Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) इमेजिंग वास्तविक समय कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां शारीरिक तीन आयामी (3 डी) हाइड्रोजेल पारंपरिक epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग microenvironments में झल्लाहट इमेजिंग कोशिकाओं के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। कि सक्रियण सीमा से अधिक रैखिक अनुपात की पैदावार ratiometric झल्लाहट जांच के लिए एक विश्लेषण में वर्णित है।
Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) की इमेजिंग वास्तविक समय में कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। झल्लाहट का उपयोग अध्ययन में आमतौर पर दो आयामी (2 डी) संस्कृति है, जो तीन आयामी (3 डी) सेलुलर microenvironment की नकल नहीं है रोजगार। बुझती उत्सर्जन झल्लाहट इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक 3 डी हाइड्रोजेल पर्यावरण के भीतर कोशिकाओं की पारंपरिक widefield epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक विधि प्रस्तुत किया है। यहाँ है कि जांच के सक्रियण सीमा से अधिक रैखिक अनुपात की पैदावार ratiometric झल्लाहट जांच के लिए एक विश्लेषण विधि वर्णित है। intracellular चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) के स्तर का मापन, EPAC1 सक्रियण (ICUE1) और हाइड्रोजेल सामग्री के प्रकार, इस के साथ साथ एक photocrosslinking हाइड्रोजेल (पीसी-जेल पर निर्भर संकेत शिविर में अंतर का पता लगाने की क्षमता के लिए forskolin उत्तेजना के तहत chondrocytes एक जांच का उपयोग में प्रदर्शन किया है पॉलीथीन ग्लाइकोल dimethacrylate) और एक thermoresponsive हाइड्रोजेल (TR-जेल)। 2 डी झल्लाहट के तरीकों के साथ तुलना में,इस विधि थोड़ा अतिरिक्त काम की आवश्यकता है। प्रयोगशालाओं पहले से ही 2 डी में झल्लाहट इमेजिंग का उपयोग आसानी से एक 3 डी microenvironment में सेलुलर अध्ययन करने के लिए इस विधि को अपनाने कर सकते हैं। यह आगे इंजीनियर 3 डी microtissues में उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह इस तरह के anisotropy माप और प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (flim), के रूप में और उन्नत माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों confocal का उपयोग कर, स्पंदित, या संग्राहक रोशनी के साथ झल्लाहट इमेजिंग के अन्य रूपों के साथ संगत है।
सेलुलर संकेत दोनों जटिल और औषध विज्ञान, ऊतक इंजीनियरिंग, और पुनर्योजी चिकित्सा सहित कई क्षेत्रों के लिए परिणामी है। उपयोगी अनुसंधानात्मक उपकरण कोशिका जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे करने के लिए और ऊतक उत्थान के लिए इष्टतम सामग्री को विकसित करने की जरूरत है। Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) इमेजिंग रिसेप्टर सक्रियण, आणविक रचना, और supramolecular बातचीत (जैसे।, प्रोटीन / डीएनए complexation) जीवित कोशिकाओं में के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण है। झल्लाहट fluorophores 1 के बीच गैर विकिरणवाला ऊर्जा हस्तांतरण का एक प्रकार है। यह एक दक्षता कि व्युत्क्रमानुपाती एक दाता fluorophore और स्वीकर्ता fluorophore के बीच की दूरी के छठे सत्ता में आनुपातिक है। (- 10 एनएम आम तौर पर 1) 2 प्रकार, यह दो अलग अलग अणुओं के बीच या nanometer पैमाने पर एक अणु के क्षेत्रों में स्थानिक दूरी के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। दाता और स्वीकर्ता fluorophores अलग मीटर हो सकता हैolecule प्रकार (असमलैंगिक झल्लाहट), जिसमें दाता उच्च ऊर्जा उत्सर्जन (छोटी तरंग दैर्ध्य) है, या एक ही प्रकार के (होमो-झल्लाहट)। झल्लाहट इमेजिंग निश्चित या जीवित कोशिकाओं पर किया जा सकता है, लेकिन सामान्य तौर पर तय कोशिकाओं जब उच्च गति confocal सिस्टम उपलब्ध नहीं हैं उच्च स्थानिक संकल्प पर आणविक बातचीत की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जीवित कोशिकाओं में इस तरह की प्रतिक्रिया 3 संकेत वास्तविक समय intracellular के रूप में बातचीत और प्रक्रियाओं है कि हिचकते हैं या निर्धारण से बदल रहे हैं, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
