Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/54127

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Son on yılda, pentameric ligand-kapılı iyon kanallarının yapısal anlayış (pLGIC) ailesinin bazı üyeleri yüksek çözünürlüklü yapıların yığınlarının nedeniyle, çarçabuk büyüdü. Alandaki güncel gelişmelere yol açan temel faktörler, yapı tayinleri yaklaşımları prokaryotik pLGIC kanallarının keşif, ökaryot membran proteini ifadesinde 1-3 büyük ilerlemeler, 4-6 ve muazzam atılımlar bulunmaktadır. 7 Bu yapılar net bir fikir birliği sağlamak pLGIC üç boyutlu mimari genel koruma. Ancak, geride iz gibi iki önemli alanlar bu kanal hazırlıkları fonksiyonel karakterizasyonu ve kanal fonksiyonu mekanik açıklaması vardır.

Gating konformasyonel değişiklikler karmaşıktır ve kanalın uzunluğu boyunca 60 bir mesafede meydana gelmekte, bu geçişler yaygın olarak modüle edilirmembran lipidleri. Özel olarak, negatif lipidler, kolesterol ve fosfolipid pLGIC 8-11 fonksiyonunu modüle ettiği gösterilmiştir. Kanal fonksiyonunda bu lipit bileşenlerin kesin rolü bilinmese de, yolluk tam bir moleküler anlayış kendi doğal ortamında bu kanallar okuyan gerektirecektir. Site Yönetmen Spin Etiketleme (SDSL) ve Elektron Paramagnetik Rezonans (EPR) spektroskopisi sulandırılmış sistemlerde protein dinamikleri incelemek için seçim teknikleridir. (Floresans spektroskopisi olduğu gibi) ve bu şekilde doğal lipit koşulları içinde yeniden tam uzunluktaki konstruktlarının ölçümleri sağlar EPR spektroskopisi molekül büyüklüğü ile sınırlıdır (NMR olduğu gibi) ya da numune optik özellik değildir. teknik son derece hassas ve (pico-mol aralığında) nispeten düşük örnek gereksinimleri vardır. Bu iki yönü miligram üzerinde ifade etmek zordur büyük membran proteinleri eğitim tekniği uygundur yapmakmiktarları.

Mevkiye-yönelik sıkma etiketi ile kombinasyon halinde EPR spektroskopi kullanılması Wayne Hubbell ve arkadaşları tarafından geliştirilen, ve protein tiplerine çalışmak için adapte edilmiştir. 12-24 EPR veriler ikincil yapılar araştırmak için kullanılmıştır, protein değişiklikleri konformasyon, zara sokma derinliği ve protein-protein / protein-ligand etkileşimleri.

yöntem, alana-yönelik mutagenez ile ilgi pozisyonlarda sistein ikame içerir. Site-spesifik etiketleme sağlamak için, bir sistein az bir şablon oluşturmak için bir başka amino asit ile (ör., Serin) yerel sistein yerine gereklidir. bir disülfid bağı köprü ile proteine ​​bağlanır (1-oksil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirolin-3-metil) methanethiosulfonate: Bugüne kadar, en popüler spin etiket bir tiol özgü MTSL olup. Nedeniyle yüksek özgüllüğü, (triptofan biraz daha büyük) nispeten küçük boyutu ve flexi içinbağlayıcı bölgenin ortaya koymak bu spin etiket bile toprağa sistein ile mükemmel bir reaktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, reaktiviteyi arttırmak için, bir proteinin İşaretleme reaksiyonu deterjan çözünmüş formda gerçekleştirilir. boyut dışlama kromatografisi ile fazla serbest yan etiketin ayrılmasından sonra, protein, lipozomlar veya tanımlanan lipid bileşimin iki tabakalı taklit eden sistemlere yeniden oluşturulur. Genel olarak, sistein mutagenez, protein birçok yerinde tolere edilir, ve spin sondası nispeten küçük ikincil ve üçüncül yapıları çok az pertürbasyon neden olur. modifikasyon vahşi tip fonksiyonları tutulmasını sağlamak için, etiketli ve yeniden kanal yama-kelepçe ölçümleriyle ele alınabilir.

Etiketli fonksiyonlu protein daha sonra esas olarak üç ana bilgi tiplerini sağlayan spektroskopik ölçümler, tabi tutulmuştur: linesh göre 12,14,15,20,22,23,25-27 spin sondası dinamiklerimaymun analizi; paramanyetik gevşeme ajanlara prob erişilebilirlik; ve mesafe dağılımı. 27 EPR mesafeleri iki farklı yaklaşım ile ölçülür. İlk spin-etiketler arasında iki kutuplu ilişkilerden kaynaklanan spektral genişlemesi (8 - 20 Å mesafe aralığında) Sürekli Dalga (CW) tekniğine dayanmaktadır. Mesafeyi belirlemek için kullanılan 28,29 saniye darbeli bir-EPR olduğunu mesafe ölçümleri Çift Elektron Elektron Rezonans (geyik) ise 70 Å. 30-34 kadar uzatılabilir yöntem, spin-eko genlik salınımları mesafeleri ve mesafe dağılımlarını belirlemek için analiz edilir. İşte spin eko dipolar etkileşim frekansta modüle edilir. Birlikte, bu parametreler, protein topolojisi, ikincil yapısal elemanlar ve protein yapı değişiklikleri belirlemek için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Sayfa yönelimli mutagenezle ve Cys Mutasyonlar

  1. Klonlama ve Mutajenez
    Not: GLIC vahşi tip (WT) 35 sistein az arka plan oluşturmak için serine mutasyona bir tek yerli sistein (C27) bulunmaktadır. Sistein mutasyonlar istenilen konuma 36 bir sistein kodonu taşıyan primerler kullanılarak mevkiye yönelik mutagenez tarafından sistein az bir arka plan üzerinde yerleştirilir.
    1. 10x reaksiyon tamponu 5 ul, 100 ng 1 ul karışımı / ul sistein az GLIC model DNA 35, 0.5 ul ileri 40 uM her birini ve ters primer 36, dNTP (100 mM) 1 uL, iyonu giderilmiş su 41 ul . iyice karıştırın örnek birkaç kez pipetle, spin (6000 rpm) ve nihayet DNA polimeraz 1 ul ekleyin.
    2. aşağıdaki protokole termo-cycler ayarlayın:
      1. 4 dakika süreyle 95 ° C'de denatürasyon.
      2. 30 saniye için 95 ° C'de denatürasyon.
      3. tavlamak1 dakika boyunca 55 ºC'de ing.
      4. 10 dakika boyunca 68 ºC (kb plazmid uzunluk başına kabaca 1 dakika) uzama.
      5. 18 devir için 1.1.2.4 - 1.1.2.2 tekrarlayın adımları.
      6. 10 dakika 68 ° C'de son bir uzama.
      7. 4 ºC sıcaklık Holding
        NOT: Tavlama sıcaklığı astar Tm göre hesaplanır.
    3. Reaksiyon karışımına DpnI 1 ul ekleyin pipetle iyice karıştırın ve 1 dakika boyunca (6000 rpm) aşağı doğru döndürün. 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
  2. dönüşüm
    1. Çözülme E. Buz üzerinde E. coli yetkin hücreleri. Kısım 30, 14 ml'lik steril bir tüpe dönüşümü hücre ul ve hücrelere sindirilmiş DNA 1 ul ekle. tüpün yan dokunarak karıştırın. Buz üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edin.
    2. 45 saniye için 42 ° C su banyosu içinde Tüp ve daha sonra 2 dakika boyunca geri buz üzerine yerleştirin. Bir incu hücreleri 400 ul steril SOC ortamı ekleyin ve sallamak1 saat 37 ºC'de batör.
    3. Plaka kanamisin (50 uM) ve% 1 glukoz içeren LB plakaları üzerinde 100 ul hücre. 37 ºC'de plakaları O / N inkübe edin.
    4. plakadan tek bir koloni hasat ve 5 ml LB / kanamisin ortamı içeren O / N kültürleri içinde aşılamak. Bir kuluçka çalkalayıcı 37 ºC 'de kültür O / N (~ 16 saat) inkübe edin.
    5. Minipreparat 37 O / N kültüründen DNA ayıklayın. 260 nm dalgaboyunda absorbans ölçülerek bir spektrofotometre kullanılarak DNA verimini ölçmek. 200 ng / ml - konsantrasyon ~ 100 olmalıdır. Standart rekombinant DNA dizileme stratejileri 38,39 ile mutasyon varlığını doğrulamaktadır.

