont présents (figure 2).
- (Facultatif) Calculer le taux de mutation de pourcentage en déterminant le pourcentage de produit non coupé par l' analyse des images de gels à Fidji 38 à l' aide de l'outil d'analyse de gel pour calculer la valeur d'intensité de chaque bande comme décrit précédemment 29.
- Déterminer la séquence des alleles mutants par clonage du TA purifié sur gel, l'enzyme de restriction bande mutant résistant et le séquençage des clones.
- Gel purifier l'enzyme de restriction bande mutant résistant suivant les instructions du fabricant. TA cloner la bande suivant les instructions du fabricant. Prélever des colonies et à croître dans 1,5 ml LB O / N à 37 ° C dans une secousseincubateur.
- les cultures miniprep en suivant les instructions du fabricant. Envoyer l'ADN pour le séquençage.
- L'utilisation d'un programme tel que ApE, aligner les séquences mutantes à la séquence de type sauvage.
- Copiez et collez les deux séquences en fichiers ape. Choisissez l'outil "Aligner deux séquences" dans le menu "Outils".
- Spécifiez les deux séquences d'ADN en utilisant les menus déroulants.
Remarque: le complément inverse de la séquence clonée peut être nécessaire d'utiliser en fonction de la direction dans laquelle la PCR est entré dans le vecteur de clonage. Si les séquences ne sont pas alignés, répétez les étapes cochant la case "Rev-Com" dans la boîte "Aligner l'ADN".
- Évaluer le poisson fondateur de phénotypes au stade approprié et en utilisant des méthodes appropriées pour le phénotype attendu 29 (Par exemple, la figure 3). Les méthodes de phénotypage seront basés sur le phénotype attendu pour le gène ciblé par le chercheur en utilisant le protocol.
6. écran pour la transmission germinale
Remarque: A. mexicanus atteignent leur maturité sexuelle à 4-8 mois.
- Traversez poissons fondateur sexuellement matures type poisson sauvage.
- Embryons d'écran ou les poissons adultes en utilisant des méthodes dans les étapes 5.1-5.7 (Figure 4). Pour les poissons adultes, un morceau de la queue peut être fixé suivant anesthetization.
- Anesthetize poissons en immergeant le poisson dans une solution de tricaïne (ester éthylique de l'acide 3-aminobenzoïque) pour réduire le stress lors de l'écrêtage fin. Après découpage fin, permettent de récupérer le poisson dans l'eau douce. Les poissons se rétablissent rapidement; observer jusqu'à ce qu'ils aient récupéré (nagent normalement).
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Representative Results
Talen paire injections entraînent dans la liaison des DRV à nucléotides d'ADN spécifiques et donc dimérisation des domaines FokI, entraînant des cassures double brin 39 qui peuvent être réparés par l' extrémité non homologue de jonction (NHEJ). NHEJ introduit souvent des erreurs qui se traduisent par des insertions ou délétions (indels). Indels peuvent être identifiés par l'amplification de la région entourant le site cible TALEN et de digérer l'amplicon résultant avec une enzyme de restriction qui coupe à l'intérieur de la région d'espacement TALEN. Allèles sans un indel vont digérer tout allèles contenant indels qui changent la séquence cible d'enzyme de restriction ne sera pas digérer, produisant une bande résistant à l' enzyme de restriction (Figure 2).
Injections Talen peuvent probablement entraîner des mutations génétiques bialléliques dans A. mexicanus 29. Ainsi, certains phénotypes peuvent être évalués dans le poisson fondateur. Pour par exemple, nous avons évalué la pigmentation chez les poissons de surface injecté TALENs OCA2 ciblant le gène supposé être responsable de l' albinisme dans plusieurs populations albinos de cavefish 1,28. Nous avons trouvé des taches albinos dans OCA2 poissons TALEN-injecté pas présent dans le poisson non injecté 29 (Figure 3).
Pendant de nombreuses expériences, il est souhaitable de disposer de lignées mutantes de poisson pour l'évaluation de phénotypes. Poisson Fondateur avec des allèles mutants transmis peut être identifié par génotypage descendance de croisements de poissons fondateur de poissons de type sauvage (figure 4).