लाइव सेल अध्ययन बताते हैं कि रोजगार सादगी और कम पृष्ठभूमि (विमान कोशिकाओं के बाहर से कोई उत्सर्जन) की वजह से भाग में इमेजिंग का उपयोग दो आयामी (2 डी) सेलुलर संस्कृतियों झल्लाहट। हालांकि, 2 डी संस्कृतियों भी शारीरिक microenvironment और तीन आयामी (3 डी) संस्कृति 4,5 की तुलना में कई सेलुलर प्रक्रियाओं में परिवर्तन। उदाहरण के लिए, सेल और बाह्य मैट्रिक्स बातचीत करने के लिए सेल का निवासी सेल काफी ईएएस के लिए अग्रणी 2 डी संस्कृति में बदल रहे हैंily सेल आकृति विज्ञान और polarity 6 में परिवर्तन मनाया। झिल्ली microdomains (जैसे।, Caveolae और लिपिड राफ्ट) और रिसेप्टर संकेतन जोरदार संस्कृति के माहौल में भाग द्वारा विनियमित रहे हैं, क्योंकि वे बाँध cytoskeletal घटकों 7,8 और सेल आकार और cytoskeletal संरचना जोरदार स्थानिक संस्कृति पर्यावरण 9 द्वारा विनियमित रहे हैं। Mechanotransduction केवल 3 डी मैट्रिक्स से प्रभावित नहीं है, लेकिन और अधिक जटिल माध्यमिक लदान की स्थिति से 2 डी संस्कृतियों 10 की तुलना में 3 डी वातावरण में engendered। अंत में, 3 डी matrices के पारगम्यता प्रसार में कमी आई है और 2 डी संस्कृतियों की तुलना में संकेतन अणुओं सेल के बंधन में वृद्धि हुई है के साथ सामान्य में संस्कृति के माध्यम से भी कम है। 3 डी संस्कृतियों के साथ एक बना सकते हैं और चिपकने वाला, रासायनिक और यांत्रिक संकेतों के संबंध में शारीरिक करने के लिए और अधिक समान एक microenvironment निरीक्षण करने के लिए सक्षम है। सेल बातचीत करने के लिए सेल को बढ़ावा दिया जा सकता है और चिपकने वाला गुण डब्ल्यू नियंत्रित किया जा सकताith संरचना, संरचना, और 3 डी सामग्री 11-13 की वास्तुकला (patterning)। सामग्री के यांत्रिक गुणों इसी तरह की संरचना और संरचना 14,15 द्वारा अनुरूप किया जा सकता है। हाइड्रोजेल में संवर्धन कोशिकाओं इसलिए परमिट प्राथमिक कोशिकाओं है कि अन्यथा डे के अंतर होगा या पारंपरिक तकनीक का उपयोग कर phenotype में परिवर्तन, जैसे पर अध्ययन झल्लाहट।, जोड़ कार्टिलेज से कोशिकाओं। इस प्रकार, एक विधि जीना 3 डी संस्कृतियों में झल्लाहट assays सक्षम करने के लिए की जरूरत है।
क्योंकि वे ऑप्टिकली पारदर्शी बनाया जा सकता है और microenvironment को नियंत्रित करने और सेलुलर संकेतों प्रदान करने के लिए रुझान हाइड्रोजेल scaffolds 3 डी झल्लाहट आधारित अध्ययन के लिए आदर्श होते हैं। प्राकृतिक पॉलिमर से बने हाइड्रोजेल दशकों, जिलेटिन और आतंच 16 सहित के लिए सेल संस्कृति में इस्तेमाल किया गया है। सेलुलर microenvironment पर अधिक नियंत्रण इन पॉलिमर की रासायनिक संशोधन के साथ और सिंथेटिक पॉलिमर 17,18 के उपयोग के साथ प्राप्त किया जा सकता है। hydrयांत्रिक कठोरता ogel और पारगम्यता उनकी बहुलक संरचना को बदलने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है और आकार (पॉलिमर और Crosslink घनत्व) 19,20 जाल। इसके अलावा, हाइड्रोजेल वृद्धि कारक है और सेलुलर ligands के समावेश के माध्यम से बायोएक्टिव बनाया जा सकता है। क्योंकि इन संभावनाओं की, biosensing, दवा वितरण, और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए हाइड्रोजेल के विकास अनुसंधान 21 साल की एक बहुत सक्रिय क्षेत्र है। हाइड्रोजेल की 3 डी प्रिंटिंग भी सूक्ष्म ऊतकों के निर्माण के लिए विकास के दौर से गुजर रहा है और -organs 15 है। इस प्रकार, हाइड्रोजेल में कोशिकाओं की झल्लाहट इमेजिंग शारीरिक सेलुलर व्यवहार लगभग करने के लिए एक साधन के रूप में न केवल उपयोगी है, लेकिन यह भी अध्ययन और इंजीनियर ऊतक विकास अनुकूलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में है।
बाइनरी ratiometric झल्लाहट जांच सेलुलर संकेत का अध्ययन करने में बहुत उपयोगी होते हैं और हाइड्रोजेल संस्कृतियों में उपयोग किया जा सकता है। प्रकाशित फ्लोरोसेंट की एक आंशिक सूची के लिए और जांच झल्लाहट, सेल प्रवास कंसोर्टियम वेबसाइट देखें <sup> 22। सबसे आम प्रकार की जांच के लिए दो अलग अलग fluorophores कि संबद्ध या मान्यता तत्व (एस) (analyte संवेदनशील क्षेत्र) से जुड़े हुए हैं शामिल हैं। इन क्षेत्रों में एक गठनात्मक परिवर्तन, संघ, या analyte का पता लगाने पर disassociation गुजरना (जैसे।, एक आयन या अणु है, इस क्षेत्र के enzymatic दरार के बंधन) कि fluorophores और इसलिए झल्लाहट परिमाण (या तो अधिक या कम) के बीच की दूरी को बदल 23। एक कम आम अभी तक उपयोगी जांच प्रकार दो fluorophores के वर्णक्रम ओवरलैप करते हैं, जो झल्लाहट परिमाण बदल में एक analyte संवेदनशील परिवर्तन पर निर्भर करता है। "एकल श्रृंखला" ratiometric जांच एक fluorophore जोड़ी एक अणु पर लिंक का उपयोग। "दोहरे श्रृंखला" जांच अलग अणुओं पर fluorophore जोड़े का उपयोग, लेकिन उनकी अभिव्यक्ति ही अभिव्यक्ति कैसेट 24 के तहत मिलकर किया जा सकता है। एकल fluorophore अभिव्यक्ति के साथ अध्ययन (उदा।, फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन), पढ़ाई के साथ विपरीत ratiometricझल्लाहट जांच अभिकर्मक दक्षता या सेल व्यवहार्यता के लिए नियंत्रित करने के लिए दोहरी अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं है। Ratiometric झल्लाहट जांच अपेक्षाकृत अभिकर्मक दक्षता के प्रति असंवेदनशील है जब एक न्यूनतम सीमा (एकाग्रता असंवेदनशील) 23,25 ऊपर व्यक्त कर रहे हैं। वे उत्तेजना स्रोत उतार चढ़ाव और अन्य intracellular पर्यावरण कारकों (जैसे।, पीएच, आयनों) इतने लंबे समय के रूप में दोनों fluorophores इसी तरह से जिम्मेदार हैं असंवेदनशील हैं। इसके अलावा, उनकी प्रतिक्रिया नहीं ट्रांसक्रिप्शनल देरी के अधीन, के विपरीत फ्लोरोसेंट और bioluminescent प्रमोटर संवाददाता constructs 26,27 है।
