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Chemistry

Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

Introduction

Negli ultimi dieci anni, la comprensione strutturale dei canali ionici ligando-dipendenti pentamerica (pLGIC) è cresciuto in salti e limiti, a causa di una moltitudine di strutture ad alta risoluzione di diversi membri della famiglia. I fattori chiave che hanno portato ai progressi in corso nel settore includono, la scoperta dei canali pLGIC procariote, 1-3 grandi progressi nella espressione della proteina di membrana eucariotica, 4-6 e enormi progressi negli approcci determinazione della struttura. 7 Queste strutture forniscono un chiaro consenso su la conservazione complessiva dell'architettura tridimensionale pLGIC. Tuttavia, due aree principali che sembrano scia dietro sono la caratterizzazione funzionale di questi preparati canale e la descrizione meccanicistica della funzione del canale.

Gating cambiamenti conformazionali sono complessi e si verificano su una distanza di 60 Å lungo la lunghezza del canale e queste transizioni sono ampiamente modulati dalipidi di membrana. In particolare, è stato dimostrato lipidi negativi, colesterolo e fosfolipidi di modulare la funzione di pLGIC 8-11. Mentre il ruolo preciso di questi costituenti lipidici in funzione del canale rimane sconosciuta, una comprensione molecolare completa di gating richiederebbe lo studio di questi canali nel loro ambiente nativo. spettroscopia sito-Spin Labeling (SDSL) e Risonanza paramagnetica elettronica (EPR) sono le tecniche di scelta per studiare la dinamica delle proteine ​​nei sistemi ricostituiti. spettroscopia EPR non è limitata dalla dimensione molecolare (come è NMR) o la proprietà ottica del campione (come è spettroscopia di fluorescenza), e permette quindi misure di costrutti integrali ricostituiti in condizioni native lipidici. La tecnica è estremamente sensibile ed ha requisiti relativamente basse campione (nell'intervallo pico-mole). Entrambi questi aspetti rendono la tecnica adatta per studiare proteine ​​di membrana di grandi dimensioni che sono difficili da esprimere in oltre milligrammile quantità.

L'uso della spettroscopia EPR in combinazione con il sito-diretta etichettatura rotazione è stato sviluppato da Wayne Hubbell e colleghi, ed è stato adattato per studiare una gamma di tipi di proteine. 12-24 dati EPR sono stati utilizzati per indagare strutture secondarie, cambiamenti nella proteina conformazione, profondità di membrana di inserimento, e proteina-proteina / interazioni proteina-ligando.

Il metodo prevede la sostituzione cisteina nelle posizioni di interesse mediante mutagenesi sito-diretta. Per garantire un'etichettatura sito-specifica, è necessario sostituire cisteine ​​nativi con un altro aminoacido (ad es., Serina) per creare un modello cisteina-less. Di gran lunga, l'etichetta di spin più popolare è un MTSL specifica-tiolo: (1-oxyl-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) methanethiosulfonate che si attacca alla proteina attraverso un ponte legame disolfuro. Grazie alla sua elevata specificità, relativamente piccole dimensioni (leggermente più grande di triptofano), e flexibilità della regione linker, questa etichetta centrifuga ha dimostrato di avere un'ottima reattività anche con una cisteina sepolta. Inoltre, per massimizzare la reattività, la reazione di marcatura della proteina è effettuata sotto forma detergente solubilizzata. Dopo la separazione dell'eccesso libera spin-label per dimensione cromatografia di esclusione, la proteina viene ricostituito in liposomi o sistemi doppio strato-mimando di composizione lipidica definito. In generale, cisteina mutagenesi è ben tollerato nella maggior parte della proteina, e le dimensioni relativamente ridotte dello spin-sonda porta perturbazione minimo per le strutture secondarie e terziarie. Per garantire che la modifica mantenuto funzioni wild type, i canali etichettati e ricostituiti possono essere studiate mediante misurazioni patch-clamp.

La proteina marcata-funzionale è quindi sottoposto a misure spettroscopiche, che forniscono essenzialmente tre tipi principali di informazioni: 12,14,15,20,22,23,25-27 dinamiche spin-sonda lineshanalisi ape; l'accessibilità della sonda ad agenti paramagnetici di rilassamento; e la distanza di distribuzione. 27 distanze EPR sono misurate da due approcci diversi. Il primo si basa sulla tecnica Continuous Wave (CW), dove spettrale allargamento derivanti da interazioni dipolari tra spin-etichette (in 8 - un intervallo di distanze 20). Viene utilizzato per determinare la distanza 28,29 Il secondo è un pulsato EPR metodo in cui le misure di distanza può essere estesa fino a 70 Å. 30-34 in doppio Electron Electron Resonance (cervo), le oscillazioni di ampiezza spin-echo vengono analizzati per determinare le distanze e le distribuzioni di distanza. Qui l'eco di spin è modulato alla frequenza dell'interazione dipolare. Insieme, questi parametri vengono utilizzati per determinare la topologia di proteine, elementi strutturali secondari, e le modifiche delle proteine-conformazionale.

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Protocol

1. mutagenesi sito-diretta e cisteina Mutazioni

  1. Clonazione e mutagenesi
    NOTA: GLIC wild type (wt) 35 ha una cisteina singolo nativo (C27), che è mutato in serina per creare uno sfondo cisteina-less. Mutazioni cisteina vengono introdotti sullo sfondo cisteina-less per mutagenesi sito-diretta utilizzando primer che portano un codone di cisteina nella posizione desiderata 36.
    1. Mescolare 5 ml di tampone 10x reazione, 1 ml di 100 ng / ml cisteina-meno GLIC modello di DNA 35, 0,5 ml ciascuna di 40 micron in avanti e all'indietro innesco 36, 1 ml di dNTP (100 mm), e 41 ml di acqua deionizzata . Pipettare il campione di un paio di volte per mescolare accuratamente, rotazione (6.000 giri) e, infine, aggiungere 1 ml di DNA polimerasi.
    2. Impostare la termo-cycler il seguente protocollo:
      1. Denaturazione a 95 ° C per 4 min.
      2. Denaturazione a 95 ° C per 30 sec.
      3. temprareing a 55 ° C per 1 min.
      4. Allungamento a 68 ° C per 10 minuti (circa 1 min per KB Lunghezza plasmide).
      5. Ripetere i punti 1.1.2.2 - 1.1.2.4 per 18 cicli.
      6. Un allungamento finale a 68 ° C per 10 min.
      7. Tenendo temperatura a 4 ° C
        NOTA: la temperatura di ricottura è calcolato in base al fondo Tm.
    3. Aggiungere 1 ml di DpnI alla miscela di reazione, mescolare accuratamente pipettando e spin down (6.000 rpm) per 1 min. Incubare per 2 ore a 37 ° C.
  2. Trasformazione
    1. Scongelare E. cellule competenti coli su ghiaccio. Aliquota 30 ml di cellule in una provetta 14 ml trasformazione sterile e aggiungere 1 ml di DNA digerito alle cellule. Mescolare picchiettando sul lato del tubo. Incubare per 20 min in ghiaccio.
    2. Porre il tubo in un bagno d'acqua 42 ° C per 45 secondi e poi rimetterlo in ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 400 microlitri mezzi SOC sterile e agitare le cellule in un incuBator a 37 ° C per 1 ora.
    3. Piastra 100 ml di cellule su piastre LB contenenti kanamicina (50 micron) e 1% di glucosio. Incubare le piastre O / N a 37 ° C.
    4. Raccogliere una singola colonia dalla piastra e inoculare in 5 ml di O / N colture contenenti LB media / kanamicina. Incubare la cultura O / N (~ 16 ore) a 37 ° C in un agitatore incubatore.
    5. Estrarre il DNA dalla cultura O / N da minipreparation 37. Quantificare la resa di DNA utilizzando uno spettrofotometro misurando l'assorbanza a 260 nm di lunghezza d'onda. La concentrazione deve essere ~ 100-200 ng / ml. Confermare la presenza di mutazioni da ricombinanti strategie di sequenziamento del DNA standard di 38,39.