2. GLIC Ekspresyon ve Saflaştırma

  1. dönüşüm
    1. GL için gen kodlaması içeren plazmid - (200 ng / ml ~ 100) 1 ul C43 yetkili hücrelerin 30 ul dönüşümü, Bölüm 1.2'de anlatılan adımları izleyerekİnsan rinovirüs (HRV) -3C proteaz yarılma bölgeleri boyunca IC 35 (aşama 1.2.5 den) (plazmid ve gen dizisi için, takviye metne bakınız).
    2. Levha 100,% 1 glikoz ve 50 ug / ml kanamisin içeren LB-agar plakaları üzerine hücre ul, bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de onları O / N (~ 16 saat) inkübe edilir.
    3. koloniler gözle kontrol edin ve aşırı büyümüş emin olmak ya da uydu koloniler varlığını göstermektedir. Derhal parafilm plakaları mühür ve 4 ºC de saklayın.
  2. O kurma / N-kültürler ve büyüme ortamı hazırlanması
    1. köprüsü inokülasyon kablo kullanılarak tek bir izole koloni almak ve Luria Broth 20 ml içeren bir 100 ml'lik steril bir şişeye aktarın (LB) ortamı 50 ug / ml kanamisin, steril% 1 glukoz ile takviye edilmiş ve. 250 rpm'de bir çalkalama 37 ° C'de / O N (~ 16 saat) inkübe.
    2. Otoklav 900 ml Müthiş Broth (TB) ortam 2.8 (Medya ve Tampon Kompozisyon bakınız)20 dakika boyunca 121 ° C'de buhar döngüsünde bakteri kültürü L Fernbach cam şişeler.
  3. Büyük büyüme kültürleri kurma
    1. Otoklavlanmış TB medyaya steril potasyum fosfat tamponu 100 ml (Medya ve Tampon Kompozisyon bakınız) ekleyin. Steril glikoz (% 0.2 son konsantrasyon), kanamisin (50 ug / ml) ve O / N kültür 10 ml. 250 rpm'de bir çalkalama 37 ° C de kuluçkaya bırakılır.
    2. O 0.5 (~ 2 saat) ulaşıncaya kadar 600 nm dalga boyunda (OD 600) ile dansitometre veya spektrofotometre her saat optik yoğunluk kontrol edin. Bu noktada 150 rpm hızını azaltmak ve 18 ºC sıcaklığını düşürmek. 0.8 (~ 1 saat) ulaşıncaya kadar OD 600 her 30 dakikada izleyin.
    3. (- 30 dakika ~ 15) 1.2 - gliserol 50 ml ekleyin ve OD kadar kültür sallayarak devam 600 1.0 ulaşır.
      NOT: Kültür ºC 37 18 ºC ulaşmak için bu koşullar altında, yaklaşık bir saat sürer. Bu impBu 18 ° C 'soğutulmuştur sonra ortant bu gliserol kültürü eklenir.
    4. 200 uM IPTG (izopropil-tiyo-β-galaktosit) ile hücrelerin neden ve geri 250 rpm çalkalayıcı sıfırlamak ve 18 ºC de ~ için daha 16 saat kuluçkaya yatmaktadır.
  4. protein saflaştırma
    1. Sağlamak 16 saat sonunda OD 600 olduğu ~ 16 - 8500 x g'de, 15 dakika süre ile 4.0 ° C 'de iplik 1.0 İt santrifüj şişelerine 18. Hasat hücreleri. Süpernatantı Durusu ve hücre pelet ile şişeyi tartın. Toplam ağırlık, boş bir şişe ağırlığı çıkartılarak pelet ağırlığı hesaplanır.
      NOT: beklenen hücre pelet ağırlığı ~ 30'dur - 35 g / L. Bu not edilmelidir rağmen mutant boyunca son OD 600 ve hücre topağı ağırlık değişkenlik olabilir.
    2. kültürün 1.0 L başına buz soğukluğunda tampon A içinde 150 mL (100 mM NaCI, 20 mM Tris, pH 7.4) içinde bakteriyel pelet yeniden askıya. DNase I (100 ug / ml) ve Proteas'ı eklemee inhibitörleri (fenilmetil sülfonil fluorür (1 mM), löpeptin (2.0 ug / ml), aprotinin (2.0 ug / ml), ve A (1 ug / ml pepstatin)).
    3. 4,0 ºC soğuk bir odada bir hücre bozucu geçirerek hücreleri homojenize. Bakterilerin çoğu parçalanmış böylece işlemini üç kez tekrarlayın. 15 dakika boyunca 14.000 xg'de hücreleri Santrifüj ve süpernatant dışarı pipet ve temiz bir santrifüj tüpüne aktarın. un-lize hücreleri ve inklüzyon cisimcikleri içeren pelet, atın.
    4. 1 saat 168.000 xg'de süpernatant santrifüj. Dikkatle membran pelet bozmadan süpernatant süzün.
    5. kültür, 1 L zar topağı Havuz 50 ml'lik nihai hacme kadar (% 10 gliserol ile takviye edilmiş) Tampon A içinde yeniden askıya. 4.0 ° C 'de 2 saat süre ile zar süspansiyonu ve nutate n-Dodesil-β-D-maltopiranozit (DDM) 0.5 g ekleyin.
    6. membranın çözülmesinin ardından centrifug ile lizattan hücre debrisini uzaklaştırmak1 saat için 168.000 xg'de tirme. Bu arada amiloz reçine hazırlanması. Aktarım boş polipropilen kromatografi kolonu içine pipet kullanarak reçine 3 mi. 0.5 mM DDM içeren tampon A 10 yatak hacmi ile daha sonra su 3 kez 10 yatak hacmi geçen ve reçineyi yıkayın.
    7. Santrifüj işleminden sonra, yavaşça bir pipet kullanarak süpernatant çıkar ve temiz bir 50 ml konik tüp transfer. yığın halinde bağlanma için, konik tüp önceden dengelenmiş amiloz reçine ilave edin. 4.0 ° C 'de 2 saat süre ile bir karışım nutating sayesinde amiloz reçine ekstre protein bağlama.
    8. Bir kromatografi sütunu aracılığıyla tüm bulamacı Pass ve flow-through toplamak. Sonra reçine üzerinde bağlayıcı maksimize etmek için ikinci kez tüm toplanan akış-geçmektedir.
    9. Bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için, 0.5 mM DDM, 0.5 mM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) ve 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ile tampon A 10 yatak hacmi geçirin.
    10. Buf 10 ml GLIC proteinini ayrıştırmak0.5 mM DDM ve 0.05 mM TCEP ek olarak 40 mM maltoz içeren fer A. TCEP sistein yan zincirlerin oksidasyonu engeller. Tüm Zehir toplayın.
    11. 4 santrifüj konsantratör (Molecular ağırlıklı bir kesim = 50 kDa) ile elüt protein konsantre - 6 mg / mL ve HRV-3C proteazı (200 ug ila 10 mg başına bir protein) ekleyin ve 4.0 ° C 'de, O / N inkübe edin.
      Not: SDS-PAGE jeli üzerinde örnekleri çalıştırarak proteaz sindirimi tamamlanmasını tespit edin (adım 2.5.5 ve Şekil 1).
  5. Mevkiye-yönelik Spin etiketleme
    1. DMSO içinde (1-oksil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirolin-3-metil) MTSL 40 200 mM stok yaklaşık 100 ul yapmak ve 25 ul alikotları -20 ° C'de stok saklayın.
    2. MTSL spin-etiketleme için proteaz sindirilir örnek kullanın. (: MTSL 1:10 molar oranda GLIC monomer) MTSL spin etiketi 10-kat molar fazlalığı ekleyin. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. 5 kat molar fazlalıkla spin etiket bir ikinci atış eklemeoranı ve bir saat daha inkübe edilir.
      Not: (aşağıda tarif edilen düşük spin etiketleme verimle) gömülü pozisyonlarda, spin etiket bir 30 kat molar fazlalığı ilave edildi ve protein, 6 saat süreyle inkübe edilir.
    3. yarık MBP ve GLIC pentamerler den fazla serbest spin etiket ayrı Tampon A ve 0.5 mM DDM ile önceden dengelenmiş olan bir boyut dışlama Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sütun üzerinden örnek geçirin. 30 mi elüsyon toplam 1 ml'lik kesirler toplanır. GLIC pentamerlerini (Şekil 1) ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın. FPLC çalıştırmak için üreticinin talimatlarını izleyin.
    4. 280 nm dalgaboyunda absorbans ölçülerek bir spektrofotometre kullanılarak numunenin konsantrasyonunu belirleyin. Molar tükenme katsayısı ve GLIC monomer tahmini molekül ağırlıklı kısımlar sırasıyla 49.850 M-1 cm-1 ve 36.380 Da vardır. (Molecular santrifüj konsantratör kullanılarak protein çözeltisi konsantre edin~ 8-10 mg / ml ve buz üzerine yerleştirin bir nihai konsantrasyona kadar ağırlıklı bir kesim = 50 kDa). Örnek şimdi tekrar yapılmaya hazırdır.
    5. Diğer bir kalite kontrol hazırlanması biyokimyasal homojen olduğundan emin olmak için de, bir indirgeyici (% 1.0 β-ME), SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırıldı.
      Not: Commassie lekeli jeli 33 kDa GLIC monomer (Şekil 1) tekabül eden ° 'de tek bir bant göstermelidir.
    6. , Iki kutuplu genişletilmesi sergileyen şüphelenilen spin işaretli mutantlar için diamagnetic etiketin 41 varlığında örnekleri altında etiket. 0.1-kat MTSL ile elüt proteini inkübe ve 1.0 saat boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Daha sonra, diyamanyetik etiket (1-asetoksi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirolin-3-metil) metan tiosülfonatın 20 kat molar fazlalık ilave edin.
      Not: Burada kullanılan diamagnetic reaktif aynı etiketleme kimyası ile paramanyetik etikete iso-sterik olduğunu.
    7. 2 saat süreyle buz üzerinde inkübe örnek. Bir sIz yoluyla örnek geçirinAşama 2.5.3 olarak Tampon A ve 0.5 mM DDM ile önceden dengelenmiş e çıkarım kromatografi kolonu.
  6. Spin etiketleme Verimlilik
    1. Spin-işaretleme verimi sistein yan zincir (GLIC-monomer) konsantrasyonu spin etiket konsantrasyonunun oranı olarak tanımlanır. Numunenin spin etiketi etkinliğini belirlemek için, örneğin, entegre yoğunluğu bilinen konsantrasyonda standart bir kalibrasyon grafiği kullanılarak karşılaştırılır. su içinde eritilmesi ile - (250 uM 10) bir konsantrasyon aralığında (TEMPO örneğin 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinyloxyl) EPR standart çözeltileri hazırlanır.
    2. Bu çözeltilerin her biri için EPR sinyali ölçme ve (Basamak 6.1'de tarif edildiği gibi) her bir konsantrasyonu için eğri altındaki alan (EPR sinyali, çift entegrasyon) belirler. TEMPO konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak ölçülen alanı çizimini ve düz bir çizgi ile oturtulmasıyla bir kalibrasyon eğrisi oluşturur.
      NOT: vardıra türev EPR sinyali altında tepe genlik zirve daha spektral yoğunluk daha iyi bir açıklamasıdır. İlk türev EPR sinyal entegre soğurma spektrumunu verecek ikinci bir entegrasyon sonra (spin konsantrasyonu ile orantılıdır) absorpsiyon spektrumu altındaki alanı verecektir. spektrumun düşük alan ve yüksek alan bölgede sürekli bir ölçüyü emin olun.
    3. (Aşama 2.5.4 gibi) bir spektrofotometre kullanılarak deterjan spin işaretli protein konsantrasyonu ölçümü. Şimdi örnek EPR sinyali ölçmek ve daha sonra bölüm 6.1 adımları izleyerek EPR sinyali çifte integrali alanını belirler. kalibrasyon grafiği kullanılarak ölçülen EPR sinyaline karşılık gelen etiketin konsantrasyonunu belirler. spin etiket ve protein konsantrasyonu mol oranı olarak sıkma etiketleme verimliliği hesaplayın.