Ratiometric झल्लाहट जांच आसानी से और अक्सर पारंपरिक widefield epifluorescence खुर्दबीन सिस्टम में कार्यरत हैं। विदेफीएल्ड सूक्ष्मदर्शी क्योंकि प्रणाली लागत, fluorophore विरंजन, और पर्याप्त अस्थायी समाधान के साथ संकेत परिवर्तन का कब्जा को लेकर चिंता का जीना सेल इमेजिंग के लिए लाइन स्कैनिंग confocal प्रणालियों से अधिक पसंद कर रहे हैं। इसके अलावा, एकल कोशिका गुदाकोशिकाओं की एक बड़ी आबादी पर विश्लेषण देखने के कई क्षेत्रों से अधिक एक मोटर चालित मंच और छवि पर कब्जा के साथ संभव है। विदेफीएल्ड माइक्रोस्कोपी असमलैंगिक झल्लाहट जांच संकेतों की तीव्रता के आधार पर विश्लेषण की आवश्यकता है। हालांकि तीव्रता विश्लेषण अन्य झल्लाहट के तरीकों की तरह जटिल हार्डवेयर की आवश्यकता नहीं है, और अधिक अधिग्रहण के बाद काम fluorophore व्यवहार और माइक्रोस्कोप / इमेजिंग सिस्टम विन्यास 28 के प्रभाव के लिए सही करने के लिए की जरूरत है। एक fluorophore का कब्जा कर लिया उत्सर्जन तीव्रता उत्तेजना ऊर्जा के एक समारोह में, fluorophore क्वांटम उपज, और संयुक्त फिल्टर और कैमरा / डिटेक्टर वर्णक्रमीय संवेदनशीलता और linearity 2 है। ये दाता और स्वीकर्ता के लिए भिन्न हो सकता है और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अंशांकन की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, स्वीकर्ता उत्सर्जन की इमेजिंग (दाता उत्तेजना प्रकाश द्वारा स्वीकर्ता की उत्तेजना और खून के माध्यम से दाता उत्सर्जन की स्वीकर्ता उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में) fluorophores के वर्णक्रमीय ओवरलैप से प्रभावित है 2।4; एकल श्रृंखला "जांच के आंतरिक रूप से सामान्यीकृत क्योंकि उनके fluorophores nanoscale पर equimolar हो रहे हैं, जबकि fluorophores" दोहरे श्रृंखला "जांच के लिए एक सेल 25,28 भर में विभिन्न stoichiometries में मौजूद हो सकता है यदि fluorophores।" एकल श्रृंखला " जांच के समान चमक (विलुप्त होने के गुणांक और क्वांटम उपज का समारोह), गैर रेखीय डिटेक्टर संवेदनशीलता के प्रभाव पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और मिलकर क्वांटम उपज / डिटेक्टर संवेदनशीलता 23 की जरूरत है के लिए छोटे और केवल सुधार कर रहे हैं की कर रहे हैं। इस प्रकार "एकल श्रृंखला" ratiometric झल्लाहट जांच सबसे आसानी से widefield माइक्रोस्कोपी 24 में लागू कर रहे हैं।
यह पत्र एक पारंपरिक widefield epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 3 डी हाइड्रोजेल संस्कृतियों में जीवित कोशिकाओं की झल्लाहट इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक सरल तकनीक का वर्णन है। यह आसानी से पहले से ही 2 डी में झल्लाहट प्रयोगों, साथ ही इंटर में रुचि प्रयोगशालाओं से बाहर ले जाने प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया जा सकता हैmicrotissues में सेलुलर संकेत। यहाँ हम चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) photocrosslinking भीतर लाइव chondrocytes में स्तरों (पीसी-जेल, पॉलीथीन ग्लाइकोल dimethacrylate) और thermoresponsive (TR-जेल, Matrigel) हाइड्रोजेल की झल्लाहट इमेजिंग आधारित माप के साथ विधि का प्रदर्शन। एक ratiometric झल्लाहट जांच EPAC1 (ICUE1) पर आधारित forskolin, जो शिविर में एटीपी के रूपांतरण उत्प्रेरित adenylyl साइक्लेज के लिए एक रासायनिक एगोनिस्ट के जवाब में शिविर स्तर का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। शिविर प्रिंसिपल दूसरा दूत मध्यस्थता जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर संकेतन में से एक है और यह नीचे की ओर विनिमय प्रोटीन सीधे शिविर (EPACs) द्वारा सक्रिय सहित विभिन्न कारकों को सक्रिय करता है। fluorophores शिविर EPAC डोमेन झल्लाहट में कमी के परिणामस्वरूप के लिए बाध्य पर अलग चाल। यहाँ वर्णित हाइड्रोजेल सामग्री की तैयारी, ICUE1 जांच के साथ सेल अभिकर्मक, और 3 डी हाइड्रोजेल में कोशिकाओं के embedding है। 3 डी झल्लाहट प्रयोग प्रक्रिया और छवि विश्लेषण आवश्यकमूल्यांकन करने के लिए सेल प्रति जांच गतिविधि समझाया जाता है। हम यह भी 2 डी और 3 डी में झल्लाहट विश्लेषण के निहित सीमाओं widefield माइक्रोस्कोपी का उपयोग पर चर्चा की। यहाँ प्रस्तुत तकनीक मौजूदा 2 डी के तरीकों पर एक सुधार के बाद से यह एक और अधिक शारीरिक संदर्भ में विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है और कम छवि सुधार और अंशांकन की आवश्यकता है। महान उपयोगिता तथ्य यह है कि कई पारदर्शी सामग्री, जबकि सेल और अभिकर्मक वरीयताओं को बनाए रखा जा सकता का इस्तेमाल किया जा सकता है में निहित है।