2. Espressione GLIC e purificazione

  1. Trasformazione
    1. Seguendo i passaggi descritti nella sezione 1.2, trasformare 30 microlitri di cellule competenti C43 con 1 ml (~ 100-200 ng / ml) del plasmide che contiene il gene che codifica per GLIC insieme a un sito di taglio Rhinovirus umano (HRV) -3C proteasi (Per la sequenza plasmide e Gene, fare riferimento al testo supplementare) 35 (dal punto 1.2.5).
    2. Piastra 100 ml di cellule su piastre LB-agar contenenti 1% di glucosio e 50 mg / ml kanamicina, e li O / N (~ 16 ore) incubare a 37 ° C in un incubatore.
    3. Controllare visivamente per le colonie e garantire che non siano eccessivamente coltivati ​​o mostrano la presenza di colonie satellitari. Prontamente sigillare le piastre con parafilm e conservarli a 4 ° C.
  2. Impostazione O / N-culture e la preparazione di terreni di crescita
    1. Scegli una singola colonia isolata utilizzando cappio inoculando e trasferire in un pallone da 100 ml sterile contenente 20 ml di Luria Broth (LB) supporti integrati con sterile glucosio 1% e 50 ug / ml kanamicina. incubare O / N (~ 16 ore) a 37 ° C in un agitatore a 250 rpm.
    2. Autoclave 900 ml Terrific Broth (TB) di supporto (Vedi Media e Composizione buffer) a 2.8boccette di vetro L Fernbach per la coltura batterica in ciclo a vapore a 121 ° C per 20 min.
  3. Impostazione di grandi culture di crescita
    1. Aggiungere 100 ml di tampone fosfato di potassio sterile (Vedi Media e Composizione Buffer) ai media TB in autoclave. Aggiungere il glucosio sterile (0,2% concentrazione finale), kanamicina (50 mg / ml), e 10 ml di / cultura O N. Incubare a 37 ° C in un agitatore a 250 rpm.
    2. Controllare la densità ottica alla lunghezza d'onda di 600 nm (OD 600) mediante densitometro o uno spettrofotometro ogni ora fino a raggiungere 0,5 (~ 2 ore). A questo punto ridurre la velocità a 150 rpm e abbassare la temperatura a 18 ° C. Monitorare la OD 600 ogni 30 minuti fino a raggiungere 0,8 (~ 1 ora).
    3. Aggiungere 50 ml di glicerolo e continuare scuotendo la cultura fino a quando la OD 600 raggiunge 1,0-1,2 (~ 15 - 30 min).
      NOTA: In queste condizioni, ci vuole circa un'ora per la cultura di raggiungere 18 ° C da 37 ° C. E 'important che glicerolo viene aggiunto alla coltura dopo che si è raffreddato a 18 ° C.
    4. Indurre le cellule con 200 micron IPTG (isopropil-tio-β-galattoside) e ripristinare lo shaker torna a 250 rpm e incubare ulteriormente per ~ 16 ore a 18 ° C.
  4. purificazione delle proteine
    1. Assicurarsi che la OD 600 al termine di 16 ore è ~ 16 - 18. raccogliere le cellule in bottiglia centrifuga 1,0 L di filatura a 8.500 xg, 4,0 ° C per 15 min. Decantare il surnatante e pesare la bottiglia con il pellet di cellule. Calcolare il peso del pellet sottraendo peso della bottiglia vuota dal peso totale.
      NOTA: Il peso pellet cellulare è previsto ~ 30 - 35 g / L. Anche se, è da notare che ci può essere variabilità in finale OD 600 e pellet cellulare peso sulla mutanti.
    2. Risospendere il pellet batterico in 150 ml di ghiacciata tampone A (100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4) per 1,0 L di coltura. Aggiungere DNasi I (100 mg / ml) e protease inibitori (fenilmetilico solfonil fluoruro (1 mM), leupeptina (2,0 mcg / ml), aprotinina (2,0 mcg / ml), e pepstatina A (1 mg / ml)).
    3. Omogeneizzare le cellule facendoli passare attraverso un disgregatore cella in una camera fredda 4.0 ° C. Ripetere il processo per tre volte in modo che la maggior parte dei batteri viene lisato. Centrifugare le cellule a 14.000 xg per 15 min e pipetta il surnatante out e trasferire in una provetta da centrifuga pulita. Eliminare il pellet, che contiene le cellule non-lisati e corpi di inclusione.
    4. Centrifugare il surnatante a 168,000 xg per 1 ora. decantare con cautela il surnatante senza disturbare il pellet membrana.
    5. Piscina Il pellet di membrana da 1 L di cultura e risospendere in tampone A (supplementato con 10% glicerolo) ad un volume finale di 50 ml. Aggiungere 0,5 g di n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) alla sospensione di membrana e nutate per 2 ore a 4,0 ° C.
    6. Dopo solubilizzazione membrana, rimuovere detriti cellulari dal lisato da Centrifugzione a 168.000 xg per 1 ora. Nel frattempo preparare resine amilosio. Trasferimento 3 ml di resina con una pipetta in una colonna in polipropilene cromatografia vuoto. Lavare la resina passando 10 il volume del letto di acqua 3 volte e poi con 10 volumi di letto di tampone A contenente 0,5 mM DDM.
    7. Dopo la centrifugazione, prendere delicatamente il surnatante utilizzando una pipetta e trasferire in un tubo da 50 ml pulito. Per batch saggio di legame, aggiungere resina pre-equilibrata amilosio al tubo conico. Associare la proteina estratta alla resina amilosio dal oscillante la miscela per 2 ore a 4.0 ° C.
    8. Passare l'intera sospensione attraverso una colonna cromatografica e raccogliere il flow-through. Poi passare l'intero flusso passante raccolti sopra la resina una seconda volta per massimizzare vincolante.
    9. Passare 10 volumi di letto di tampone A con 0,5 mM DDM, 0,5 mM tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) e 1 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per rimuovere le proteine ​​non legate.
    10. Eluire la proteina GLIC con 10 ml di Buffer A contenente 40 mM maltosio in aggiunta a 0,5 mM DDM e 0,05 mM TCEP. TCEP previene l'ossidazione della cisteina catene laterali. Raccogliere l'intera eluire.
    11. Concentrare la proteina eluita usando concentratore centrifugo (Molecular Weight Cut-off = 50 kDa) a 4-6 mg / ml e aggiungere HRV-3C proteasi (200 mg per 10 mg di proteina) e incubare O / N a 4,0 ° C.
      NOTA: Accertare il completamento della proteasi digestione eseguendo i campioni su gel SDS PAGE (vedi punto 2.5.5 e Figura 1).
  5. Sito-Spin-etichettatura
    1. Fare circa 100 ml di 200 mm magazzino di (1-oxyl-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) MTSL 40 in DMSO e conservare lo stock a -20 ° C in 25 microlitri aliquote.
    2. Utilizzare l'esempio proteasi digerito per spin-etichettatura con MTSL. Aggiungere 10 volte molare eccesso di MTSL spin-label (GLIC monomero: MTSL in rapporto 1:10 molare). Incubare in ghiaccio per 1 ora. Aggiungere un secondo colpo di etichetta rotazione a 5 volte in eccesso molareRapporto e incubare per un'altra ora.
      NOTA: Per le posizioni interrate (con bassa efficienza di etichettatura di spin, descritte qui di seguito), si aggiunge a 30 volte eccesso molare di etichette di spin e la proteina viene incubato per 6 ore.
    3. Passare il campione attraverso una colonna di dimensioni esclusione veloce Protein cromatografia liquida (FPLC) che è pre-equilibrata con tampone A e 0,5 mM DDM per separare il spaccati MBP e l'eccesso libera spin-label da pentamers GLIC. Raccogliere 1 ml frazioni per un totale di 30 ml di eluizione. Pool frazioni contenenti GLIC pentamers (Figura 1). Seguire le istruzioni del produttore per eseguire l'FPLC.
    4. Determinare la concentrazione del campione utilizzando uno spettrofotometro misurando l'assorbanza a 280 nm di lunghezza d'onda. Coefficiente di estinzione molare ed il peso molecolare stimato di GLIC monomero sono 49.850 M -1 cm -1 e 36.380 Da, rispettivamente. Concentrare la soluzione proteica utilizzando un concentratore centrifugo (MolecularPeso Cut-off = 50 kDa) ad una concentrazione finale di ~ 8-10 mg / ml e posizionarlo sul ghiaccio. Il campione è ora pronto per la ricostituzione.
    5. Come controllo ulteriore qualità per garantire che la preparazione è biochimicamente omogeneo, eseguire una (β-ME 1,0%) gel SDS-PAGE riducente.
      NOTA: Il gel colorato commassie dovrebbe mostrare una singola banda a ~ 33 kDa corrisponde al monomero GLIC (Figura 1).
    6. Per i mutanti di spin-etichettato sospettati di esporre ampliamento dipolare, sotto-etichettare i campioni in presenza di etichette diamagnetica 41. Incubare la-proteina eluita con 0,1 volte MTSL e incubare in ghiaccio per 1.0 ore. In seguito, aggiungere 20 volte molare eccesso di etichetta diamagnetico (1-acetossi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) metano thiosulfonate.
      NOTA: Il reagente diamagnetica usato qui è iso-sterico all'etichetta paramagnetica con una etichettatura chimica identica.
    7. Incubare il campione in ghiaccio per 2 ore. Passare il campione attraverso un Sizcromatografia su colonna e di esclusione che è pre-equilibrata con tampone A e 0,5 mM DDM come al punto 2.5.3.
  6. L'efficienza di etichettatura di spin
    1. efficienza Spin-etichettatura è definito come il rapporto tra la concentrazione di spin-label alla concentrazione di cisteina catena laterale (GLIC-monomero). Per determinare l'efficienza di spin-etichettatura del campione, l'intensità integrata del campione viene confrontato con uno standard di concentrazione nota usando un diagramma di taratura. Effettuare soluzioni di uno standard EPR (come 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinyloxyl: TEMPO) in un intervallo di concentrazioni periodo (10 - 250 micron) sciogliendo in acqua.
    2. Misurare il segnale EPR per ciascuna di queste soluzioni e determinare l'area sotto la curva (doppia integrazione del segnale EPR) per ciascuna concentrazione (come descritto nei passi 6.1). Generare una curva di taratura riportando l'area misurata in funzione della concentrazione TEMPO e sagomata con una linea retta.
      NOTA: Il sonoun sotto un segnale EPR derivato è una migliore descrizione dell'intensità spettrale rispetto al picco di ampiezza di picco. Integrando il primo derivato segnale EPR darà lo spettro di assorbimento, una seconda integrazione darà poi l'area sotto la spettro di assorbimento (che è proporzionale alla concentrazione di spin). Assicurare una base costante sia nel basso campo e region campo dello spettro.
    3. Misurare la concentrazione della proteina spin-etichettato nel detergente utilizzando uno spettrofotometro (come nel passaggio 2.5.4). Ora misurare il segnale EPR del campione e quindi determinare l'area della doppia integrale del segnale EPR seguente procedura nella sezione 6.1. Utilizzando il diagramma di taratura, determinare la concentrazione dell'etichetta che corrisponde al segnale EPR misurata. Calcolare l'efficienza etichettatura centrifuga come rapporto molare di spin label e concentrazione proteica.