Asolectin Membranlar 3. GLIC Sulandırma

  1. 5 mL kloroform ile temiz 25 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye durulayın ve davlumbaz N2 gaz akımı içinde kuru bir şişeye. Şişe içine asolectin devri 10 mg, kloroform (soya polar ekstrakt 25 mg / ml stok) ve N2 gazı sürekli bir akışı altında lipitler kurutun.
    NOT: sulandırma için lipid seçimi bölümünde 4 deneylerden elde edilen bulgulara dayanmaktadır.
  2. Kloroform buharlaştı zaman, tam bir kurutma sağlamak için 1 saat boyunca vakumda tutulur,. kurutuldu lipide Sulandırma tampon A 1 ml ilave edilir ve süspansiyon lipid pelet elde etmek için güçlü bir şekilde şişeyi girdap.
  3. (- 15 dakika kabaca 10) küçük tek tabakalı veziküller hazırlamak için vezikül çözüm daha fazla veya daha az şeffaf hale gelinceye kadar, bir soğuk banyo sonikatör lipid süspansiyonu sonikasyon ve hiçbir kümeleri gözlenir. Bu karışıma, 4 mM nihai konsantrasyona kadar DDM ilave edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
<li> Sulandırma
  1. Lipid karışımı adım 2.5.4 saflaştırılan protein ekleyin.
    NOT: protein için lipitte oranı deney türüne bağlıdır. makroskopik akım ölçümleri için, bir 1: 10,000 oranında kullanılır. sinyali en üst düzeye çıkarmak için: EPR çalışmalar için, ürünün hazırlanması için, lipid oranının (2500 1) için daha yüksek bir protein yapılır. Daha önceleri, bu konsantrasyonlarda, yanal agregasyon 42 görülmektedir gösterilmiştir.
    NOT: probed pozisyona dayalı, düşük miktarlarda da çalışacak olsa da EPR için GLIC tipik çalışma miktarı ~ 1 mg'dır.
  2. Daha sonra Tampon A. ile 15 ml örnek sulandırmak nazik rotasyon ile 1 saat 4 ° C'de örnek inkübe
    NOT: Bu adım, kritik misel konsantrasyonu (CMC) altında deterjan konsantrasyonu getiriyor.
  3. (Hidrofobik gözenekler o tuzak deterjan ile) polistiren boncuklar ekleyerek süspansiyon kalan deterjan kaldırın. boncuk temiz 80 mg ekleyin ve lipos inkübe4 ° C'de bir nutator ome süspansiyon O / N.
    1. kullanım için taneler hazırlamak için, ~ 100 mg ağırlığında ve 50 ml konik bir tüp aktarın. , Şiddetle çalkalanır, metanol 10 ml ekleyin 2 dakika süreyle 8,000 xg'de boncuk aşağı doğru döndürün ve metanol süzün. metanol Bu işlem, üç kez yıkama tekrarlayın. Üç kez yıkama, deiyonize su ile 30 ml ile aynı işlem tekrarlanır.
  4. Bir sonraki gün, boncuk çıkarın ve 25 mL daha numunenin seyreltilmesi sütun filtresi kullanılarak 25 ml'lik bir ultra santrifüj tüpüne lipozom aktarın. 2 saat boyunca 168,000 x g'de örnekleri santrifüj. süpernatant süzün ve Tampon B 100 ul kullanarak pelet yeniden askıya