इस काम दर्शाता है कि कैसे झल्लाहट इमेजिंग 3 डी हाइड्रोजेल में सेलुलर संकेत विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पूर्व के अध्ययन हाइड्रोजेल 38 के साथ कोशिकी बातचीत की, हाइड्रोजेल substrates 35-37 पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की झल्लाहट इमेजिंग का प्रदर्शन किया है, और हाइड्रोजेल 39-41 में फंस अणुओं की, वहीं इस के भीतर एम्बेडेड कोशिकाओं की झल्लाहट इमेजिंग आधारित intracellular विश्लेषण वर्णन करने के लिए पहला प्रकाशन है 3 डी हाइड्रोजेल। काम जब 2 डी से 3 डी झल्लाहट इमेजिंग का अनुवाद करने के लिए कई कार्यान्वयन के मुद्दों को हल करती है। सबसे पहले, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों के लिए पर्याप्त उत्सर्जन संकेत इकट्ठा करने के लिए झल्लाहट इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं, लेकिन वे क्षेत्र की गहराई की सीमा। यहाँ कोशिकाओं थोड़ा इस के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कांच के पास एक फोकल हवाई जहाज़ में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए centrifuging के माध्यम से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी जाती है। दूसरा, 3 डी हाइड्रोजेल scaffolds इमेजिंग जो विश्लेषण पेचीदा दौरान देखने के क्षेत्र भर में बहाव हो सकता है। यहाँ हाइड्रोजेल cov को बंधुआ रहे हैंerslip वे प्रयोग भर में रहना तय है कि इतनी। तीसरा, 3 डी झल्लाहट के लिए उचित हाइड्रोजेल रचनाओं का चयन आवश्यक है क्योंकि हाइड्रोजेल कोशिकाओं के दृश्य में बाधा हो सकती है। पीसी-जेल और टी.आर. जेल के यहाँ पारदर्शी हाइड्रोजेल किया जाता है। हालांकि, coverslip के पास एक फोकल हवाई जहाज़ के centrifugation साथ कोशिकाओं को एकत्र करने के साथ उच्च हाइड्रोजेल की diffraction.The पसंद microenvironment की स्थिति है कि नकली जाना चाहिए, हाइड्रोजेल 42 पर एक समीक्षा में पाया जा सकता है पर निर्भर करता है हाइड्रोजेल में छवि कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता । चौथा, एक वैकल्पिक गणना यहाँ एकल श्रृंखला ICUE1 जांच की झल्लाहट अनुपात (यानी, ई QE = QE / cAem) छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक चैनलों की संख्या को कम करने के लिए और इस तरह photobleaching कम से कम के लिए कार्यरत है। सेल के प्रति औसत झल्लाहट अनुपात वास्तविक अनुपात झल्लाहट के मूल्यवान समझना कम करने के लिए एक कोशिका के भीतर पिक्सेल प्रति अनुपात की औसत के रूप में गणना की है। अंत में, एक रेखीय ratiometric विश्लेषण और साधनएकल श्रृंखला बाइनरी जांच के सक्रिय अंश गणना करने के लिए वर्णित है।
वहाँ widefield माइक्रोस्कोपी का प्रयोग सफल झल्लाहट प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए कई महत्वपूर्ण पहलू हैं। हार्डवेयर के लिए सम्मान के साथ, कैमरा छोटे संकेत परिवर्तनों को हल करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील होना चाहिए, नए वैज्ञानिक CMOS कैमरों और इलेक्ट्रॉन गुणा CCDs बेहतर पारंपरिक CCDs से अनुकूल छोड़ने। सबसे अच्छा झल्लाहट अनुपात के स्थानिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए, कैमरा कम से कम दो बार उद्देश्य (Nyquist कसौटी) की बात फैल समारोह के स्थानिक संकल्प में होने चाहिए। इस दोहरे विचार प्रणाली कम काम करने के अनुकूल बनाता है। अधिक महत्वपूर्ण के रूप में तो fluorophores के photobleaching कम से कम करने के लिए दिया झल्लाहट जोड़ी के लिए एक उचित जोखिम और छवि अधिग्रहण दर का चयन करने के लिए है। एक कम दर अधिग्रहण प्रयोग की अवधि बढ़ जाती है के रूप में सिफारिश की है। तेजी से फिल्टर पहियों के उपयोग के अधिग्रहण की दर और विश्लेषण करते हुए बचने के लिए FOVs की संख्या बढ़ जाती हैदोहरे देखें और बुर्ज फिल्टर घन के साथ छवि पंजीकरण मुद्दों हैैं। inhomogeneous रोशनी क्षेत्र पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कि नमूना autofluorescence और कैमरा प्रणाली शोर से उठता है के लिए सुधार पेचीदा हो। कुछ हाइड्रोजेल, विशेष रूप से श्लेषजनउत्पादी प्रोटीन युक्त उन अत्यधिक autofluorescent 43,44 हैं। झल्लाहट अनुपात की पृष्ठभूमि सुधार के बिना कम करके आंका जाता है। यहाँ हम एक साधारण पृष्ठभूमि सुधार तरीका है कि अपेक्षाकृत सपाट रोशनी क्षेत्र है जो अक्सर छवि (चित्रा 3 बी, चरण 7.2) के केंद्र पर महामारी प्रतिदीप्ति रोशनी के साथ विन्यस्त किया जा सकता है पर निर्भर करता है रोजगार। इस विधि इसलिए इस रोशनी के क्षेत्र के भीतर उन लोगों के लिए ब्याज की कोशिकाओं को प्रतिबंधित। पृष्ठभूमि यहाँ वर्णित सुधार तरंग दैर्ध्य बाइनरी जांच के लिए पढ़ें में सेलुलर autofluorescence के लिए खाते में नहीं है। ऐसे एक मामले में, लेबल हटाया गया कोशिकाओं (कोई जांच अभिकर्मक) एक ही स्थिति और पृष्ठभूमि घटाया तहत imaged किया जाना चाहिए। एक मीटरलेबल और लेबल हटाया गया कोशिकाओं की नौवीं इस्तेमाल किया जा सकता है और लेबल हटाया गया कोशिकाओं पृष्ठभूमि रॉय के लिए चयन किया। वैकल्पिक तरीकों जो पूरी छवि क्षेत्र से अधिक सेल विश्लेषण के लिए प्रदान कोशिकाओं के बिना समान नमूने एक छायांकन मुखौटा का उपयोग करते हैं, कई पृष्ठभूमि ROIs, या में शामिल हैं और एक प्रोटोकॉल अनुरोध पर उपलब्ध है।