Figure 1. Aiguille d'injection d' ARNm. Photographie d'une micropipette avant d'être brisé utilisé pour injecter TALEN ARNm dans des embryons unicellulaires._upload / 54113 / 54113fig1large.jpg "target =" _ blank »> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. TALEN efficacité pour OCA2. 306 pb produit par PCR de l' exon 9 de OCA2 dans Astyanax mexicanus ont été examinés pour la perte du site d'enzyme de restriction lorsque des quantités différentes d'ARNm ont été injectés TALEN 29. L'amplicon à partir d'un embryon témoin a été digéré pendant une partie de l'amplicon est résistante à la restriction de digestion dans les pools de 10 TALEN embryons injectés. Restriction enzyme digérer les bandes résistantes à partir d' embryons injectés avec TALEN ARNm ciblé ont été montré OCA2 pour contenir indels 29. Notez que des concentrations croissantes de l'ARNm injecté entraîne une augmentation de l'efficacité TALEN (ADN plus digérées). Lanes avec "-" sont digérées, les voies avec "+" sont Digested enzyme de restriction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. phénotypage poisson fondateur des changements de pigmentation. (A) Contrôle de surface non injectée A. mexicanus. (B) Patch manque mélanophores dans un poisson de surface fondateur injecté avec 400 pg TALEN ARNm ciblant OCA2 (flèche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. germinale transmission de mutatio TALEN induitens. Les produits de PCR de 306 pb de l' exon 9 de OCA2 dans A. mexicanus ont été examinés pour la perte du site d'enzyme de restriction dans les piscines de 10 F 1 poisson à partir d' un poisson fondateur injecté. L'amplicon à partir d' un embryon témoin a été digéré pendant une partie de l'amplicon est résistante à la restriction de digestion dans les pools de 10 F 1 embryons. Restriction digestion enzymatique des bandes résistantes de F OCA2 ont été présentées 1 s pour contenir indels 29. Lanes avec «-» sont digérées, les voies avec "+" sont digérés par l' enzyme de restriction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Une réaction | Reactisur B | |||
| montant | réactif | montant | réactif | |
| 4 ul | eau | 10 ul | eau | |
| 1 ul | pFUS_A | 1 ul | pFUS_B4 | |
| 1 ul | Bsal | 1 ul | Bsal | |
| 1 ul | BSA | 1 ul | BSA | |
| 1 ul | Ligase | 1 ul | Ligase | |
| 2 ul | tampon 10x Ligase | 1 ul | tampon 10x Ligase | |
| 1 ul | pNH1 | 1 ul | pNG1 | |
| 1 ul | pNH2 | 1 ul | PhD2 | |
| 1 ul | pNG3 | 1 ul | pNH3 | |
| 1 ul | pHD4 | 1 ul | pNI4 | |
| 1 ul | pHD5 | |||
| 1 ul | PHD6 | |||
| 1 ul | pNG7 | |||
| 1 ul | pHD8 | |||
| 1 ul | pNG9 | |||
| 1 ul | pHD10 | |||
Tableau 1. Exemple ensemble de réaction A et B pour unTALEN contenant DRV NH-NH-NG-HD-HD-HD-NG-HD-NG-HD-NG-HD-NH-NI-NG.
| nom primaire | séquence (5'-3 ') |
| pCR8_F1 | ttgatgcctggcagttccct |
| pCR8_R1 | cgaaccgaacaggcttatgt |
| TAL_F1 | ttggcgtcggcaaacagtgg |
| TAL_R2 | ggcgacgaggtggtcgttgg |
Tableau 2. amorces de PCR pour la colonie PCR, à partir de 34.
| réactif | montant |
| Mastermix Taq, 2x | 50 ul |
| pCR8_F1 primaire,10 uM | 4 ul |
| pCR8_R1 primaire, 10 uM | 4 ul |
| l'eau exempte de nucléase | 42 pi |
| * Ajuster master mix si un taq différent est utilisé | |
Tableau 3. mélange maître pour 100 pi (15 pi / réaction) pour la colonie PCR 1.
| étape | température (° C) | temps (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 105 |
| 5 | Passez à l'étape 2 pour 30 cycles | |
| 6 | 72 | 300 |
Tableau 4. Programme PCR pour une PCR sur colonie 1.
| montant | réactif | la concentration |
| 12 pi | eau | |
| 1 ul | vecteur A | 100 ng / pl |
| 1 ul | vecteur B | 100 ng / pl |
| 1 ul | vecteur de destination pT3Ts-gT | 50 ng / ul |
| 1 ul | RVD final (PLr-DRV) | 100 ng / pl |
| 1 ul | Esp3I | |
| 1 ul | ligase | |
| 2 ul | tampon 10x Ligase | |
Tableau 5. Protocole pour la seconde réaction d'assemblage.
| étape | température (° C) | temps (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 55 | 30 |
| 4 | 72 | 180 |
| 5 | Passez à l'étape 2 pour 30 cycles | |
| 6 | 72 | 300 |
Tableau 6. Programme PCRpour la PCR sur colonie 2.
| chaleur | 290 |
| tirer | 150 |
| rapidité | 100 |
| temps | 150 |
| Ces paramètres sont pour une Flaming / Brown Micropipette Extracteur Modèle P-97 à l'aide d'un filament d'auge | |
Tableau 7. aiguille échantillon programme de traction.