4. FRET tarafından Sulandırma için Optimal Lipid Bileşimi belirleyin

  1. Protein tek dağılımlı tutar membran bileşimini belirlemek için flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı tahlil kullanın.
  2. wt arındırın
  3. Her bir lipit kompozisyonu test edilmesi için üç farklı numune hazırlanması, sulandırma için Bölüm 3.2 adımları aşağıdakı, İlk olarak, 1 mol oranında GLIC fluoresan etiketli. 1500 (pentamer: lipid) İkinci olarak, rodamin etiketli bir mol oranında GLIC 1500: 1 (pentamer: lipit). (: 1 molar oran 1) Üçüncüsü, mix deterjan içerisinde çözünebilen floresein ve rodamin GLIC etiketli. 750 (pentamer: lipit) oranı 1 bu karışım sulandırın.
    Not: asolectin, POPC: POPG (3: 1 mol oranı) ve E. üç lipit sistemlerinde kullanılan E. coli kutup özü. (1: 1 ile karşılaştırıldığında, 750: 1500 EPR çalışmalar için kullanılan) FRET deneyinde protein lipide sulandırma oranı EPR ölçümler için kullanılandan daha fazladır.
  4. Seyreltiklipozom süspansiyonu (ışık saçma sinyali azaltmak için, Tampon A 995 ul ~ 5 ul) bir kuartz küvet içinde örnek pipet ve bir fluorimetre yerleştirin.
  5. (: Floresein donör için absorpsiyon maksimum karşılık gelir) 490 dalgaboyu ayarlayın. Üreticinin talimatlarını kullanarak 500 nm ila 660 nm emisyon spektrumunu kaydetme.
    NOT: floresan işaretli GLIC numune için, 518 nm'de bir tepe (rodamin emisyonuna karşılık gelir) 572 nm'de hiçbir tepe (floresein emisyon karşılık gelen) göreceksiniz. rodamin etiketli GLIC numune için, 518 nm dalga boyunda bir tepe görmezsiniz ancak bunun yerine 572 nm'de 490 nm'de rodaminin doğrudan uyarma kaynaklanan. floresein ve rodamin etiket hem de içeren bir örnek için, floresein pik yoğunluğunda bir azalma, rodamin tepe karşılık gelen bir artış muhtemelen zar üzerinde protein yanal agregasyon bir göstergesi olan bir FRET sinyalidir.
  6. monitörÇeşitli zaman aralıklarında 572 nm'de rodamin emisyon genliği (0 - 24 saat), ilk 6 saat ve daha sonra O / N inkübasyon (şekil 2) sonra, her saatte kaydı. Her aralık için, (rodamin için: la) 572 nm'de floresan yoğunluğu ölçmek ve 518 nm (fluoresein için: Id). Ia (IAC) doğrudan rodamin aktivasyonu (adım 4.3 örnek 2) katkısını çıkartın. Iac / (IAC + Ib) olarak FRET oranını belirler. Farklı zaman aralıklarında ve farklı lipid kompozisyonlar arasında FRET karşılaştırın.
    NOT: Bir kontrol olarak, deterjan içerisinde çözünebilen numuneler için adım 4.5 ve 4.6 yapmak ve yeniden lipozomlardan kişilerce emisyon spektrumları karşılaştırın. Deterjan etiketlenmiş proteinin bir eş molar karışım (adım 4.3 tarif edilmiştir) ve Tampon A 0,5 mM DDM ile takviye edilmiş olarak seyreltin. Deterjan örnekleri az FRET sinyalini gösterecektir beklenmektedir.

Patch-kelepçe Recordings tarafından 5. Fonksiyonel Ölçümler

  1. pr hazırlayınEPR çalışmaları (Kısım 3.1) için tam olarak aynı şekilde yama-kelepçe ölçümleri için oteoliposomes.
    NOT: ölçüm tipi (makroskopik kayıtları vs Tek kanallı) yapılıyor dayalı lipit oranı: Ancak, protein ayarlayın. -80 Sıvı azot ve mağaza proteoliposomes Flash dondurmak ºC kullanıma kadar. Tipik olarak, in 1 GLIC sulandırmak: 10,000 protein: makroskobik akımlar için lipid (mol oranı) ve 1: tek kanallı kayıtları için 50.000 molar oranı.
  2. buz üzerinde Çözülme lipozomlar. su ve etanol ile temiz bir cam slayt durulayın ve tamamen kurumasını. / N vakum altında 4 o C'de bir desikatörde slayt ve kuru O ortasına proteoliposome bir 10 ul damla yerleştirin.
  3. Tampon B (150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.0) 20 ul eklenmesi ile kurutuldu proteoliposomes hidrat-Re, bir nemli filtre kağıdı üzerine bir petriplate slayt yerleştirin. plaka Kapak ve rehidrasyon yaklaşık 2 saat devam etmesine izin verir.
    Not: Bu işlem Yields gelen yama için elverişli olan dev çoklu lamelli lipozomlar.
  4. İmalatçı pipet çektirmesi önerilen ayar kullanarak - ince duvarlı borosilikat cam kılcal damarlar (2 mikron ucu çapı ~ 1) yama pipetler çekin. Tampon B ile dolu iken başına 2 M - Bir kullanarak Isı lehçe 1.5 dirence yangın-sahte
  5. Bir pipet kullanarak Tampon B ile kayıt odasına doldurun ve Ag / AgCl toprak elektrot takın. 2 ul pipet kullanarak, yavaşça kenar ve transfer kayıt odasına süspansiyonun 1 ul arasında lipozomlar çıkarmak. lipozomlar dibe için birkaç dakika bekleyin.
  6. Bir ametal şırınga iğne kullanılarak Tampon B ile yama-pipet doldurun ve amplifikatör kafa sahnede monte edin. yama tek izole vezikül tanımlayın. tıkanmasını yama-pipet önlemek ve kayıt odasına ucu eklemek için hafif bir pozitif basınç uygulayın.
  7. Pipet dayanıklı iş ölçmek için deney darbeleri uygulayınnce ve ofset pipet gerilimi için telafi. vezikül yaklaşın ve temas yapıldığında, hafifçe bir gigaohm mühür formu yama pipet karşı vezikül çekmek için hafif bir negatif basınç uygulayın.
  8. tüm süreç boyunca pipet direnci izleyin. gigaohm mühür oluşturulduktan sonra, bir iç-dış yama oluşturmak için dikkatlice uzakta lipozom pipet çıkarın. Test darbe kapatın.
  9. -100 MV tutma potansiyeli ayarlayın ve pH darbe uygulamak. Düşük pH değeri, 10 mM sodyum sitrat tampon C (150 mM NaCI, 10 mM sitrat, pH 3.0) kullanılarak elde edilmiştir. (Şekil 3)
    NOT: Kayıtlar makroskopik için 10 kHz ve tek kanal ölçümleri için 40 kHz örnekleme frekansında yapılır.