3 डी इमेजिंग झल्लाहट के लिए विशिष्ट, जांच प्रतिक्रिया अत्यधिक analyte (चित्रा 6) को हाइड्रोजेल पारगम्यता के प्रति संवेदनशील है। इसलिए एक ही हाइड्रोजेल क्षेत्रों ऐसी पाड़ केंद्र के रूप में यहां इस्तेमाल किया निकट के रूप में अधिमानतः ज्यामिति समरूपता का एक बिंदु पर प्रयोगात्मक उपचार भर में तुलना कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, microfluidic कक्षों / बायोरिएक्टर तेजी से और समान रूप से analyte समाधान 45 के साथ हाइड्रोजेल छिड़कना लिए नियोजित किया जा सकता है। एक झल्लाहट संकेत नहीं पाया जा सकता है (शोर अनुपात करने के लिए संकेत बहुत कम है) जब हाइड्रोजेल के autofluorescence बहुत अधिक है; एक पतली हाइड्रोजेल या अलग अलग जांच (विभिन्न fluorophores) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।photocrosslinked हाइड्रोजेल में 3 डी इमेजिंग झल्लाहट करने के लिए सम्मान के साथ, कम से कम विकिरण जोखिम और जांच fluorophores की उत्तेजना स्पेक्ट्रम के बाहर तरंग दैर्ध्य के उपयोग की सिफारिश की है। एलएपी 405 एनएम पर एक दृश्य प्रकाश स्रोत के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है आगे संभावित सेलुलर क्षति 31,46 कम से कम। हालांकि, 365 एनएम विकिरण के साथ एलएपी का उपयोग कर सिफारिश की है क्योंकि इस जांच विरंजन को कम करता है। जबकि 405 एनएम पीक उत्तेजना पर स्थित 365 एनएम, CFP दाता उत्तेजना स्पेक्ट्रम की पूंछ के अंत में निहित है। वैकल्पिक रूप से, जांच अभिव्यक्ति एक दिन के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी जा सकती है। बाइनरी जांच के उपयोग अभिव्यक्ति के स्तर में और दाता और स्वीकर्ता fluorophores की आणविक प्रसार में मतभेद के प्रति संवेदनशीलता के मुद्दों को कम करता है। गैर-बाइनरी जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इसके बजाय के एसई QE इमेजिंग और उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के वर्णक्रम खून के माध्यम से करने के लिए अतिरिक्त सुधार के साथ (नीचे देखें)। इसके अलावा, कम वाणिज्यिक उपलब्धता और झल्लाहट जांच को डिजाइन करने में जटिलताएक बाधा हो सकती है। सफल प्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक प्रतिदीप्ति संकेतों के समुचित सुधार और विश्लेषण बनी हुई है।
झल्लाहट अनुपात की गणना एक वैकल्पिक photobleaching के न्यूनतम इसके अलावा कई अतिरिक्त कारणों के लिए उपयोग किया जाता है। बाइनरी एकल श्रृंखला जांच के लिए, आमतौर पर सूचना दी अनुपात दाता उत्सर्जन करने के लिए दाता उत्तेजना (अवगत उत्सर्जन, एसई) दाता उत्तेजना (बुझती उत्सर्जन, क्यूई), यानी तहत स्वीकर्ता उत्सर्जन है, अनुपात = एसई / QE 25,47,48 झल्लाहट। एसई / QE गैर रेखीय झल्लाहट दक्षता 21,22,47 में परिवर्तन करने के रिश्तेदार है। अर्थात्, अनुपात लगभग 15% से भी कम समय के लिए Ei अनुपात सबसे रैखिक के साथ जांच (ईआई) के निहित झल्लाहट दक्षता के लिए एक तेजी से गैर रेखीय रिश्ता है (Donius, एई, Taboas, जेएम अप्रकाशित काम करते हैं। (2015))। एसई / QE भी सक्रिय जांच (FAP, यानी, बाध्यकारी analyte जांच के अंश) के अंश बहुत मूल्यवान समझना होगा। therefoफिर से, एसई / QE के विश्लेषण एक बोझिल संतुलन खुराक प्रतिक्रिया का अध्ययन करने और वक्र फिट की आवश्यकता है। सौभाग्य से, स्वीकर्ता उत्तेजना के तहत स्वीकर्ता उत्सर्जन करने के लिए एसई या त्वरित अनुमानों के अनुपात (AEM) Ei और FAP, यानी करने के लिए सम्मान के साथ रैखिक हैं, झल्लाहट अनुपात के एसई / AEM और QE / AEM। एसई / AEM अक्सर बाइनरी जांच के लिए प्रयोग किया जाता है और केवल (कोई जांच गतिविधि और पूर्ण जांच गतिविधि पर) अंत बिंदु अंशांकन आवश्यकता है, लेकिन बेसल सेलुलर संकेत यह कठिन बना देता है। समापन बिंदु जांच के लिए आवश्यकता को समाप्त करने के लिए, एसई दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के वर्णक्रमीय ओवरलैप (वर्णक्रम खून के माध्यम से) के लिए और संयुक्त जांच fluorophores और माइक्रोस्कोप के क्वांटम उपज और वर्णक्रमीय संवेदनशीलता (क्यूएस) के लिए सुधारा जा सकता है (सीएसई) इमेजिंग प्रणाली। सीएसई के आधार पर सुधारा एसई झल्लाहट अनुपात एक छवि है, यानी, ई एसई = सीएसई / AEM के प्रत्येक पिक्सेल के भीतर जांच का मनाया झल्लाहट दक्षता को परिभाषित करता है। वाणिज्यिक और मुफ्त सॉफ्टवेयर के इन प्रभावों के लिए एसई सही करने के लिए उपलब्ध है औरपाठक तरीकों 50 के विस्तृत विवरण के लिए चेन और Periasamy 2006 के काम करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, गणना ई एसई प्रति समय बिंदु (एसई, क्यूई, AEM) तीन छवि चैनलों का कब्जा की आवश्यकता है। क्यूई / cAem है, जो (क्यूई और AEM) केवल दो छवि चैनलों का कब्जा की आवश्यकता है – इसलिए, इस काम में हम भी एक वैकल्पिक झल्लाहट अनुपात ई QE = 1 रोजगार। इन चैनलों से ई QE की गणना केवल क्यु (cAem = AEM x क्यूएस) के लिए AEM को सही करने की आवश्यकता है। क्यूएस = डेम / AEM आसानी से एक अंशांकन नमूना है, जहां डेम स्वीकर्ता प्रक्षालित के साथ दाता उत्तेजना के तहत दाता उत्सर्जन से दो छवियों का उपयोग कर अनुमान लगाया गया है। FAP किसी भी पल में जांच के Ei करने के लिए ई एसई या ई QE की तुलना द्वारा गणना की जा सकती है।