3. GLIC Ricostituzione in Asolectin Membrane

  1. Risciacquare una pulita 25 ml pallone a fondo tondo con 5 ml di cloroformio e asciugare il pallone in un flusso di N 2 gas nella cappa. Trasferire 10 mg di asolectin (soia polare estratto di 25 mg / ml azionari in cloroformio) nel pallone e asciugare i lipidi in un flusso continuo di N 2 gas.
    NOTA: La scelta di lipidi per la ricostituzione si basa sui risultati di esperimenti nella sezione 4.
  2. Quando il cloroformio è evaporato, il recipiente sotto vuoto per 1 ora per assicurare la completa essiccazione. Aggiungere 1 ml di ricostituzione tampone A al lipidi secca e vortice del pallone con forza per ottenere il pellet di lipidi in sospensione.
  3. Per preparare piccole vescicole unilamellari, sonicare la sospensione lipidica in un bagno sonicatore fredda finché la soluzione vescicola diventa più o meno trasparenti e non si osservano grumi (circa il 10 - 15 min). A questa miscela, aggiungere DDM ad una concentrazione finale di 4 mM e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
<li> Ricostituzione
  1. Aggiungere la proteina purificata dal punto 2.5.4 alla miscela lipidica.
    NOTA: Il rapporto proteine-to-lipidico dipende dal tipo di esperimento. Per le misure di corrente macroscopici, un 1: viene utilizzato il rapporto 10.000. Per gli studi di EPR, ricostituzione avviene ad una maggiore proteina rapporto lipidi (1: 2.500) per massimizzare il segnale. Si precedentemente dimostrato che a queste concentrazioni, nessuna aggregazione laterale è osservato 42.
    NOTA: quantità di lavoro tipico di GLIC per EPR è ~ 1 mg, anche se in base alla posizione sondato, importi inferiori avrebbe funzionato pure.
  2. Incubare il campione a 4 ° C per 1 ora con rotazione dolce Poi diluire a 15 ml con tampone A.
    NOTA: Questo passaggio porta la concentrazione di detersivo al di sotto della concentrazione micellare critica (CMC).
  3. Rimuovere il detergente residua nella sospensione con l'aggiunta di perle di polistirene (con pori idrofobi che intrappolano detergenti). Aggiungere 80 mg di pulire le perle e incubare le liposome O sospensione / N su un nutator a 4 ° C.
    1. Per preparare le perline per l'uso, pesare ~ 100 mg e trasferirli in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 10 ml di metanolo, agitare vigorosamente, centrifugare le perline a 8000 xg per 2 minuti, e decantare il metanolo. Ripetere questo processo di metanolo lavare tre volte. Ripetere lo stesso processo con 30 ml di acqua deionizzata, lavaggio tre volte.
  4. Il giorno successivo, trasferire il liposoma ad un tubo ultracentrifuga 25 ml usando un filtro di colonna per rimuovere le perline e diluire ulteriormente il campione a 25 ml. Centrifugare i campioni a 168.000 xg per 2 ore. Decantare il surnatante e risospendere il pellet con 100 ml di tampone B.