6. EPR Ölçümler

  1. Sürekli Dalga EPR Spektroskopisi
    1. 200 ul tüp içine adım 3.2 lipozom süspansiyonu transfer ve bir santrifüj kullanılarak örnekleri pelet. supernata atınnt ve örnek EPR ölçümler için hazırdır.
      Not: EPR ölçümler için, mümkün olduğu kadar lipozom örneğinden kadar tampon kaldırmak için önemlidir. Sulu örnekleri ısıtma ve hassasiyet kaybıyla sonuçlanan mikrodalga elektrik bölümünü emer beri.
    2. Tampon değişimi gerçekleştirmek için, bir mikrofüj tüpüne bir pipet kullanılarak lipozom pelet 20 ul transfer. Tampon D (100 mM NaCI, 10 mM sitrat, pH 3.0) içinde 180 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 42 ° C su banyosunda inkübe edin. , Örnek santrifüj bir pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve tam tampon değişimini sağlamak üzere işlemini üç kez tekrarlayın.
      Not: Alternatif olarak, tampon değişimi çok donma / erime devirine örnekleri tabi tutulması ile hazırlanabilir.
    3. Gaz geçirgen bir plastik kılcal spektral çizgi şekiller ve çözücü erişilebilirlik hem de ölçümler için de uygundur. içerdeki numuneye çizmek ve kemik balmumu ile ucu mühür topak haline proteoliposome üzerine kılcal dokunun.
      DEĞİLE: Tipik örnek hacimleri ~ 5 ul ve istenen sıkma konsantrasyonu 150 uM'dir. Amaç tek başına hat şekilleri ölçmek ise, bir 0,4 mm OD kuvars kılcal tüpler kullanabilirsiniz. Gerekirse, bir pipet kılcal içinde örnek doldurmak için kullanılabilir.
    4. spektrometre İşlet
      1. üreticilerin kılavuzuna göre bir dielektrik rezonatör ile donatılmış bir X-bant spektrometresi - RT (297 K 292) CW-EPR ölçümler yapmak.
      2. su soğutucu, güç kaynağı ve mikrodalga köprü konsol açın. termal kayıt önce yaklaşık 30 dakika boyunca dengeye kavuşmaları için sistem izin verir. toplama yazılımı açın.
      3. , Rezonatör içerisine örnek tüpü / kılcal yerleştirin numune ile dolu tüp bölümü rezonatör boşluğunun merkezinde olduğundan emin olun. Dinle spektrometre kılavuzda talimat gereğince rezonatör.
      4. saha taraması ile birinci türev absorpsiyon spektrumu kaydedin1,0 mW, 100 kHz modülasyon frekansı ve 100 G. bir tarama genişliği bir olay mikrodalga güç ilerici bir güç doygunluk deney yaparak deney için en uygun güç belirleme nerede birinci türev CW tepe-tepe yüksekliği EPR sinyal olayı mikrodalga gücünün kare kökü bir fonksiyonu olarak ölçülür.
        NOT: Alt mikrodalga güçleri ise, gücünün kare kökü ile orantılı olarak sinyal şiddeti arttıkça sürece spin hallerinin denge nüfusu etkilenmez. güç daha da artmaktadır Ancak, Spin kafes gevşeme artık iki spin hallerinin denge nüfus değişimi koruyabilirsiniz ve sinyal genliği platosu veya başlar "doyurabilecek." Bu noktadan sonra, sinyal genliği aslında nedeniyle Spin sates nüfus ters güç gözlemlemek artan azalabilir. Buna ek olarak, geniş kanatlı genişletilmiştir spektrumları için burada iyi tanımlanmış bir düz taban vi değilAlan kaybını önlemek için 200 G - sible, 150 süpürme genişliği uzatmak.
      5. G. 1.0 modülasyon genliği kullanarak başlayın
        NOT: Bu değer örneklem bağımlı ve sinyal düşük frekanslı gürültüyü azaltmak için ayarlanmıştır. çok büyük bir değer kullanılırsa, o tahrif veya sinyal genişletmek olabilir.
      6. 1024 puan 20.97 sn ve çözüm süresini süpürme, 20.48 msn zaman sabiti ve dönüşüm zamanını ayarlayın.
        NOT: Sabit süresi de örnek dayanmaktadır ve yüksek frekanslı gürültü filtrelemek için ayarlanır.
      7. İlk taramadan sonra, EPR sinyali merkezinde merkez alanını ayarlayın ve iz iki tarafında sinyal ve yeterli bir temel içeren şekilde süpürme genişliği seçin.
        NOT: Ayrıca, sinyal / gürültü oranını artırmak EPR sinyali gücüne dayalı taramaları sayısını artırmak için. süpürme genişliği ve noktaların sayısını ekleyin
      8. Maddeleri rahatlatıcı Çarpışma spin etiket erişilebilirliğini ölçün O 2 27 adımda 6.1.4.4 açıklandığı.
        NOT: Daha önce 26 açıklandığı gibi Niedda hazırlayın.
      9. İlk 5 dakika boyunca N2 ile boşluğunda örnek serpmek (temizlemek için O2). 30 G. bir tarama genişliği ile 3 dB adımlarla 35 dB - 5 arasındaki her mikrodalga güç spektrumları ölçün
      10. Daha sonra oyuk ile örnek serpmek 10 dakika hava ve farklı mikrodalga güçleri de spektrumları ölçmek - Adım 6.1.4.9 olarak (5 3 dB adımlarla 35 dB).
      11. 5 dakika boyunca 42 ° C su banyosunda (Tampon B veya tampon D), 50 mM Niedda 180 ul lipozom pelet 20 ul inkübe edin. örnek santrifüj ve bir pipet kullanarak süpernatant kaldırmak. kılcal içine örnek yükleyin ve rezonatör boşluğuna yerleştirin. Adımı tekrarlayın 6.1.4.9.
        NOT: deney arkasındaki prensip olduğunu paramanyetik relaxin ile etkileşimHeisenberg Spin alışverişi yoluyla g ajanlar, sinyal ve nüfus inversiyon doygunluk önleyecektir. Suda çözünür Niedda ve lipid çözünür molekül O2 su (her ikisi de dökme ve intraprotein Ön) için muhabir olarak kullanılır ve membran sırasıyla protein pozisyon maruz bırakılmıştır.
  2. Veri analizi:
    NOT: EPR Verilerin analizi aşağıdaki adımları içerir: 14,22,23,25-27
    1. Spin sondası hareketliliğini hesaplayın (AH o -1), birinci türev absorpsiyon spektrumunun merkez çizgi genişliği tersi olarak. Sh o -1 motional özgürlük ya da prob dinamikleri yansımasıdır.
    2. Aşağıda açıklanan adımları kullanarak, diğer paramanyetik çarpışma rahatlatıcı ajanlara prob erişilebilirlik bir tahmindir erişilebilirlik parametresini (П), hesaplayın.
      NOT: paramanyetik rahatlatıcı maddeleri ile spin-prob EtkileşimiHeisenberg Spin değişimiyle nitroksitten Spin kafes gevşeme oranı (T 1) artırır. 27
      1. Birinci türev EPR spektrumun merkezi çizgisine dikey tepe-tepe genlik, farklı mikro dalga gücü ile ölçüldüğü güç satürasyon deneyleri (6.1.4.8) erişilebilirlik parametre (П) tahmin edilmesi. 25 Plot sinyalinin genliğini aşağıdaki denklem 27, bir mikro dalga gücünün kare kökü fonksiyonu ve uygun şekilde.
        denklem 1
        NOT: Bir sinyal genliği, (genellikle 0.5 ile 1.5 arasındadır) rezonans çizgisinin doyma homojenlik ölçüsüdür, bir ölçeklendirme faktörü, P olayı gücü ve temsil değeri, ilk türev genliği olarak doymamış bir değer yarısıdır.
  3. Hesapla Ap 2 veya Niedda) ve yokluğu 1/2 değerleri paramanyetik rahatlatıcı maddelerin (N2 ile perfüze). denklemini kullanarak erişilebilirlik parametresini (П) hesaplayın:
    denklem 2
    NOT: P 1/2 referans ve Sh o referansı 27 (örneğin DPPH (2,2-difenil-1-picrylhydrazyl) gibi) referans standardı için, sırasıyla, yarım maksimal güç doygunluk değeri ve merkezi çizgi genişliği vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Spin işaretli GLIC Mutantlarının Biyokimyasal Karakterizasyonu

kültür, 12 mg / L - tipik olarak 10 ila GLIC-MBP füzyon proteinini doğuracak, yukarıda tarif edilen protokol izlenerek. Bu değer, özellikle protein içinde gömülü pozisyonlar için, farklı mutantların arasında değişse de, verim önemli ölçüde bozulabilir. Bu gibi durumlarda, kültür hacimleri ölçekleme gerektirebilir. HRV3C proteaz kolaylık O / N yürütülür tarafından füzyon bölünme yaparız. 60 dakika - SDS PAGE jel örnekleri çalıştırarak, bu bölünme 30 içinde tam olduğunu gördük. (Şekil 1A). Boyut dışlama jel filtrasyon kolonu üzerinde saflaştınldı GLIC 11.3 ml bir saklama hacmi olan bir pentamer ağırlıklı olarak çözülür. MBP kısmı, 15 ml elüt ve agrega kolonu (~ 7.0 mi) boşluk hacmi elüt. Spin-etiket geliyorElüsyon ucu (~ 24 mi) (Şekil 1B)

Çeşitli Membran Lipidler GLIC yeniden ve Toplama İzleme Tabanlı Testi FRET

FRET deney Şekil 2 (floresein veya tetrametilrodamin, ya etiketlenmiş C27 ile) GLIC ağırlık verileri Şekil. (Bir mesafe zar üzerinde <50 içinde bir araya gelen) yeniden veziküllerinde GLIC pentamerler agregasyonunu değerlendirmek için kullanılan ve E içinde yeniden edilir .coli polar lipidler, POPC: POPG (3: 1), POPE: POPG (3: 1) ya da asolectin. Floresan ölçümleri asolectin içinde yeniden GLIC hiçbir FRET gösterdi ve hatta / numuneyi (toplanmasını teşvik bilinen koşullar) çözülme donma FRET seviyelerinde 43 minimal değişiklik ürettiğini göstermektedir. Bu nedenle, asolectin bu ö kullanılan fonksiyonel ve spektroskopik ölçümler için tercih edilen lipit karışımıölür.

Proteoliposomes içinde GLIC makroskobik Davranış

Saflaştırılmış GLIC fonksiyonel özellikleri yeniden proteoliposomes yama kelepçe ölçülmesi ile karakterize edilir. PH-atlama cevaben bir iç-dış yamadan GLIC wt'den Örnek makroskopik geçerli kayıt, Şekil 3 'de gösterilmiştir -100 mV'de hızla içeri doğru akımlar aktive üretir pH 3.0 tampon geçiş potansiyel tutma. (10-100 milisaniye) olduğu (3 - sn, Şekil 3, 1) saniye 43 olan en yüksek amplitüd yaklaşık% 10 bozunma. Akımlar nötr pH geri geçiş yaparak bu makroskopik çürüme veya duyarsızlaştırma kurtarmak. iç-düzeltme kanalların banyosu pH değişikliklerine duyarlı iken, GLIC ağırlıklı vahim bir yönlendirilmiş olduğu öne pipet çözeltisi içinde pH değişikliğinin hiçbir etkiye (veriler gösterilmemiştir) olduction yama hücre dışı alanı banyo / çözüm değiştirici karşı karşıya olduğu böyle.