अंत में, झल्लाहट अनुपात चयन (ई एसई = सीएसई / AEM बनाम ई QE = QE / cAem) से जांच कराने प्रकार के विचार और सबसे अच्छा संकेत के साथ चैनलों पर आधारित होना चाहिए। दोनों एकpproaches फ्रेम प्रति छवियों की पृष्ठभूमि शोर सुधार के रूप में समय के साथ autofluorescence में परिवर्तन के लिए खाते में ऊपर वर्णित शामिल हैं। वे डेम उत्तेजना स्पेक्ट्रम है, जो अक्सर जांच के लिए डिजाइन और माइक्रोस्कोप फिल्टर विन्यास के कारण मामला है में AEM उत्तेजना प्रकाश की कोई ओवरलैप मान। एकल श्रृंखला जांच या तो उपयोग कर सकते हैं और चयन कैमरा शोर करने के लिए सबसे अच्छा जांच संकेत (चमक) पर और एसई और QE चैनलों पर पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए आधारित है। ICUE1 जांच और प्रयोगात्मक शर्तों यहां इस्तेमाल किया (सेल और हाइड्रोजेल प्रकार) के लिए, एसई QE तुलना में एक मजबूत संकेत है। दोहरे श्रृंखला जांच दाता और स्वीकर्ता fluorophores की गैर equimolar वितरण की वजह से ई एसई के उपयोग की आवश्यकता है। जांच है कि इस तरह के रूप में ICUE1 analyte बाध्यकारी पर झल्लाहट में कमी, झल्लाहट दक्षता "" उलटा किया जा सकता analyte बाध्यकारी पर एक सकारात्मक संकेत दे परिवर्तन को पेश करने के रूप में हम यहाँ ई एसई = 1 के साथ करते हैं, के लिए – सीएसई / AEM या ई QE = QE / (AEM x क्यूएस)।
वें का विश्लेषणई FAP झल्लाहट अनुपात की समुचित सुधार करने के लिए और ईआइ के अनुमान के प्रति संवेदनशील है। यह वही अंशांकन नमूना क्यु के लिए इस्तेमाल किया और एक पारंपरिक समापन बिंदु के साथ अनुमान लगाया जा सकता झल्लाहट दक्षता परख ईआइ = 1- (क्यूई / डीईएम) (क्यूई की छवि स्वीकर्ता photobleaching और एक डेम की छवि के बाद) 28 है, लेकिन ध्यान रखा जाना चाहिए कम से कम करने के रूप में दाता के आकस्मिक विरंजन। हम एक संशोधित संस्करण जहां AEM के आधार पर डेम का अनुमान क्यु के लिए समायोजित, प्रतिस्थापित है वर्णन यानी, ईआइ = 1 – (क्यूई / (AEM x क्यूएस))। वैकल्पिक रूप से, ईआइ = सीएसई / AEM इस्तेमाल किया जा सकता है। जीवित कोशिकाओं में Ei का आकलन जरूरी है कि सारे जांच पूर्ण झल्लाहट करने के लिए प्रेरित किया। इस तरह के ICUE1 के रूप में जांच, कि analyte बाध्यकारी पर झल्लाहट में कमी के लिए व्यवहार में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। Ei की इन विट्रो आधारित गणना सेल lysates और शुद्ध analyte का उपयोग सबसे अच्छा है, लेकिन इस काम के दायरे से बाहर। यहाँ हम 2 ', 5'-Dideoxyadenosine का उपयोग कोशिकाओं में शिविर में कमी करने के लिए सलाह देते हैं। हालांकि, एक रिश्तेदार FAP ख सकता हैई एक Ei अनुमान संकेत के आधारभूत स्तर से निकाली गई उपयोग कर की गणना। इन कारणों के लिए, पढ़ाई सबसे अधिक बार झल्लाहट अनुपात (के रूप में यहाँ किया है) या एक रिश्तेदार FAP समापन बिंदु अंशांकन, जहां एगोनिस्ट जोड़ने से पहले संकेत आधारभूत एक दूसरे एगोनिस्ट कि सिगनल संतृप्त जोड़ने के बाद कम बाध्य और संकेत है के आधार पर रिपोर्ट ऊपरी है बंधे। Forskolin अक्सर शिविर संकेत तर करने के लिए एक नियंत्रण agonist के रूप में प्रयोग किया जाता है। जैसे कि 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-चक्रीय मोनोफास्फेट के रूप में वैकल्पिक रूप से, एक शिविर अनुरूप इस्तेमाल किया जा सकता है। पढ़ाई के प्रयोगात्मक उपचार के बीच संकेतन मार्ग में संभावित परिवर्तनों की पहचान करने के पूरा होने पर इस्तेमाल किया सकारात्मक नियंत्रण सिफारिश कर रहे हैं।
सेल के प्रति औसत सिगनल प्रतिक्रिया की गणना कई कारकों पर विचार करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, औसत झल्लाहट अनुपात एक कोशिका के भीतर प्रत्येक पिक्सेल पर अनुपात की औसत के रूप में गणना की जानी चाहिए, यानी, (Σ (QE/cAem)) / (पिक्सेल की संख्या), के बजाय Raऔसत QE और AEM एक सेल में, यानी, (ΣQE) / (ΣcAem) की Tio। हालांकि बाद में सावधान मास्किंग की आवश्यकता नहीं है के रूप में पृष्ठभूमि शोर कम है, यह गंभीर रूप से सच औसत झल्लाहट अनुपात underestimates। हालांकि, पिक्सेल अनुपात में चल बिन्दु परिकलन और सेल क्षेत्र ROIs को परिभाषित करने और सेल के बाहर पृष्ठभूमि शोर से उत्पन्न नकली अनुपातों के शामिल किए जाने से बचने के लिए सावधान बाइनरी मास्किंग की आवश्यकता होती है। पूरे सेल क्षेत्र सेल आकार पर biasing परिणामों से बचने के लिए मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए। मास्किंग सेल आकार और प्रवास में परिवर्तन के आधार पर समय के साथ नए सिरे से परिभाषित करने की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, सेल से ROIs बड़ा बहिष्कार मानदंड QE और AEM का संकेत है