4. Determinare ottimale dei lipidi Composizione per la ricostituzione per FRET

  1. Utilizzare un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) analisi basata su di determinare la composizione della membrana che mantiene la proteina monodisperse.
  2. purificare WT
  3. Seguendo operazioni descritte nella sezione 3.2 per ricostituzione, preparare tre diversi campioni per ciascuna composizione lipidica da esaminare; First, fluoresceina GLIC in un rapporto molare di 1:. 1.500 (pentamero: lipide) Secondo, rodamina marcato GLIC in rapporto molare di 1: 1.500 (pentamero: lipidico). In terzo luogo, mescolare detergente fluoresceina solubilizzazione e rodamina etichettati GLIC (rapporto 1: 1 molare). Ricostituire questa miscela in 1: 750 (pentamero: lipidico) il rapporto.
    NOTA: Abbiamo usato tre sistemi lipidici: asolectin, POPC: POPG (rapporto 3: 1 molare), ed E. estratto polare coli. Il rapporto ricostituzione proteine ​​lipidi nell'esperimento FRET è superiore a quello utilizzato per le misure EPR (1: 750 rispetto a 1: 1.500 usato per gli studi EPR).
  4. Diluirela sospensione di liposomi (per ridurre il segnale diffusione della luce; ~ 5 microlitri in 995 ml di tampone A) poi dispensare il campione in una cuvetta di quarzo e metterlo in un fluorimetro.
  5. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 490 (che corrisponde alla massimi di assorbimento per il donatore: fluoresceina). Utilizzando le istruzioni del produttore, registrare gli spettri di emissione da 500 nm a 660 nm.
    NOTA: Per il campione GLIC marcato con fluoresceina, si vedrà un picco a 518 nm (corrispondenti a emissioni di fluorescina) senza picco a 572 nm (corrispondenti a emissioni di rodamina). Per il campione GLIC rodamina marcato, non si vedrà un picco a 518 nm, ma invece a 572 nm di eccitazione derivante dalla diretta di rodamina a 490 nm. Per il campione contenente entrambe le etichette fluoresceina e rodamina, una diminuzione dell'intensità del picco fluoresceina e un corrispondente aumento della rodamina picco è un segnale FRET che è probabilmente un indicatore di aggregazione laterali della proteina sulla membrana.
  6. monitorare laampiezza di emissione rodamina a 572 nm a vari intervalli di tempo (da 0 - 24 h) registrazione ad ogni ora per le prime 6 ore e poi dopo O / N incubazione (Figura 2). Per ogni intervallo, misurare l'intensità di fluorescenza a 572 nm (per rodamina: Ia) ea 518 nm (per fluoresceina: Id). Sottrarre il contributo di attivazione di rodamina diretta (campione 2 al punto 4.3) da Ia (Iac). Determinare il rapporto FRET come Iac / (Iac + Ib). Confronto FRET a intervalli di tempo diversi e attraverso diverse composizioni lipidiche.
    NOTA: Come controllo, eseguire il punto 4.5 e 4.6 per i campioni detergenti solubilizzazione e confrontare gli spettri di emissione a quelle da liposomi ricostituiti. Utilizzare una miscela equimolare di proteina marcata nel detergente (descritto al punto 4.3) e diluire nel tampone A integrato con 0,5 mM DDM. Si prevede che i campioni di detersivo mostreranno segnale FRET minima.

5. Misure funzionali di patch-clamp

  1. preparare proteoliposomes per misure patch-clamp esattamente nello stesso modo che per gli studi EPR (punto 3.1).
    NOTA: Tuttavia, regolare la proteina: lipidica rapporto in base al tipo di rilevazione viene effettuata (monocanale vs registrazioni macroscopico). Flash-congelare i proteoliposomi in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso. Tipicamente, ricostituire GLIC in 1: 10.000 proteine: lipide (rapporto molare) per correnti macroscopiche e 1: 50.000 rapporto molare per le registrazioni singolo canale.
  2. liposomi Scongelare su ghiaccio. Risciacquare un vetrino pulito di vetro con acqua ed etanolo e asciugare completamente. Mettere una goccia 10 microlitri del proteoliposome sul centro della diapositiva e O secca / N in un essiccatore a 4 ° C sotto vuoto.
  3. Reidratare i proteoliposomi essiccate mediante l'aggiunta di 20 ml di tampone B (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,0) e posizionare il vetrino in una petriplate sulla cima di una carta da filtro umida. Coprire la piastra e lasciare la reidratazione di procedere per circa 2 ore.
    NOTA: Questo processo YieLDS giganti liposomi multi-lamellari che sono favorevoli alla patch da.
  4. Tirare le pipette di patch da capillari sottili di vetro borosilicato (~ 1 - 2 micron punta di diametro) utilizzando produttore consiglia l'impostazione sul estrattore pipetta. Heat-lucidare con un incendio in allacciatura ad una resistenza di 1,5 - 2MΩ quando si riempie di tampone B.
  5. Riempire la camera di registrazione con tampone B con una pipetta e collegare l'elettrodo di terra Ag / AgCl. Usando una punta della pipetta 2 ml, rimuovere delicatamente i liposomi dal bordo e trasferire 1 ml di sospensione in camera di registrazione. Attendere qualche minuto per i liposomi di depositarsi sul fondo.
  6. Riempire la patch-pipetta con tampone B utilizzando un ago della siringa non metallico e montarlo l'amplificatore testa stadi. Identificare una vescicola singolo isolato di patch. Applicare una leggera pressione positiva per evitare che la patch-pipetta da intasamento, e inserire la punta nella camera di registrazione.
  7. Applicare impulsi di prova per misurare la impermeabi pipettance e compensare la tensione di offset pipetta. Approccio vescicola, e quando avviene il contatto, applicare una leggera pressione negativa per tirare dolcemente la vescicola contro la pipetta di patch per formare una tenuta gigaohm.
  8. Monitorare la resistenza della pipetta durante l'intero processo. Una volta che il sigillo gigaohm è formata, ritirare la pipetta accuratamente dal liposoma per formare una patch dentro-fuori. Spegnere l'impulso di prova.
  9. Impostare il potenziale tenendo a -100 mV, e applicare un impulso di pH. Basso pH è stata ottenuta utilizzando 10 mM citrato di sodio tampone C (150 mM NaCl, 10 mM citrato, pH 3,0). (Figura 3)
    NOTA: Le registrazioni vengono effettuate ad una frequenza di campionamento di 10 kHz per macroscopica e 40 kHz per le misure a canale singolo.