Kanal Aktivasyonu sırasında yapısal Düzenlenmeler

Oda sıcaklığında, spin sondası birden rotamerik biçimleri benimseyebilir ve spektral çizgi şekli peptit omurgasına göre eğirme etiketli yan zincirlerinin hareket, aynı zamanda omurga dalgalanmalara ve küresel bir protein hareketlerine sadece duyarlıdır. Bu nedenle, EPR lineshapes değişiklikler gözenek astar M2 bölgenin dışı hidrofobik bölgesinde R1. Protein yapısal değişiklikleri izlemek için mükemmel bir tanı aracı olarak kanıtlamak Şekil 4 pozisyon L241 (17) spektrumlarını göstermektedir olabilir (konum siyah daireler olarak vurgulanan Şekil 4, pH 7.0 ve pH 3.0 ek). Sinyal genliği iki koşullarda spektrumları gösterisi farklılıkları, hem de kapsamımotional genişletilmesi. Fonksiyonel ölçümlerle 42 ile olduğu gibi, EPR sinyalleri tarafından bildirilen yapısal değişiklikler de tam olarak geri dönüşlü bulunmaktadır. Spektral genişleme prob devinişsel kısıtlamaları ve dipolar kavrama hem etkilenir. iki, L241 (17) katkısını belirlemek için eş-etiketli bir diamagnetic spin-etiketle olduğunu. Altında etiketli ve tam olarak etiketlenmiş spektrumları pH 7.0 ve pH 3.0 (Şekil 4B) karşılaştırılır. Bu pozisyonda dipolar genişletilmesi ölçüde kanalları altında farklı alt birimler arasındaki spin-etiketler arasında bir etkileşim işaret eden, etiketli zaman azalır.

Şekil 5, kanalın çevresi bulunmaktadır M4 helezon iki pozisyon spektrumlarını göstermektedir. Sh o -1 (içerlek gösterilmektedir) merkez çizgi genişliği tersi olarak ölçülür. nitroksid dönme hareketi azalır gibi, en oluşumu sırasında tanıktersiyer veya kuaterner kişileri, herhangi bir devinişsel geometri için (ve dolayısıyla Sh o -1 düşüş) çizgi genişliği artar. Tam tersine, hareket sondanın özgürlüğüne bir artışa yol açan yapısal hareketleri -1 o Sh bir artış olarak yansır. R296R1 sırasıyla onların maruz kalan ve son derece kısıtlı ortamlarda, hareketsiz tutarlı ise F312R1 daha hareketlidir.

bir sulu çözeltiye maruz kalan yüzeyi üzerinde, su veya lipitler ya erişilemez proteini çekirdek içinde gömülü ya da: erişilebilirlik parametrelere göre, protein üzerindeki belirli bir konumda bir dönme etiketli aşağıdakilerden biri olarak sınıflandırılabilir yüzey lipidler maruz (Şekil 5 ve 6). arka arkaya sitelerinin bir dizi elde erişilebilirlik parametreler protein protein alanı, bir bölgenin, ikincil yapısını belirlemek araştırmak için kullanılabilirF312R1 olan Şekil 6, bu temas, membranı içinde bir proteinin eğim ölçer ara yüzey döngüler dalma derinliği tahmin edilmesi ve transmembran helisler içindeki su antreler ve lipide bağlı cepler tanımlar. 26, bir örnek olarak, güç doyma eğrileri pozisyonlar F312 yan-zincirleri işaret R296R1 göre O 2 için nispeten yüksek p 1/2, lipid maruz bırakılmıştır. Buna ek olarak, F312R1 da yağ-su ara yüzeyinde konumu ile uyumlu R296R1 göre Niedda daha erişilebilir. Diğer yandan, hücre dışı döngü C bölgesinde L180R1 mobil ve suda maruz döngüde konumu ile uyumlu olarak, Niedda erişilebilir.

Belirli bir pozisyonda prob dinamikleri ve erişilebilirlik verileri genel protein kat içinde belirli konumu hakkında yerel yapısal bilgi sağlar. Al için belirlenen Bu parametrelerprotein boyunca artıkları inear dizisi ayrıca dönüşüm yöntemleri Fourier dayalı analitik yaklaşımlar kullanılarak analiz edilebilir. Bu analizler EPR çevresel parametreler periyodik değişimleri değerlendirmek ve tahmin ve ikincil yapılar yönlendirmede rehberlik yararlıdır. belirli bir protein parçası için bir ayrık Fourier güç spektrum P (ω) o segmentin bitişik konumlarda (ω) arasındaki açının bir fonksiyonu olarak hesaplanır dönüşümü. (- 120 ° 80) ya da β-şerit (150-180 °), bu çizim sonra α-heliks için beklenen (ω) değerlerine spektrumunun temel açısal frekans bileşenini belirlemek için kullanılır ve karşılaştırılır.
denklem 3
burada P ( 'ω') Fourier açısal frekans Ê bir fonksiyonu olarak güç spektrumunun transformudur, n, bölümün kalıntıların sayısıdır, pozisyon çevresel bir parametredir. P ('ω') değeri Ê değerlendirildi alır = Denklem 6 Bu P ( 'ω') maksimize eder.

Bundan başka, bir periyodik endeksi parametre spektrumu toplam alanının edilene belirli bir yapısal elemanı temsil açısı için güç spektrumu altındaki alanın oranı olarak hesaplanır (öngörülen sekonder yapının önemini verir). Bir sürgülü pencere yöntemi başlangıç ​​ve belirli bir sekonder yapı elemanının ucunu belirlemek için kullanılır. Göreceli oryantasyon proteinin geri kalanına göre bu segment P ( 'ω') Şu an yönünde tahmin edilebilir.

α-helix için:

denklem 4

Denklem 5

Bu yöntemler, başarılı bir şekilde üç boyutlu topolojisi tespit ve protein işlevi 14,23,24,41,44-53 temel yapısal değişiklikler tahmin etmek için çeşitli sistemler uygulanmıştır.

EPR uzaklık Dağılımı Belirlenmesi

Inter-alt birimi nitroksid mesafeleri elektron-elektron iki kutuplu etkileşimleri tespit edilebilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, CW-EPR olarak, tamamen-alan iki kutuplu etkileşimleri spektral genişlemesine yol açar ve etiketler arasında yakın bir fonksiyonudur. 20 Å (tam etiketli spektrumları ve altında etiketli spektrumları arasındaki karşılaştırıldığında) genişletmek kapsamı kantitatif yarı kullanarak mesafeleri tahmin etmek için kullanılabilir - ~ 15 kadar olan mesafelerdeFourier Dekonvolüsyonun yöntemleri. 28,29

Arası alt-birimi mesafeleri (<50 a) çift elektron-elektron Rezonans (geyik) yöntemler kullanılarak ölçülebilir. 30-34 geyik verileri deterjan örnekleri toplanır ve çünkü lipozomlar 54 Bu ölçümler ile bağlantılı sınırlamaların nanodiscs içinde yeniden edilir. 0.5 mM DDM ile tampon A içindeki deterjan spin işaretli numuneler (~ 100 | iM) için,% 30 (ağırlık / hacim) gliserol soğuktan koruma maksadıyla kullanılır. Dipolar zaman evrim verileri standart bir geyik dört darbe protokolünü (π / 2) kullanılarak 83 K elde edilir mw1-τ1- (π) mw1-τ1- (π) mw2-τ2- (π) mw1-τ2 eko 55 darbeli EPR spektrometresi Q-bandı frekansı (33.9 GHz) çalışan. (Π / 2) MW1 ve (π) MW1 için atım uzunlukları sırasıyla 10 ve 20 NSEC, ve (π) MW2 40 NSEC. GEYİK sinyaller daha sonra arka plan 3D homojen backgro varsayarak düzeltilirTikhonov regülarizasyonuyla 31,56 ile und analiz mesafe ortalama uzaklıkları ve dağılımlarını belirlemek için.