| réactif | montant |
| Mastermix Taq, 2x | 12,5 pi |
| gène amorce avant spécifique, 10 uM | 1 μl |
| gène amorce inverse spécifique, 10 pM | 1 ul |
| l'eau exempte de nucléase | 9,5 pi |
| ADN | 1 ul |
| * Ajuster master mix si un taq différent est utilisé | |
Tableau 8. Protocole d'échantillons pour la PCR spécifique du gène.
| étape | température (° C) | temps (sec) |
| 1 | 95 | 120 |
| 2 | 95 | 30 |
| 3 | 56 | 30 |
| 4 | 72 | 60 |
| 5 | Aller à Step 2 pour 35 cycles | |
| 6 | 72 | 300 |
| * Ajuster la température de recuit et le temps d'extension pour des amorces spécifiques et la taille du produit PCR | ||
Tableau programme de PCR 9. Exemple de PCR spécifique du gène.
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Discussion
De grands progrès ont été réalisés ces dernières années dans la compréhension de la base génétique de l'évolution des traits. Alors que les gènes candidats qui sous - tendent l'évolution d'un certain nombre de traits ont été identifiés, il est resté difficile de tester ces gènes in vivo en raison de l'absence de traçabilité génétique des espèces les plus intéressantes évolutionnaire. Nous rapportons ici une méthode pour l' édition du génome dans A. mexicanus, une espèce utilisée pour étudier l'évolution des animaux des cavernes. Étudie cartographie génétique 1,21,23 et gène candidat approches 19,40 ont identifié un certain nombre de gènes candidats pour l'évolution des traits en forme de grotte A. mexicanus. La publication récente du génome de cavefish 41 fournit un outil supplémentaire puissant pour identifier les gènes candidats pour l'évolution des traits des cavernes. Tester la fonction d'un grand nombre de ces gènes candidats nécessite des techniques pour réduire l'expression génique. La seule option actuelle pour l'étudement l' expression génique réduite A. mexicanus est par l'utilisation de morpholinos. Cependant, knockdown du gène morpholino est transitoire, limitée à un après la fécondation de quelques jours, et ne sont pas utiles pour l' étude des traits chez les animaux adultes, comme les différences de comportement entre la grotte des adultes et des poissons de surface comme la scolarisation 17, hyperphagie 19 et vibrations attraction comportement 42. Génération de perte d'allèles de la fonction des gènes, tels que ceux qui peuvent être faites en utilisant TALENs, sera cruciale pour tester le rôle des gènes candidats pour ces traits.
Des méthodes ont été développées pour faciliter l' assemblage de paires Talen 33 et le protocole détaillé pour cette méthode est disponible 34. Ce protocole a été optimisé pour être utilisé par le poisson - zèbre Bedell et al. , 7, en utilisant un vecteur de destination finale différente, pT3Ts-goldyTALEN (pT3TS-GT). Ce vecteur permet la transcription de l'ARNm TALEN pour injection dans un seul embryons de poisson zèbre unicellulaires.Nous avons utilisé cette méthode d'assemblage modifiée, expliqué en détail ici, pour assembler et transcrire TALENs pour injection dans A. mexicanus. Nous avons constaté que lorsqu'il est injecté dans la surface unicellulaire A. embryons mexicanus, tel que décrit dans ce protocole, nous avons pu muter A. gènes mexicanus 29. Pour les recherches futures sur les gènes candidats ne sont pas décrites dans ce protocole, les séquences peuvent être trouvés dans le génome cavefish 41 et utilisés pour identifier des sites cibles Talen.
Critical pour les injections réussies est de haute qualité TALEN ARNm. Ainsi, la vérification de la qualité de l'ARN en exécutant une petite quantité d'ARN sur un gel avant l'injection est importante (étape 3.6). Autres précautions d'intégrité de l'ARN maintien, comme le gel des aliquotes pour éviter les dégels de gel (étape 3.7), et de maintenir des conditions stériles en utilisant des tubes et des conseils eau propre et RNAse-libres lors des injections (étape 4), doivent être prises. Une étape supplémentaire essentielle à l'élevage de poissons est injecténettoyer les embryons morts après l'injection, comme des embryons morts peuvent rapidement affecter la qualité de l'eau. Ainsi, nous enlevons des embryons morts le lendemain matin injections, et périodiquement pour les prochains jours après les injections de maintenir les embryons vivants sains (Step 4.3.6).
TALEN mutagenèse in Astyanax mexicanus peut être très efficace; Cependant, l' efficacité varie en fonction de la paire TALEN injecté 29. Les concentrations d'ARNm accrues peuvent conduire à une toxicité accrue et la difformité et la mort des embryons injectés. Ainsi, la toxicité par rapport à l'efficacité doit être testé et équilibré afin de déterminer la concentration optimale de l'ARNm à injecter. Pour paires Talen très efficaces, les phénotypes peuvent être évalués dans le poisson fondateur injecté. Par exemple, l' injection de TALENs OCA2 ciblage a donné lieu à des taches albinos dans les poissons de surface 29 (figure 3). Pour d'autres traits ou les gènes, cependant, l'évaluation des phénotypes dans le poisson fondateur peut être difficile en raisonsubtilement du phénotype ou la faible efficacité de la paire TALEN injectée. Ainsi, pour de nombreuses applications, il sera souhaitable de générer des mutations de la lignée germinale dans un gène d'intérêt pour l'analyse du rôle du gène candidat à un animal non-mosaïque. Obtenir la transmission germinale des mutations TALEN induites par A. mexicanus est possible 29 (figure 4). Par conséquent, cette technique peut être appliquée pour évaluer d'autres gènes candidats.
Quelques limites aux manipulations génétiques dans Astyanax mexicanus existent à ce moment. Surface et race cavefish dans l'obscurité, tard dans la nuit. Dans un laboratoire où il est impossible d'inverser le cycle lumière-obscurité, les chercheurs doivent venir à la fin de la nuit pour effectuer des injections, car il est essentiel d'injecter immédiatement après la ponte. En outre, il est important de recueillir des embryons de poissons de surface dans l'obscurité, sous forme de lumière aura une incidence sur la reproduction.
D'autres techniques, en particular le système / Cas CRISPR (revue dans 43), existent pour l' édition du génome et sera probablement applicable à A. mexicanus. En effet, les protocoles pour le guide d'assemblage d' ARN existent qui sont rapides et faciles 44 et le protocole rapporté ici peut être modifié pour CRISPR injection / Cas. En outre, de nouvelles applications pour l' édition du génome se développent rapidement, et beaucoup d' entre eux peuvent se révéler utiles pour A. chercheurs mexicanus. Par exemple, des mutations précises de poisson zèbre ont été faites dans un gène d'intérêt par co - injection TALENs avec un seul oligo brin contenant une mutation 7. Cette technique pourrait être utile pour évaluer le rôle des allèles des cavernes dans la génération de phénotypes des cavernes, tels que le rôle d'une mutation faux - sens dans certains allèles rupestres de MC4R des différences dans le métabolisme observées entre cavefish et la surface du poisson 19. TALENs ont également été utilisés pour générer des alleles de gènes par recombinaison homologue qui expriment des marqueurs fluorescents in motifs semblables à des locus endogènes 45. Ces procédés peuvent être utilisés dans A. mexicanus pour évaluer les sous - ensembles de cellules ou de l' expression des gènes candidats. Le système / Cas CRISPR a été utilisé dans zebrafish pour obtenir tissu-spécifique gène knockout 46. Ces techniques appliquées à A. mexicanus, pourrait être utile pour évaluer la base génétique des processus tels que la perte de l' oeil dans cavefish. La lentille joue un rôle essentiel dans le processus de perte de l' oeil dans cavefish 47 et le CRISPR système / Cas spécifique du tissu peut être utilisée pour évaluer le rôle des gènes candidats pour la perte de l' oeil plus précisément dans la lentille par rapport aux autres tissus de l'oeil. Ceux - ci et d' autres techniques de modification des génomes peuvent être utilisés dans A. mexicanus dans les études futures de répondre aux questions critiques au sujet de l'évolution des traits de la grotte.
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Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Département de génétique, de développement et de biologie cellulaire et de l'Iowa State University et par NIH EY024941 (WJ) .Dr. Jeffrey Essner a fourni des commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Thermocycler | |||
| Injection station | |||
| Gel apparatus | |||
| Needle puller | |||
| Nanodrop | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated | |||
| Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated) | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 in 50% EtOH | Teknova (ordered through Fisher) | 50-843-314 | |
| Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin (1,000x solution) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERR0941 | |
| IPTG, Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-812-203 | Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| BSA | New England Biolabs | provided with restriction enzymes | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (ordered through Fisher) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (ordered through Fisher) | PRM7123 | Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly |
| Quick ligation kit | New England Biolabs (ordered through Fisher) | 50-811-728 | We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Invitrogen | C4040-06 | Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher) | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase | Epicentre (Ordered through Fisher) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol) |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (Ordered through Fisher) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit | Ambion | AM1348M | |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly Sample Loading Dye | Ambion (ordered through Fisher) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (ordered through Fisher) | 04-355-32 | |
| Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-6B | |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Eppendorf (ordered through Fisher) | E5242956003 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 |
References
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