6. Misure EPR

  1. Onda continua EPR Spectroscopy
    1. Trasferire la sospensione di liposomi dal punto 3.2 in un tubo da 200 ml e sedimentare i campioni utilizzando una centrifuga. Eliminare il supernatant e campione è pronto per misure EPR.
      NOTA: Per misure EPR, è importante rimuovere la maggior quantità di buffer dal campione liposoma possibile. Poiché campioni acquosi assorbono la parte elettrica del forno con conseguente riscaldamento e perdita di sensibilità.
    2. Per effettuare lo scambio di buffer, trasferire 20 ml di liposomi pellet con una pipetta in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 180 pl di tampone D (100 mM NaCl, 10 mM citrato, pH 3,0) e incubare a 42 ° C bagnomaria per 5 min. Centrifugare il campione, rimuovere il surnatante con una pipetta e ripetere il processo per tre volte a garantire lo scambio di buffer completo.
      NOTA: In alternativa, scambio buffer può essere effettuata sottoponendo i campioni a molteplici cicli di congelamento / scongelamento.
    3. Gas capillari in plastica permeabili sono adatti per misurazioni sia spettrale line-forme e accessibilità del solvente. Toccare il capillare sul proteoliposome pellet per disegnare il campione dentro e sigillare l'estremità con cera ossea.
      NONE: Tipico volumi di campione sono ~ 5 ml e una concentrazione di spin desiderabile è di 150 micron. Se l'obiettivo è quello di misurare forme linea sola, si può usare tubi OD quarzo capillari 0,4 mm. Se necessario, una pipetta potrebbe essere utilizzato per il riempimento del campione all'interno del capillare.
    4. Azionare lo spettrometro
      1. Effettuare misure CW-EPR a temperatura ambiente (292-297 K) su uno spettrometro X-band dotato di un risonatore dielettrico come da manuale di istruzioni dei costruttori.
      2. Accendere il refrigeratore d'acqua, alimentazione, e la console ponte di forno a microonde. Lasciare che il sistema di equilibrare termicamente per circa 30 minuti prima della registrazione. Aprire il software di acquisizione.
      3. Inserire il campione / tubo capillare nel risonatore, assicurarsi che la sezione del tubo riempito con il campione è al centro della cavità del risonatore. Tune il risonatore come da istruzioni sul manuale spettrometro.
      4. Registrare il primo spettro di assorbimento derivata dal campo di scansione auna potenza incidente microonde di 1,0 mW, una frequenza di modulazione di 100 kHz e una larghezza di scansione 100 G. Determinare la potenza ottimale per l'esperimento effettuando un esperimento di saturazione potenza progressiva in cui l'altezza di picco-picco della derivata prima CW segnale EPR è misurata in funzione della radice quadrata della potenza incidente microonde.
        NOTA: Con potenze microonde inferiori, l'intensità del segnale aumenta in proporzione alla radice quadrata della potenza finché la popolazione di equilibrio degli stati di spin è inalterato. Tuttavia, se la potenza è ulteriormente aumentata, il rilassamento spin-reticolo può più mantenere la differenza di popolazione equilibrio dei due stati di spin e l'ampiezza del segnale inizia a plateau o "saturazione". Oltre questo punto, l'ampiezza del segnale può effettivamente diminuire con l'aumentare osservare potenza dovuta ad inversione di popolazione di sates di spin. Inoltre, per gli spettri allargato con le ali estese in cui una linea di base piatta ben definita non vibile, di aumentare la larghezza di scansione di 150 - 200 G per prevenire la perdita zona.
      5. Iniziare con l'utilizzo di una modulazione di ampiezza di 1,0 G.
        NOTA: Questo valore dipende dal campione e regolato per diminuire il rumore a bassa frequenza nel segnale. Se viene utilizzato un valore troppo elevato, può falsare o ampliare il segnale.
      6. Impostare la costante e la conversione di tempo il tempo di 20,48 msec, spazzare il tempo di 20.97 secondi, e la risoluzione a 1024 punti.
        NOTA: La costante di tempo si basa anche sul campione e viene regolato per filtrare il rumore ad alta frequenza.
      7. Dopo la prima scansione, impostare il campo centrale al centro del segnale EPR e selezionate larghezza spazzata tale che la traccia include il segnale e di base sufficiente su entrambi i lati.
        NOTA: Inoltre, per migliorare il rapporto segnale / rumore, aumentare il numero di scansioni basati sulla forza del segnale EPR. Includere larghezza sweep e il numero di punti
      8. Misurare l'accessibilità del marchio di selezione per collisionale agenti rilassante O 2 di 27 descritto al punto 6.1.4.4.
        NOTA: Preparare Niedda come descritto in precedenza 26.
      9. Prima profumato campione nella cavità con N 2 per 5 min (per irrigare O 2). Misurare gli spettri per ogni potenza microonde tra 5 - 35 dB in passi di 3 dB con una larghezza di spazzata 30 G.
      10. Poi profumato il campione nella cavità con aria per 10 min e misurare gli spettri a diverse potenze microonde (5 - 35 dB in passi di 3 dB) come nel passo 6.1.4.9.
      11. Incubare 20 ml di liposomi pellet con 180 ml di 50 mm Niedda (in tampone B o buffer D) in un 42 ° C bagnomaria per 5 min. Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante con una pipetta. Caricare il campione nel capillare e posizionarlo nella cavità del risonatore. Ripetere il punto 6.1.4.9.
        NOTA: Il principio dietro l'esperimento è che l'interazione con relaxina paramagneticaAgenti g attraverso Heisenberg scambio di spin impedirebbero la saturazione del segnale e inversione di popolazione. Solubile in acqua Niedda e liposolubile O molecolare 2 sono usati come reporter per l'acqua (sia sfuso e vestiboli intraprotein) e la membrana posizioni sulla proteina esposti, rispettivamente.
  2. Analisi dei dati:
    NOTA: L'analisi dei dati EPR prevede i seguenti passaggi: 14,22,23,25-27
    1. Calcolare la mobilità della sonda di spin (d H o -1), come l'inverso della larghezza della linea centrale del primo spettro di assorbimento derivata. D H o -1 è riflettente della libertà motional o alla dinamica della sonda.
    2. Calcolare il parametro accessibilità (П), che è una stima dell'accessibilità della sonda ad altri agenti rilassanti collisionali paramagnetici, utilizzando procedure descritte di seguito.
      NOTA: L'interazione dello spin-sonda con agenti paramagnetici rilassanteaumenta il tasso di rilassamento spin-reticolo (T 1) del nitrossido da Heisenberg scambio di spin. 27
      1. Stima l'accessibilità del parametro (П) da esperimenti di saturazione potenza (6.1.4.8) in cui l'ampiezza verticale picco-picco della linea centrale del primo spettro EPR ​​derivato è misurato a differenti microonde. 25 Trama l'ampiezza del segnale in funzione della radice quadrata della potenza delle microonde e forma con la seguente equazione 27.
        Equazione 1
        NOTA: Dove A è l'ampiezza del segnale, è una misura della omogeneità della saturazione della linea di risonanza (in genere tra 0,5 e 1,5), I è un fattore di scala, P è la potenza incidente, e rappresenta la valore al quale la prima ampiezza derivato è metà del suo valore insaturo.
  3. Calcolare Ap 1/2 valori in presenza (O 2 o Niedda) e assenza (perfusi con N 2) di agenti paramagnetici rilassante. Calcolare il parametro di accessibilità (П) utilizzando l'equazione:
    Equazione 2
    NOTA: Dove P 1/2 riferimento e o riferimento d H sono il massimo valore di saturazione di metà potenza e la larghezza della linea centrale, rispettivamente per lo standard di riferimento (ad esempio DPPH (2,2-difenil-1-picrylhydrazyl)) 27.

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Representative Results

Caratterizzazione biochimica dei mutanti GLIC Spin-marcato

Seguendo il protocollo sopra descritto sarebbe tipicamente produrre proteina di fusione GLIC-MBP nell'intervallo 10 - 12 mg / L di cultura. Anche se questo valore può variare tra diversi mutanti, in particolare per le posizioni sepolti all'interno della proteina, il rendimento può essere notevolmente compromessa. In questi casi, i volumi di coltura possono richiedere scaling up. La scissione della fusione costrutto da HRV3C proteasi avviene O / N per convenienza. Eseguendo i campioni su gel SDS PAGE, abbiamo scoperto che questa scissione è stata completata in 30 - 60 min. (Figura 1A). GLIC purificato su colonna di esclusione dimensionale gel filtrazione eluisce prevalentemente come un pentamero con un volume di ritenzione di 11,3 ml. La frazione MBP eluisce a 15 ml e aggregati eluire al volume vuoto della colonna (~ 7,0 ml). Lo spin-label arriva ala fine della eluizione (~ 24 ml) (Figura 1B)

FRET Based test per il monitoraggio aggregazione di GLIC ricostituito in vari lipidi della membrana

FRET-test è utilizzato per valutare l'aggregazione di pentamers GLIC in vescicole ricostituite (si sono riuniti all'interno di una distanza <50 A sulla membrana). La figura 2 mostra i dati da GLIC peso (con C27, etichettati sia con fluoresceina o tetramethylrhodamine) e ricostituito in E lipidi polari .coli, POPC: POPG (3: 1), il Papa: POPG (3: 1) o asolectin. Misure di fluorescenza mostrano che GLIC ricostituito in asolectin non ha mostrato alcun tasto e persino congelamento / scongelamento del campione (condizioni note per promuovere l'aggregazione) ha prodotto cambiamenti minimi nei livelli FRET 43. Per questo motivo, asolectin è la miscela di lipidi di scelta per misurazioni funzionali e spettroscopiche utilizzati in questi stumuore.

Macroscopica Comportamento di GLIC in proteoliposomi

Proprietà funzionali di purificato GLIC si caratterizzano per la misurazione del patch-clamp in proteoliposomi ricostituiti. Rappresentativa registrazione corrente macroscopica wt GLIC da un cerotto inside-out in risposta ad un pH-jump è mostrato in Figura 3 a -100 mV tiene potenziale, il passaggio a pH 3,0 tampone produce rapidamente attivando correnti attivo. Periodo (10 - 100 msec) che decadimento a circa il 10% dell'ampiezza di picco in pochi secondi 43 (1 - 3 sec, Figura 3). Correnti recuperare da questo decadimento macroscopica o desensibilizzazione passando indietro a pH neutro. Mentre i canali nella patch dentro-fuori erano sensibili a variazioni del pH del bagno, non c'era alcun effetto di cambiamento del pH nella soluzione pipetta (dati non mostrati) suggerendo che GLIC era prevalentemente orientato in una disastrosaction tale che nella patch dominio extracellulare affrontato scambiatore vasca / soluzione.

Riarrangiamenti strutturali durante l'attivazione del canale

Al RT, lo spin-sonda può adottare più conformazioni rotameric, e la forma riga spettrale è sensibile non solo al moto di spin-label catene laterali relative alla dorsale peptide, ma anche a fluttuazioni backbone e moti proteici globali. Pertanto, i cambiamenti nel lineshapes EPR può dimostrare di essere un ottimo strumento diagnostico per monitorare proteine ​​cambiamenti conformazionali. La figura 4 mostra gli spettri nella posizione L241 (17) R1 nella regione idrofoba extracellulare della regione M2 pori rivestimento (posizione evidenziata come cerchi neri a Figura 4, interno) a pH 7,0 e pH 3,0. Le differenze spettri mostrano sotto due condizioni, sia in ampiezza del segnale e la misura diampliamento motional. Come con le misure funzionali 42, i cambiamenti conformazionali riportate dai segnali EPR sono completamente reversibile. allargamento spettrale è influenzato sia dai vincoli dinamiche di sonda e per accoppiamento dipolare. Per determinare il contributo dei due, L241 (17) è co-etichettato con uno spin-label diamagnetico. Gli spettri sotto-marcato e completamente etichettate sono confrontati a pH 7,0 e pH 3,0 (Figura 4B). L'entità di ampliamento dipolare in questa posizione diminuisce quando i canali sono sotto etichettati, che indica una interazione tra spin-etichette tra le diverse subunità.

La figura 5 mostra gli spettri di due posizioni sul elica M4 che è situato alla periferia del canale. D H o -1 è misurato come l'inverso della larghezza della linea centrale (mostrata in riquadro). Come il movimento di rotazione nitrossido è ridotta, come testimoniato durante la formazionedi contatti terziarie o quaternarie, la larghezza linea aumenta (e quindi d H o -1 diminuzione) per una particolare geometria motional. Al contrario, i movimenti strutturali che portano ad un aumento della libertà di movimento della sonda si riflette come un aumento d H o -1. F312R1 è più mobile, mentre R296R1 è immobile, in linea con i loro ambienti esposti e altamente vincolati rispettivamente.

Sulla base dei parametri di accessibilità, spin-label in una specifica posizione sulla proteina può essere classificato come uno dei seguenti: sepolta nel nocciolo proteine ​​inaccessibile per acqua o lipidi, sulla superficie esposta ad una soluzione acquosa, o superficie esposta lipidi (figure 5 e 6). I parametri di accessibilità ottenuti per una serie di siti consecutivi possono quindi essere utilizzati per determinare la struttura secondaria di una regione, sondare aree di proteina-proteinacontatto, misurare l'inclinazione di una proteina all'interno della membrana, stimare la profondità di immersione di loop di interfaccia e identificare vestiboli d'acqua e tasche lipidi-bound nei eliche transmembrana. 26 A titolo di esempio, le curve di potenza di saturazione in figura 6 mostrano che F312R1 ha un P relativamente superiore per 1/2 O 2, in confronto a R296R1, suggerendo le catene laterali in posizione F312 sono lipidi esposti. Inoltre, F312R1 è anche più accessibile a Niedda rispetto a R296R1 coerente con la sua posizione all'interfaccia lipide-acqua. D'altra parte, L180R1 nella regione di loop C del dominio extracellulare è mobile e accessibile a Niedda, coerente con la sua posizione in un ciclo esposti all'acqua.

la dinamica della sonda e dei dati di accessibilità in una data posizione di fornire informazioni strutturali locale su quella posizione specifica all'interno della proteina-fold generale. Questi parametri determinati per altriSequenza inear dei residui lungo la proteina può essere ulteriormente analizzato utilizzando approcci analitici basati su metodi di trasformata di Fourier. Queste analisi sono utili per valutare variazioni periodiche dei parametri ambientali EPR e di guidare nel prevedere e orientare strutture secondarie. Per un particolare segmento di proteine, una trasformata discreta di Fourier spettro di potenza P (ω) è calcolata in funzione dell'angolo tra posizioni adiacenti (Q) in quel segmento. Questa trama viene quindi utilizzato per determinare la componente principale frequenza angolare dello spettro e confrontata con i valori attesi (Q) per un α-elica (80 - 120º) o beta-fili (150 - 180 °).
Equazione 3
dove P ( 'ω') è la trasformata di Fourier spettro di potenza in funzione della frequenza angolare ω, n è il numero di residui nel segmento, è parametro ambientale nella posizione. P ('ω') viene valutato per il ω value = equazione 6 che massimizza P ( 'ω').

Inoltre, un parametro index periodicità (dà il significato della struttura secondaria prevista) è calcolato come rapporto tra l'area sotto lo spettro di potenza per l'angolo che rappresenta un dato elemento strutturale a quella della superficie totale dello spettro. Procedimento finestra scorrevole viene quindi utilizzato per identificare l'inizio e la fine di un dato elemento strutturale secondaria. L'orientamento relativo segmento rispetto al resto della proteina può essere stimata dalla direzione della P ( 'ω') momento.

Per α-elica:

Equazione 4

Equazione 5

Questi metodi sono stati applicati con successo a diversi sistemi per determinare tre topologie dimensionali e prevedere i cambiamenti conformazionali sottostanti la funzione delle proteine ​​14,23,24,41,44-53.

Determinare la distanza di distribuzione da EPR

Inter-subunità distanze nitrossidi possono essere determinati da elettrone-elettrone interazioni dipolari. In CW-EPR, come mostrato in figura 4, attraverso spazio interazioni dipolari portano ad allargamento spettrale e sono una funzione della vicinanza tra le etichette. Per distanze fino a ~ 15 - 20 Å, l'entità di ampliare (rispetto tra spettri completamente etichettate e gli spettri sotto marcato) può essere utilizzato per semi-quantitativamente stimare le distanze utilizzandoMetodi di Fourier deconvoluzione. 28,29

Distanze Inter-subunità (<50 A) possono essere misurati con metodi doppio elettrone-elettrone risonanza (cervo). 30-34 i dati cervi sono raccolti in campioni di detersivo o ricostituiti in nanodiscs a causa delle limitazioni associate a queste misure in liposomi 54. Per i campioni di spin-etichettato detergente (~ 100 micron) in tampone A con 0,5 mM DDM, 30% (peso / volume) glicerolo è usato per crioprotezione. I dati evoluzione temporale dipolare si ottengono a 83 K con un cervo protocollo standard a quattro impulsi (π / 2) MW1-τ1- (π) MW1-τ1- (π) MW2-τ2- (π) MW1-τ2-echo 55 su uno spettrometro EPR pulsato operante alla frequenza Q-banda (33,9 GHz). Le lunghezze di impulso per (2 π /) MW1 e (π) MW1 sono 10 e 20 nsec, rispettivamente, e 40 NSEC per (π) MW2. segnali cervi sono quindi di fondo corretta assumendo un backgro omogenea 3Dund e analizzato dalla regolarizzazione Tikhonov 31,56 per determinare le distanze medie e distribuzioni in lontananza.

Distanze intramolecolari per una posizione di rappresentanza a M4 (F314R1) determinato da esperimenti CERVI a pH 7,0 sono mostrati in figura 7 Dato che ci sono cinque spin-etichette all'interno del pentamero GLIC, sono previsti almeno due distanze.; uno corrispondente alle subunità adiacenti e l'altro dalla subunità adiacenti, anche se picchi addizionali possono derivare da alterni orientazioni di spin rotameric. Il segnale CERVO decade e le distribuzioni di probabilità corrispondenti sono mostrati. Il primo picco a breve distanza (~ 42A) rappresenta distanze tra subunità adiacenti, e il secondo picco (~ 53A) corrisponde alla distanza non adiacente. Il picco per la distanza diagonale sembra essere a distanza più breve, e questo rischia di essere sottovalutato perché misurazioni affidabili oltre 60 Anon sono realizzabili nelle condizioni sperimentali a causa di difficoltà tecniche con correzione del fondo.

Figura 1
Figura 1. caratterizzazione biochimica Spin-etichettato GLIC mutanti. (A) Rappresentante gel filtrazione cromatogramma di spin-marcato-GLIC dopo segmentazione proteolitica dei tag MBP. I picchi corrispondono a GLIC MBP pentamero e gratuito. (B) SDS-PAGE mostrando uncut monomerico GLIC-MBP proteina di fusione (prima di gel filtrazione) e frazioni MBP e GLIC pool da gel filtrazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. FR ET Based test di monitoraggio dello stato di aggregazione di GLIC ricostituito in vari lipidi della membrana. Fret misurazioni sono riportati per i campioni dopo O / N ricostituzione (a sinistra) e dopo il congelamento / scongelamento dei campioni (a destra). (Modificata dalla figura originale). 43 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. macroscopica Comportamento di GLIC in proteoliposomi. In una patch inside-out asportato dal ricostituito asolectin vescicole, GLIC è attivato da pH salti utilizzando uno scambiatore di rapida soluzione. I canali sono visti per attivare in ~ 10 msec e desensibilizzare con una costante di tempo di 1 - 3 sec. (Modificata dalla figura originale). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. riarrangiamenti strutturali durante l'attivazione del canale. (A) rappresentativa spettri CW-EPR per una posizione nel poro rivestimento M2 elica, mostrando variazioni di forme di ampiezza e di linea in risposta alle variazioni di pH. In ogni caso, gli spettri sono normalizzati per il numero totale di giri. posizione di Spin-marcato è mostrata come un cerchio nero. Solo due subunità sono mostrati per chiarezza. (B) EPRspectra mostrano allargamento dipolare da interazioni spin-spin. Gli spettri in tratteggiato erano dai canali sotto-etichettati (in presenza di etichette diamagnetici) e in solido linea provenivano da canali completamente marcate. L'inserto mostra una sovrapposizione di spettri di ampiezza normalizzata. L'ampliamento in condizioni completamente etichettate è altoilluminato da frecce. Larghezza di scansione è di 150 G. (Modificata dalla figura originale). 36 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. specifico residuo Parametri ambientali misurati dalla potenza di saturazione. Le misurazioni della larghezza spettrale (d H 0) e l'accessibilità del solvente (P 1/2) per due posizioni contrastanti nel elica M4 del dominio transmembrana. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Ambiente un rappresentante Loop C residuo nel dominio extracellulare di GLIC. Spin-normalizzato CW-spettri e le misure di accessibilità corrispondenti per L180R1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Distanza Misure di Pulsed-EPR Approaches (cervo). Struttura GLIC mostra la località dei Phe314 e corrispondenti distanze cβ-cβ per le subunità adiacenti e non adiacenti. CW-spettri per questa posizione sono presenti sulla destra. Sfondo sottratto DEER- eco intensità è rilevata in tempo l'evoluzione e in forma utilizzando senza modello Tikhonov regolarizzazione per i campioni in detersivo. La distribuzione distanza inter-spin corrispondente (a destra).PLOAD / 54127 / 54127fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

spettroscopia EPR ha dimostrato di essere un approccio strutturale senza precedenti nella quantificazione cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​di membrana in un ambiente quasi nativa. Questo approccio ci permette una sbirciatina nei dettagli molecolari di dinamica delle proteine ​​che vengono oscurate in strutture ad alta risoluzione da cristallografia a raggi X e microscopia crioelettronica. Tuttavia, è importante considerare le limitazioni tecniche di questo approccio che può influenzare l'applicabilità generale ad altri sistemi e per tenere conto delle possibili ostacoli sperimentali lungo la strada. Discutiamo alcuni di questi aspetti qui di seguito insieme con le strategie consigliate per la risoluzione dei problemi.

Tra i problemi più comuni che si incontra con una tecnica che preveda un'ampia perturbazioni mutazioni sono la bassa resa e la scarsa stabilità oligomerica della proteina. Questo aspetto è ulteriormente aggravata quando si lavora con proteine ​​di membrana multimeric complessi come canali ionici. E 'esimoerefore fondamentale per ottimizzare questi due aspetti biochimici prima di intraprendere una mutagenesi diffusa. Abbiamo scoperto che l'espressione di mutanti tossici GLIC è meglio tollerato in ceppi C41 e C43 delle cellule BL21 3,36 Inoltre, l'abbassamento della temperatura di post-induzione a 15 -. 18 ° C, diminuendo la concentrazione IPTG a 100 micron, e di cui 5% glicerolo durante l'induzione sembra aiutare con l'abbassamento aggregazione proteica presumibilmente rallentando la velocità di espressione della proteina e riducendo l'entità del misfolding. mutazioni cisteina in certe posizioni (in particolare nella via permeazione) hanno dimostrato di aumentare l'attività costitutiva del canale e questi mutanti sono suscettibili di porre maggiori ostacoli nell'espressione. L'utilizzo di bloccanti dei pori bivalente (10-25 mM Ba 2+) durante l'induzione allevia la tossicità e migliora la crescita delle cellule 57 Queste strategie si sono dimostrati efficaci in molti casi a migliorare il rendimento, riducendo l'aggregazione proteica e migliorare oligo.stabilità meric. 36,58

Un altro punto critico in SDSL è l'efficienza del processo di etichettatura. Mentre superficie esposta cisteine ​​non pongono grossi problemi a MTSL reattività (> 90% i rendimenti di etichettatura), posizioni in cui le cisteina catene laterali sono sepolti e inaccessibili possono richiedere concentrazioni di spin-label più elevate e tempi di incubazione più lunghi. L'aumento della concentrazione di spin-label per 30 volte eccesso molare e incubando O / N a 4 ° C aiuta a migliorare l'efficienza di etichettatura. Inoltre, è anche importante misurare gli spettri del marcato template Cys-less per determinare il contributo di fondo. Per i siti che sono mal etichettati (<10%), il segnale di fondo travolge gli spettri generale. Mentre determinare l'efficienza spin-etichettatura, notare che la precisione è influenzata da una serie di fattori che includono il volume del campione, diametro campione capillare, posizionamento del capillare all'interno del risuonatore, la temperatura della cavità, e risuonatore QValore (che è il rapporto tra l'energia immagazzinata nel sopra l'energia dissipata out). Bisogna fare attenzione a mantenere queste condizioni identiche tra i campioni e standard. Inoltre, va notato che per i siti immobili, dove gli spettri sono intrinsecamente ampia, la precisione della misura etichettatura scende ulteriormente. In alternativa, cromatografia liquida Time of Flight-Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (LCT-ESI-MS) può essere utilizzato per determinare direttamente la massa molecolare e l'efficienza, quindi, di etichettatura. Tuttavia, la sensibilità MS è compromessa per i campioni in detergenti e proteine ​​di membrana strettamente ripiegate.

Una volta che i mutanti sono purificati come una popolazione omogenea, è importante verificare la funzionalità del preparato. misurazioni patch-clamp di mutanti di spin-marcato in regioni chiave del canale riveleranno l'effetto della perturbazione sul ligando affinità e gating del canale. In alternativa, le proprietà di canale possono essere studiati in nero LIPID Membrane (BLM) 59 o iniettando proteoliposomi in ovociti e la misura delle correnti di morsetto di tensione a due elettrodi. 59-61 Qualora si constati che la sostituzione cisteina e lo spin-label in certe posizioni alterano ligando-sensibilità o gating cinetica del canali, condizioni sperimentali (concentrazione ligando, modulatori, composizione lipidi) possono essere variate opportunamente per stabilizzare lo stato conformazionale in esame. Inoltre, è da notare che le misure EPR sono fatti in condizioni di stato stazionario e pertanto le variazioni rapide cinetica del canale sono meno suscettibili di influenzare l'interpretazione strutturale.

Chiaramente, un importante vantaggio di questa tecnica è la capacità di studiare la dinamica di canale in membrane di composizione definita e per sondare direttamente come effetti lipidi mediata sulla dinamica altera la funzione del canale. Tuttavia, una limitazione è che alcune composizioni lipidiche possono causare aggregazione laterale del canale on la membrana e quindi l'idoneità dei lipidi deve essere accertata. 45 Per le condizioni che causano l'aggregazione, abbassando proteina-to-lipidico rapporto, effettuare ricostituzione a temperatura più bassa, e abbreviare la durata del tempo di ricostituzione può aiutare a mantenere i canali monodisperse 62 in alternativa, i canali possono essere ricostituiti in nanodiscs, che sono complessi lipidici nanoscala circondate da un anello di amphipathic proteina scaffold membrana (apolipoproteina A1). 63 ottimizzando il rapporto molare del canale proteina, costituenti lipidici, e proteine ​​ponteggi membrana, è possibile ottenere una popolazione omogenea e mono-dispersa di unità monocanale incorporati in singoli nanodiscs. Questo sistema ha diversi vantaggi aggiuntivi in ​​quanto i nanodiscs sono otticamente chiaro e forniscono un facile accesso sia alla intracellulare e sui lati extracellulari della membrana.

Infine, a livellodelle misure EPR, si potrebbe essere di fronte a CW-EPR spettri che non sono facili da interpretare, soprattutto per le posizioni che mostrano spettri multicomponente. Tale eterogeneità conformazionale può derivare da scambiare lentamente conformazioni delle proteine ​​e / o multiple orientamenti della spin-label in una determinata conformazione della proteina. Determinazione del contributo relativo dei due scenari non è banale e può richiedere l'uso di derivati ​​alternativi spin-label, o cambiare la temperatura sperimentale, 64 di pressione, 65 intensità di campo / frequenza forno a microonde, 66 o da osmolyte perturbazione. 67

Inoltre, le misurazioni cervo in liposomi possono essere limitati da una serie di fattori, tra cui minore sensibilità, maggiore contributo di fondo derivanti da interazioni intermolecolari avanzate, e una riduzione nella gamma distanza misurabile (<50A). In generale, per le distanze più lunghe (<50 A), vi è grandeer incertezza nelle larghezze della distribuzione a distanza a causa di insufficienti i tempi di evoluzione dipolare. Tuttavia, l'uso di Q banda (34 GHz) frequenza delle microonde ed etichettatura con un'etichetta rotazione bifunzionale (con ridotte dinamica intrinseca) hanno dimostrato di alleviare alcune di queste limitazioni. 54 ricostitutivo in nanodiscs è stato anche dimostrato di migliorare enormemente la sensibilità DEER by riduzione dei contributi di fondo che si pone da interazioni intermolecolari dipolari. 15

Nonostante queste limitazioni, SDSL / studi EPR, in particolare in sistemi con pochi cisteine ​​nativi, hanno dimostrato di essere notevolmente informativo. I futuri avanzamenti tecnologici sono orientati verso adattare questo approccio potente per studiare canali umani più complessi, in cui mutanti cisteine ​​native non può essere fattibile. A questo proposito, lo sviluppo di strategie di etichettatura alternativi come quelli basati su incorporazione sito-specifica di aminoacidi non naturali, 68 o SyntESI di etichette che sono indirizzate verso altri aminoacidi, 69 sembrano molto promettenti.

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Acknowledgments

Siamo molto grati ai deputati ed ex deputati del laboratorio Chakrapani per la lettura critica e commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzione (1R01GM108921) e l'American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 12SDG12070069) e SC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

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References

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Chimica pLGIC recettori Cys-loop lipidi di membrana la ricostituzione patch-clamp proteoliposomi sito-diretta di etichettatura di spin spettroscopia EPR dinamiche di canale l'interazione lipidi-proteine
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Basak, S., Chatterjee, S.,… More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

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