. GLIC pentamer içinde beş spin etiketleri, en az iki mesafeler beklenen olduğu için pH 7.0'da geyik deney ile tespit M4 (F314R1) ve Örnek pozisyon için molekül içi mesafelerin Şekil 7'de gösterilmiştir; Ek zirveleri alternatif rotamerik sıkma yönelimleri doğabilecek rağmen, komşu alt birimlerinin tekabül eden ve bitişik olmayan alt birimlerden gelen diğeri. GEYİK sinyali çürür ve ilgili olasılık dağılımları gösterilmektedir. İlk kısa mesafe en yüksek (~ 42A) komşu alt-birimler arasındaki mesafe temsil eder ve ikinci bir tepe noktası (~ 53a) bitişik olmayan mesafeye karşılık gelir. diyagonal mesafe için zirve kısa mesafe gibi görünüyor, ve bu 60 Å ötesinde güvenilir ölçümler nedeniyle hafife olması muhtemeldirbağlı arka plan düzeltmesiyle teknik zorluklar deneysel koşullar altında mümkün değildir.

Şekil 1
Şekil 1. Biyokimyasal Karakterizasyonu GLIC Mutants Spin-etiketli. MBP etiketinin proteolitik bölünme sonra spin işaretli-GLIC (A) Örnek jel filtrasyon kromatogramı. zirveleri pentamer ve ücretsiz MBP GLIC karşılık gelmektedir. (B) jel filtrasyonu toplanan kesilmemiş monomerik (jel filtrasyon öncesi) GLIC-MBP füzyon protein ve MBP ve GLIC kesirler gösteren SDS-PAGE. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. FR Çeşitli Membran Lipidler GLIC yeniden birleştirilmesi Devleti İzleme ET Bazlı Tahlil. Ölçümler O / N sulandırıldıktan (solda) sonra ve örnekleri (sağda) / donma çözülme sonra numuneler için gösterilmiştir FRET. (Orijinal rakam Modifiye). 43 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil Proteoliposomes içinde GLIC 3. makroskopik Davranış. Veziküller asolectin yeniden eksize bir iç-out yama, GLIC hızlı çözüm değiştirici kullanarak atlar pH tarafından aktive edilir. 3 sn - Kanallar ~ 10 milisaniye içinde etkinleştirmek ve 1 bir zaman sabiti ile duyarsız görülmektedir. (Orijinal rakam Modifiye). 43ig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Kanal aktivasyon esnasında Şekil 4 yapısal yeniden. (A) pH değişikliklerine yanıt olarak genlik ve hattı şekil değişiklikleri gösteren M2 sarmal astar gözenek bir pozisyon için Örnek CW-EPR spektrası. Her iki durumda da, spektrumları spin sayısı için normalleştirilir. Spin-etiketli pozisyon siyah bir daire olarak gösterilir. Sadece iki alt birimi açıklık için gösterilmiştir. (B) EPRspectra spin-spin etkileşimleri tarafından dipolar genişletilmesi gösterir. kesikli çizgi spektrumları, tam olarak etiketlenmiş kanallardan edildi altında etiketli kanallardan (diamanyetik etiket varlığında) ve katı-doğrultusunda idi. içerlek genlik normalize spektrumları bir kaplamasını göstermektedir. Tam etiketli koşullar altında genişletilmesi yüksektiroklarla ışıklı. Tarama genişliği 150 G. (orijinal şekilden Modifiye). Olan 36 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Güç Doygunluk ile ölçülür Şekil 5. Kalıntı Özgü Çevresel Parametreler. Transmembran etki M4 sarmalın iki zıt pozisyonları için spektral genişliği (AH 0) ve solvent erişilebilirlik (P 1/2) ölçümleri. Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.

Şekil 6,
Şekil 6. Çevre GLIC Ekstraselüler Domain Temsilcisi Döngü C Kalıntı. Spin-normalize CW-spektrumları ve L180R1 için ilgili erişilebilirlik ölçümleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Phe314 yerini gösteren ve komşu ve komşu olmayan alt birimlerin için Cö-Cö mesafeleri gelen darbeli-EPR Yaklaşımlar (geyik). GLIC yapısı Şekil 7. Mesafe Ölçümleri. Bu pozisyon için CW-spektrumları sağda gösterilir. Arka plan çıkarılır Geyik göre- yoğunluk evrim zamana karşı çizilen ve deterjanda numuneler için model ücretsiz Tikhonov düzene kullanarak uygun bir yankı. İlgili arası sıkma mesafesi dağılımı (sağda).Güncelle / 54127 / 54127fig7large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EPR Spektroskopisi yakın bir doğal ortamında membran proteinleri yapısal değişimlere miktarının bir benzeri olmayan yapısal bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Bu yaklaşım bize X-ışını kristalografisi ve Cryo-elektron mikroskobu yüksek çözünürlüklü yapılarda gizlenmiş protein dinamikleri moleküler detaya bir göz sağlar. Ancak, diğer sistemlere genel uygulanabilirliğini etkileyebilecek ve aynı zamanda akılda yol boyunca potansiyel deneysel barikatlar tutmak için bu yaklaşımın teknik sınırlamaları dikkate almak önemlidir. Biz aşağıda sorun giderme için önerilen stratejiler ile birlikte bu yönleriyle tartışacağız.

daha sık karşılaşılan sorunlar arasında yer yoğun mutasyon tedirginlikler düşük verim ve protein zayıf oligomerik kararlılığı vardır kapsayan bir tekniği ile karşılaşır söyledi. Böyle iyon kanalları gibi karmaşık multimerik membran proteinleri ile çalışırken bu yönü daha da şiddetlenir. Bu thyaygın bir mutagenez başlamadan önce, bu iki biyokimyasal olarak optimize etmek için önemli erefore. Toksik GLIC mutantlarının sentezlenmesi daha BL21 hücreleri C41 ve C43 suşları tolere olduğu bulunmuştur 3,36 Ayrıca, 15 sonrası indüksiyon sıcaklığının düşürülmesi -. 18 ° C, 100 uM IPTG konsantrasyonu azaldıkça, ve% 5 gliserol de dahil olmak üzere indüksiyon sırasında protein ekspresyonu hızını yavaşlatan ve asli olarak yanlış katlanma yapımı derecesinin azaltılması ile, muhtemelen protein birikiminin azaltılması ile yardımcı olacak gibi görünüyor. (Özellikle geçiş yolunun olarak) belirli pozisyonlarda sistein mutasyonlar kanal oluşturucu etkinliğini geliştirmek için gösterilmiştir ve bu mutantlar ifade büyük engellerle teşkil olasılığı vardır. Iki değerli gözenek bloker kullanımı (10-25 mM Ba 2+) indüksiyon sırasında toksisite azaltır ve hücre büyümesini geliştirir 57 Bu stratejiler, verim arttırıcı protein birikiminin azaltılması ve oligo geliştirmeyi birçok durumda etkili olduğu kanıtlanmıştır.meric kararlılık. 36,58

SDSL bir diğer önemli bir adım etiketleme işleminin verimliliği. Yüzey maruz sisteinler MTSL reaktivitesi (>% 90 etiketleme verim) hiçbir sorun teşkil etmez iken, sistein yan zincirler gömülü ve ulaşılmaz olan pozisyonları yüksek spin-etiket konsantrasyonları ve daha uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. 30-kat molar fazladır spin etiket konsantrasyonu artar ve O inkübe / 4 ° C'de N markalama verimliliğini artırmak yardımcı olur. Buna ek olarak, arka katkısının belirlenmesi için işaretlenmiş Cys-az şablonun spektrumunu ölçmek için de önemlidir. kötü etiketlenmiş siteler (<% 10) için, arka plan sinyali genel spektrumları bunaltıyor. spin-etiketleme verimliliği belirlenirken, doğruluk örnek hacmi, numune kılcal çapı, rezonatör içindeki kılcal konumlandırma, kovuk sıcaklığını ve rezonatör Q içeren bir dizi faktöre etkilenir unutmayındeğeri (üzerinde enerji içinde depolanan enerji oranıdır dışarıya atılmaktadır). Bakım örnekleri ve standartları arasında aynı Bu koşulları sağlamak için özen gösterilmelidir. Bundan başka, spektrumu içsel geniştir hareketsiz siteler için, etiketleme ölçüm hassasiyeti daha damla unutulmamalıdır. Alternatif olarak, Uçak-elektrosprey iyonlaştırmalı kütle spektrometresi (LCT ESI-MS) Sıvı Kromatografi zaman doğrudan moleküler kütlesi ve dolayısıyla etiketleme verimliliğini belirlemek için kullanılabilir. Ancak, MS duyarlılık deterjanlarda ve sıkıca katlanmış membran proteinlerinin için numuneler için tehlikeye düşer.