कि अच्छी तरह से सेलुलर स्तर से नीचे गिर जाते हैं और निकट पृष्ठभूमि के स्तर से पिक्सेल अनुपात को दूर करने के लिए परिभाषित कर रहे हैं, तो इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्णित विश्लेषण के तरीकों को विस्तार विशेष सॉफ्टवेयर / plugins के बिना झल्लाहट विश्लेषण के लिए इस काम में इस्तेमाल बुनियादी कदम। माइक्रोस्कोप निर्माताओं और अन्य विक्रेताओं जोड़ने पर मॉड्यूल बेचनेउनकी माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर है, जो स्वचालित ratiometric का समर्थन और विश्लेषण झल्लाहट के लिए है। इसी तरह, सार्वजनिक डोमेन ImageJ सॉफ्टवेयर ऐसे RiFRET के रूप में कण और झल्लाहट विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई plugins, है। दूसरा, पिक्सेल आधारित औसत झल्लाहट अनुपात क्योंकि एक 2 डी छवि प्रयोग किया जाता है 3 डी सेलुलर संरचना का सच औसत अनुपात underestimates। 2 डी संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं और जेड अक्ष के साथ औसत। जीवित कोशिकाओं में झल्लाहट अनुपात की 3 डी स्थानिक वितरण की गणना के लिए उच्च गति 3 डी इमेजिंग के बिना संभव नहीं है (जैसे।, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग)। यह दोनों 2 डी और 3 डी संस्कृतियों के लिए एक समस्या है, लेकिन 3 डी में एक बड़ा प्रभाव सेलुलर संरचना के अधिक के रूप में हवाई जहाज से बाहर मौजूद है। यह जांच है कि इस तरह के प्लाज्मा झिल्ली EPAC1 जांच PM-ICUE के रूप में सेलुलर संरचनाओं, के लिए स्थानीय बनाना के लिए बड़ी चिंता का विषय है। Spiering एट अल देखें। 2013 के लिए सुझाव अनुपात की गणना 24 पर सेल मोटाई प्रभाव के लिए सही करने के लिए। AEM के वितरण का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपता लगा कि अगर जांच सेल और इमेजिंग विमान समायोजित के क्षेत्रों में जम जाता है। यह भी झल्लाहट अनुपात की स्थानिक वितरण की व्याख्या करने और नकली परिणामों को खत्म करने में मदद करेगा, उदाहरण के लिए।, जांच संतृप्ति की पहचान (यानी, एक कम AEM क्षेत्र कम जांच एकाग्रता होगा और जांच संतृप्ति और उच्च झल्लाहट अनुपात प्रदर्शन कर सकते हैं)। तीसरा, विभिन्न झल्लाहट आधारभूत स्तर, अभिकर्मक दक्षता में एक अंतर का संकेत हो सकता प्रयोगात्मक समूहों के बीच अभिव्यक्ति, या बेसल सिगनल की जांच। "सापेक्ष विश्लेषण" (चरण 10.1.1) समय पर झल्लाहट अनुपात में बहाव को दूर उपस्थित अगर मदद मिलती है। यह नमूने के बीच प्रतिक्रियाओं के रिश्तेदार परिमाण की तुलना की सुविधा है, लेकिन संदर्भ नमूना के लिए प्रतिक्रिया (नियंत्रण साजिश एक फ्लैट लाइन है) के समय पाठ्यक्रम की तुलना में बाधा उत्पन्न करती। "निरपेक्ष विश्लेषण" (चरण 10.1.2) नमूने भर में प्रतिक्रिया की दर की तुलना की सुविधा है, लेकिन प्रतिक्रिया की भयावहता की तुलना बाधित क्योंकि प्रत्येक पंक्ति एक dissim द्वारा बढ़ाया हैilar निरंतर। अध्ययन अक्सर आधारभूत पर एक रेखीय प्रतिगमन का उपयोग समय पर झल्लाहट अनुपात में बहाव के लिए सही करने के लिए।
वर्णित 3 डी झल्लाहट विधि बनाना और प्रदर्शन सेल लादेन 3 डी हाइड्रोजेल है, जो अन्य जांच और इमेजिंग तौर तरीकों को लागू किया जा सकता है की समय चूक इमेजिंग के लिए एक उपयोगी और व्यावहारिक तरीका है। जैसा कि ऊपर चर्चा की एकल श्रृंखला बाइनरी जांच के अलावा अन्य झल्लाहट प्रणाली, तीव्रता आधारित संकेतों के और अधिक जटिल सुधार की आवश्यकता होगी। वैकल्पिक रूप से, झल्लाहट (flim-झल्लाहट) के प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग जांच दाता के उत्सर्जन को जीवन में एक परिवर्तन के माध्यम से झल्लाहट दक्षता गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विपरीत तीव्रता आधारित झल्लाहट, लिए flim झल्लाहट पृष्ठभूमि शोर, वर्णक्रमीय खून के माध्यम से, क्वांटम दक्षता, और डिटेक्टर वर्णक्रमीय संवेदनशीलता 2 के प्रति असंवेदनशील है। हालांकि, लिए flim प्रणाली, महंगी जटिल है, और असामान्य हैं, और एकल प्रतिपादक क्षय के साथ fluorophores और कोई लिए flim रन दूर 49 के साथ सबसे अच्छा काम करते हैं। वर्णित विधि भी मो के साथ इस्तेमाल किया जा सकता हैउन्नत माइक्रोस्कोप प्लेटफार्मों रे (उदा।, झल्लाहट TIRF, प्रतिदीप्ति anisotropy, और वर्णक्रमीय सह-संबंध झल्लाहट)। उच्च गति confocal और multiphoton माइक्रोस्कोपी के साथ 3 डी इमेजिंग के लिए इस पद्धति लागू संकेत प्रतिक्रिया के उप सेलुलर वितरण के विश्लेषण की सुविधा और विश्लेषण के संकेत की सटीकता में वृद्धि होगी। इस 3 डी झल्लाहट विधि नकली 3 डी सेलुलर microenvironments में उन्नत कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए सक्षम हो जाएगा। जैसे, यह आसानी से औषध विज्ञान और कहनेवाला संकेतन का अध्ययन और इंजीनियर हाइड्रोजेल आधारित microtissues में दवा प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग सहित पुनर्योजी दवा की जरूरत है, के लिए लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों पिट्सबर्ग, स्वास्थ्य पुरस्कार K01 AR062598 के राष्ट्रीय संस्थानों, और अनुदान P30 DE030740 विश्वविद्यालय में दंत चिकित्सा के स्कूल ऑफ मेडिसिन की वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं। लेखकों को भी ImageJ मैक्रो के लिए ImageJ और माइकल Cammer के विकास के लिए ICUE1 प्लाज्मिड के लिए डॉ जिन झांग, वेन Rasband धन्यवाद।
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] | Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) | NC0162601 | Reagents |
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) | Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich | 95904 | Reagents |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514 | Reagents |
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 440167 | Reagents |
Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470-5g | Reagents |
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride | Fisher Scientific | AC244280100 | Reagents |
2-Butanone | Fisher Scientific | AC149670010 | Reagents |
Lithium Bromide | Fisher Scientific | AC199871000 | Reagents |
Isopropanol | Sigma Aldrich | 190764 | Reagents |
Sigmacote (siliconizing reagent) | Sigma Aldrich | SL2 | Reagents |
Toluene | Fisher Scientific | AC36441-0010 | Reagents |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH3025601 | Reagents |
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) | Life Technologies | 11058-021 | Reagents |
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) | Promega | E2311 | Reagents |
Cellstripper (cell dissociation solution) | Corning | 25-056-CI | Reagents |
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free | Corning | 356231 | Reagents |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Reagents |
Pipette Tips (10,200,1000 μl) | Fisher Scientific | 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 | Disposable lab equipment |
Powder Free Examination Gloves | Fisher Scientific | 19-149-863B | Disposable lab equipment |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Disposable lab equipment |
Biopsy punch (3 mm) | Miltex | 3332 | Disposable lab equipment |
Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-544C | Disposable lab equipment |
Precoated glass coverslips (epoxysilane) | Arrayit | CCSL | Disposable lab equipment |
Glass slide | Fisher Scientific | 12550D | Disposable lab equipment |
Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) | Fisher Scientific | 14-959-70C, 14-959-49A | Disposable lab equipment |
Cell culture dish (6-well) | Falcon | 351146 | Disposable lab equipment |
Epifluorescent Microscope with motorized stage | Nikon | MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) | Large/non-disposable lab equipment |
Adjustable Specimen Holder for XY Stage | Nikon | 77011393 | Non-disposable lab equipment |
60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) | Nikon | MRD01605 | Non-disposable lab equipment |
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) | Nikon (Sutter Instrument reseller) | 77016231, 77016088 | Non-disposable lab equipment |
CYF/YFP filter set | Nikon (Chroma Technology Corp) | 77014928 | Non-disposable lab equipment |
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) | Nikon (Hamamatsu reseller) | 77054076 | Non-disposable lab-equipment |
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) | Nikon | MQS31100 | Non-disposable lab equipment |
Prism (spreadsheet and graphing software) | GraphPad Software, Inc | Version 6 | Non-disposable lab equipment |
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) | OmniCure | S1000 | Large/non-disposable lab equipment |
Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | DP-100 | Non-disposable lab equipment |
Hemacytometer | Hausser Scientific | Reichert Bright-Line 1475 | Non-disposable lab equipment |
Vacuum desiccator chamber/degasser | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
Tissue Culture Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
Chemical Fume Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
Oven | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
Spatula | Any | Non-disposable lab equipment | |
Beaker | Any | Non-disposable lab equipment | |
Incubator | Any | Large/non-disposable lab equipment |