mutantlar, homojen bir popülasyon olarak saflaştırılır sonra, hazırlık özelliğe tespit etmek önemlidir. Kanalın kilit bölgelerinde spin işaretli mutantların yama-kelepçe ölçümleri ligand afinite ve kanal yolluk üzerinde pertürbasyon etkisini ortaya çıkaracaktır. Seçenek olarak ise, kanal özellikleri Siyah L incelenebilirIPID Zarlar (BLM) 59 ya da sistein ikamesi ve belli pozisyonlarda spin-etiket ligand-hassasiyeti veya yolluk kinetik değiştiren bulunursa iki elektrotlu voltaj kelepçe ile akımları. 59-61 oosit içine proteoliposomes enjekte ve ölçerek Kanallar, deneysel koşullar (ligand konsantrasyonu, modülatörleri, lipidler bileşimi) araştırılmaktadır oluşum durumunu dengelemek için uygun bir şekilde değiştirilebilir. Bundan başka, bu EPR ölçümler kararlı hal şartları altında yapılmıştır ve bu nedenle, yapısal yorumlanması etkisi daha az olan kanalın hızlı kinetiği değişiklikler olduğu not edilmelidir.

Açıktır ki, bu tekniğin önemli bir avantajı tarif bileşimin membran kanal dinamiklerini incelemek için doğrudan dinamiklerine lipid aracılı etkiler kanalı fonksiyonunu bozan kadar prob yeteneğidir. Bununla birlikte, bir sınırlama bazı lipid bileşimleri, kanallar o yanal toplanmasına neden olmasıdırn, membran ve dolayısıyla lipid uygunluğu tespit edilmesi gerekmektedir. 45 çünkü toplama yapılacak koşullar için, protein-to-lipit oranını düşürücü düşük bir sıcaklıkta yeniden oluşturma işlemleri ve Yeniden oluşturma süresinin süresinin kısaltılması kanalları korumada yardımcı olabilir Tek dağılımlı 62 Alternatif olarak, programlar, program protein, yağ bileşenleri ve membran iskele protein molar oranı optimize ederek amfipatik membran skafold protein (apolipoprotein A1). 63 bir halka ile çevrili nano lipit düzenekleri olan nanodiscs, içinde yeniden edilebilir bireysel nanodiscs dahil tek kanallı birimlerinin homojen ve mono-dağılımlı bir popülasyonu elde etmek mümkündür. Bu sistem, nanodiscs optik olarak berrak ve hücre içi ve zar-dışı tarafına hem de kolay erişim sağlamak birçok ek avantajları vardır.

Son olarak, seviyedeEPR ölçümlerin bir özellikle çok bileşenli spektrumları görüntüleme pozisyonlar için, yorumlamak kolay olmadığını CW-EPR spektrumları ile karşı karşıya olabilir. Bu tür biçim alma heterojenlik yavaş belirli bir protein konformasyonu protein ve / veya yan etiketin birden fazla yönelimlerinin konformasyonlar alışverişi ortaya çıkabilir. Iki senaryo göreceli katkısını belirlemek önemsiz değildir ve alternatif spin-etiket türevleri veya değişen deneysel sıcaklık, 64 basınç, 65 alan kuvvetleri / mikrodalga frekansı, 66 veya osmolite pertürbasyon tarafından kullanılması gerekebilir. 67

Ayrıca, lipozomlar içinde DEER ölçümleri daha düşük hassasiyet, gelişmiş moleküller arası etkileşimler kaynaklanan yüksek arkaplan katkısı ve ölçülebilir mesafe aralığı (<50a) bir azalma gibi faktörlerin bir dizi ile sınırlı olabilir. Genel olarak, daha uzun mesafeleri (<50) için büyük oradayetersiz olması nedeniyle dipolar evrim kez mesafe dağılımı genişlikleri er belirsizlik. Ancak, (azaltılmış içsel dinamikleri ile) iki fonksiyonlu sıkma etiketi Q bandının (34 GHz) mikrodalga frekansı ve etiketleme kullanımı bu sınırlamaları hafifletmek için gösterilmiştir. Nanodiscs 54 sulandırılması da müthiş tarafından DEER duyarlılığını artırmak için gösterilmiştir moleküller arası iki kutuplu etkileşimler kaynaklanan arkaplan katkıları azalan. 15

Özellikle birkaç yerli sistein sistemlerde bu sınırlamalar, SDSL / EPR çalışmalar rağmen, son derece bilgilendirici olduğu kanıtlanmıştır. Gelecekteki teknolojik gelişmeler mutasyona yerli sisteinler mümkün olmayabilir daha karmaşık insan kanalları, incelemek için bu güçlü bir yaklaşım adapte yöneliktir. Bu bağlamda, alana özgü Doğal olmayan amino asitlerin dahil edilmesi, 68 ya da Synt göre bu gibi alternatif etiketleme stratejilerinin geliştirilmesidiğer amino asitlere karşı hedeflenen etiket nüklerde, 69 büyük umutlar tutmak için görünür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz yazının kritik okuma ve yorumlar için Chakrapani laboratuar mevcut ve eski üyeleri için çok müteşekkiriz. Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (1R01GM108921) ve Amerikan Kalp Derneği (NCRP Scientist Kalkınma Hibe 12SDG12070069) tarafından ve SC desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations
10x PfuUltra HF reaction buffer Agilent Technologies 600380-52
dNTPS New England BioLabs Inc‎ N0447L 10 mM each dNTP
pfu Ultra DNA polymerase Agilent Technologies 600380-51 2.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎ R0176S 20,000 U/ml
XL10 GOLD Agilent Technologies 200314
SOC media New England BioLabs Inc‎ B9020S
Kanamycin Fisher Scientfic BP905
LB media Invitrogen 127957084
Miniprep kit QIAGEN 27106
C43 competent cells Lucigen 60446
Expression and Purification
Glucose Fisher Scientfic D16
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421-500
Yeast extract Amresco J850
Glycerol Fisher Bioreagents BP229
K2HPO4 Amresco 0705
K2HPO4 Amresco 0781
IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) Gold Biotechnology I2481C25
Trizma Base Sigma Life Science T1503
NaCl Sigma-Aldrich S7653
DNase I Sigma Life Science DN25
PMSF Amresco M145
Leupeptine Amresco J580
Pepstatin Amresco J583
DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
Amylose resin New England BioLabs Inc‎ E8021L
TCEP Amresco K831
EDTA Fisher Scientfic BP118
Maltose Acros Organics 329915000
Superdex 200 GL GE Healthcare 17-5175-01
Empty polypropylene Chromatography column BioRad 731-1550
Site-Directed Spin Labeling
MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc O873900
(1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate Toronto Reaserch chemicals Inc A167900
DMSO J.T. Baker 9224-01
Reconstitution
Asolectin lipid Avanti polar lipids Inc 541602C
Biobeads (Polystyrine beads) Bio Rad 152-3920
Methanol Fisher chemicals A413
FRET
Fluorescein-maleimide ThermoFisher Scientific F-150
Tetramethylrhodamine-maleimide ThermoFisher Scientific T-6027
POPC Avanti polar lipids Inc 850457C
POPG Avanti polar lipids Inc 840457C
E.coli polar lipid extract Avanti polar lipids Inc 100600C
HEPES Sigma Life Science H3375
EPR measurement
TPX plastic capillaries Bruker ER221
EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) Aldrich 158186
Ni(OH)2 Aldrich 283622

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4 (2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452, (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457, (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474, (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512, (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512, (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25, (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284, (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259, (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23, (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27, (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7, (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102, (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16, (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52, (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4, (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248, (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89, (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40, (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124, (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86, (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457, (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287, (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94, (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38, (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38, (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287, (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16, (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88, (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47, (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158, (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5, (10), e271 (2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30, (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289, (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11, (11), e1001714 (2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288, (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23, (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46, (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584, (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281, (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51, (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (39), 9108-9111 (2011).
Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).More

Basak, S., Chatterjee, S., Chakrapani, S. Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels. J. Vis. Exp. (113), e54127, doi:10.3791/54127 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter