Förster resonansenergiöverföring (FRET) avbildning är ett kraftfullt verktyg för realtidscellbiologiska studier. Här en metod för FRET avbildning celler i fysiologiska tredimensionella (3D) hydrogel mikromiljöer med användning av konventionell epifluorescensmikroskopi presenteras. En analys för ratiometrisk FRET-prober som ger linjära förhållanden över aktiveringsintervall beskrivs.
Avbildning av Förster resonansenergiöverföring (FRET) är ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellbiologi i realtid. Studier där man använt FRET använder vanligen två-dimensionell (2D) kultur, som inte efterliknar den tredimensionella (3D) cellulär mikromiljö. En metod för att utföra släcktes emission FRET avbildning med konventionell widefield epifluorescensmikroskopi av celler inom ett 3D-hydrogel miljö presenteras. Här en analysmetod för ratiometrisk FRET-prober som ger linjära förhållanden över sonden aktiveringsintervall beskrivs. Mätning av intracellulär cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) -nivåer demonstreras i kondrocyter enligt forskolin stimulering med hjälp av en sond för EPAC1 aktivering (ICUE1) och förmågan att upptäcka skillnader i cAMP signal beroende hydrogel typ, häri en fototvär hydrogel (PC-gel, polyetylenglykol dimetakrylat) och en termoresponsiv hydrogel (TR-gel). Jämfört med 2D FRET metoder,denna metod kräver lite extra arbete. Laboratorier redan utnyttjar FRET avbildning i 2D kan enkelt anta denna metod för att utföra cellstudier i en 3D mikromiljö. Det kan vidare tillämpas på hög genomströmning drogscreening i manipulerade 3D microtissues. Dessutom är den kompatibel med andra former av FRET avbildning, såsom anisotropi mätning och fluorescens livstid avbildning (FLIM), och med avancerad mikroskopi plattformar med hjälp av konfokal, pulsad eller modulerad belysning.
Cellulär signalering är både komplex och följd för många områden, inklusive farmakologi, tissue engineering och regenerativ medicin. Användbara prövnings verktyg behövs för att öka vår förståelse av cellbiologi och utveckla optimala material för vävnadsregenerering. Förster resonansenergiöverföring (FRET) avbildning är ett viktigt verktyg som gör det möjligt analys av receptoraktivering, molekylär konformation, och supramolekylära interaktioner (eg., Protein / DNA komplex) i levande celler. FRET är en typ av icke-radiativ energiöverföring mellan fluoroforema 1. Den har en effektivitet som är omvänt proportionell mot den sjätte potensen av avståndet mellan en donatorfluorofor och acceptorfluorofor. Det kan därför ge information om den rumsliga avståndet mellan två olika molekyler eller mellan olika regioner av en molekyl på nanometerskala (typiskt 1-10 nm) 2. Donator- och acceptor-fluoroforer kan vara olika molecule typer (hetero-FRET), där givaren har emissions högre energi (kortare våglängd), eller av samma typ (homo-FRET). FRET avbildning kan utföras på fasta eller levande celler, men i allmänhet fixerade celler används för avbildning av molekylära interaktioner med hög rumslig upplösning när höghastighets konfokala system är inte tillgängliga. Levande celler används för att studera interaktioner och processer som hämmas eller förändras genom fixering, såsom realtids intracellulära signal svar 3.
Live cellstudier som använder FRET avbildning användning tvådimensionella (2D) cellodlingar delvis på grund av enkelhet och lägre bakgrund (ingen utstrålning från ut ur planet celler). Emellertid 2D-kulturer förändrar också många cellulära processer jämfört med den fysiologiska mikromiljö och tredimensionella (3D) kultur 4,5. Till exempel är nativ cell till cell och cell till extracellulära matrix-interaktioner drastiskt förändrad hos 2D kultur som leder till de easily observerade förändringar i cellmorfologi och polaritet 6. Membranmikroområden (eg., Caveolae och lipidaggregat) och receptorsignalering är starkt reglerad av odlingsmiljö, delvis eftersom de binder cytoskelettala komponenter 7,8 och cellformen och cytoskelettala struktur är starkt reglerad av den rumsliga odlingsmiljö 9. Mechanotransduction är inte bara påverkas av 3D-matrisen, men av de mer komplexa sekundära belastningsförhållanden framkallade i 3D-miljöer jämfört med 2D kulturer 10. Slutligen är permeabiliteten av 3D-matriser mindre än odlingsmediet, i allmänhet med minskad diffusion och ökad bindning av cellsignaleringsmolekyler jämfört med 2D-kulturer. Med 3D-kulturer man kan skapa och följa en mikro mer liknar den fysiologiska förhållande till lim, kemiska och mekaniska signaler. Cell till cell interaktioner kan främjas och vidhäftningsegenskaper kan styras wed struktur, sammansättning och arkitektur (mönstring) av 3D-material 11-13. De mekaniska egenskaperna hos materialet kan likaledes skräddarsys av sammansättning och struktur 14,15. Odling av celler i hydrogeler därför tillstånd FRET studier på primära celler som annars skulle avregistrera-Differentiera eller ändra i fenotyp med hjälp av konventionella tekniker, t ex., Celler från ledbrosk. Således behövs en metod för att möjliggöra FRET analyser i levande 3D-kulturer.
Hydrogel ställningar är idealiska för 3D FRET baserade studier eftersom de kan göras optiskt transparent och skräddarsys för att styra mikro och ge cellulära signaler. Hydrogeler tillverkade av naturliga polymerer har använts i cellkultur i årtionden, inklusive gelatin och fibrin 16. Större kontroll över den cellulära mikromiljön kan uppnås med kemisk modifiering av dessa polymerer och med användningen av syntetiska polymerer 17,18. hydrogel mekanisk styvhet och permeabilitet kan styras genom att ändra deras polymerkomposition och mesh storlek (polymer och tvärbindningsdensitet) 19,20. Vidare kan hydrogeler göras bioaktivt genom inkorporering av tillväxtfaktorer och cellulära ligander. På grund av dessa möjligheter är att utveckla hydrogeler för biosensing, drug delivery, och vävnadstekniska tillämpningar ett mycket aktivt forskningsområde 21. 3D-utskrifter av hydrogeler är också under utveckling för tillverkning av mikro vävnader och -organs 15. Således är FRET avbildning av celler i hydrogeler inte bara användbart som ett medel för att approximera fysiologiska cellbeteende, utan också som ett verktyg för att studera och optimera engineered vävnadstillväxt.
Binära ratiometrisk FRET sonder är mycket användbar för att studera cellulära signalering och kan utnyttjas i hydrogel kulturer. För en ofullständig lista över publicerade fluorescerande och FRET sonder, se Cell Migration Consortium webbplats <sup> 22. Den vanligaste sond typen innehåller två olika fluoroforer som är förknippade eller förbundna med en igenkänningselement (s) (analyt känsligt område). Dessa regioner genomgår en konformationsändring, en förening, eller disassociation vid detektering av analyten (t ex., Bindning av en jon eller molekyl, enzymatisk klyvning av den region) som förändrar avståndet mellan fluoroforer och därför FRET magnitud (antingen högre eller lägre) 23. En mindre vanlig men användbara sond typ bygger på en analyt känslig förändring i den spektrala överlappningen av de två fluoroforerna, som förändrar FRET magnitud. "Single-chain" ratiometriska sonder använder en fluorofor par kopplat på en enda molekyl. "Dual-kedja" sonder utnyttja fluorofor par på separata molekyler, men deras uttryck kan kopplas under samma expressionskassett 24. Till skillnad från studier med enda fluoroforen uttryck (eg., Fluorescerande fusionsproteiner), studier med ratiometriskFRET prober kräver inte dubbel transfektion att kontrollera för transfektion effektivitet eller cellviabilitet. Propportionell FRET-prober är relativt okänsliga för transfektion effektivitet när den uttrycks över en minimigräns (koncentration okänslig) 23,25. De är okänsliga för exciteringskällförändringar och andra intracellulära miljöfaktorer (t.ex.., PH, joner) så länge som båda fluoroforer är lika lyhörda. Dessutom är deras svar inte är föremål för transkriptions fördröjning, till skillnad från lysrör och självlysande promotor-reporter konstruktioner 26,27.
Propportionell FRET prober lätt och ofta används i konventionella mikroskopsystem widefield epifluorescence. Widefield mikroskop är att föredra framför linje scanning konfokala system för levande cell imaging på grund av oro över systemets kostnad, fluoroforen blekning, och fångst av signalförändringar med tillräcklig tidsupplösning. Dessutom enda cell anallys över en stor population av celler som är möjligt med en motoriserad skede och bildtagning över flera synfält. Widefield mikroskopi kräver intensitet baserad analys av hetero-FRET sonderingssignaler. Även intensitetsanalys inte kräver komplexa hårdvara som andra FRET metoder behövs mer efter förvärvet arbete för att korrigera för effekterna av fluoroforen beteenden och mikroskop / imaging systemkonfigurationer 28. Den tagna emissionsintensiteten hos en fluorofor är en funktion av den exciteringsenergi, fluorofor kvantutbyte, och det kombinerade filtret och kameran / detektor spektral känslighet och linjäritet 2. Dessa kan vara olika för givaren och mottagaren och kommer att kräva kalibrering för kvantitativ analys. Dessutom är avbildning av emissions acceptorn påverkas av den spektrala överlappningen av de fluoroforer (excitation av acceptorn genom donator excitationsljus och genomblödning av emission donator in i spektra acceptor emission) 2.4, Single-chain "sonder är internt normaliserade eftersom deras fluoroforer är ekvimolär i nanoskala, medan de fluoroforer av" dual-kedja "prober kan existera vid olika stoichiometries under en cell 25,28 Om fluoroforer av." Single-chain " prober med liknande ljusstyrka (funktion av extinktionskoefficienten och kvantutbytet), effekterna av icke-linjära detektorkänslighet är små och endast korrigering för bakgrundsfluorescens och den kopplade kvantutbyte / detektorkänsligheten behövs 23. Således "single-chain" proportionerlig FRET prober lättast genomförs i widefield mikroskopi 24.
Detta dokument beskriver en enkel teknik för att utföra FRET avbildning av levande celler i 3D hydrogel kulturer med hjälp av en konventionell widefield epifluorescent mikroskop. Det kan lätt antas av laboratorier redan utför FRET experiment i 2D, samt laboratorier som är intresserade av intercellulär signalering i microtissues. Här visar vi metoden med FRET avbildning baserad mätning av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) -nivåer i levande kondrocyter inom fototvär (PC-gel, polyetylenglykol dimetakrylat) och termoresponsiv (TR-gel, Matrigel) hydrogeler. En kvotmetrisk FRET-sond utnyttjas baserat på EPAC1 (ICUE1) för att upptäcka cAMP-nivåer som svar på forskolin, ett kemiskt agonist för adenylylcyklas, som katalyserar omvandlingen av ATP till cAMP. cAMP är en av de viktigaste andra budbärare som medierar G-proteinkopplade receptorer signalering och det aktiverar olika faktorer, bland annat nedströms utbytes proteiner direkt aktiveras av cAMP (EPACs). Fluoroforerna flytta isär vid cAMP-bindning till EPAC domänen resulterar i en minskning i FRET. Beskrivs här är framställningen av hydrogelmaterial, cell transfektion med ICUE1 sonden, och inbäddning av cellerna i 3D hydrogeler. 3D FRET experiment förfarande och analys bilden nödvändigatt utvärdera sond aktivitet per cell förklaras. Vi diskuterar också de inneboende begränsningar FRET analys i 2D och 3D med hjälp av widefield mikroskopi. Tekniken som presenteras här är en förbättring jämfört med de existerande 2D metoderna eftersom det möjliggör analys på ett mera fysiologiskt sammanhang och kräver mindre bildkorrigering och kalibrering. Stor nytta ligger i det faktum att många transparenta material kan användas medan cell- och transfektion preferenser kan upprätthållas.
Detta arbete visar hur FRET avbildning kan användas för att analysera cellulär signalering i 3D-hydrogeler. Även tidigare studier har visat FRET avbildning av celler sådda på hydrogel substrat 35-37, av extracellulära interaktioner med hydrogeler 38, och av molekyler fångade i hydrogeler 39-41, är detta det första offentliggörandet att beskriva FRET avbildning baserad intracellulära analys av celler inbäddade i 3D-hydrogeler. Arbetet löser flera genomförandefrågor vid omräkning FRET avbildning från 2D till 3D. Först höga numeriska mål bländare som behövs för FRET avbildning för att samla tillräcklig signal utsläpp, men de begränsar skärpedjupet. Cellerna här tillåts något sedimentera via centrifugering för att öka antalet celler i ett fokalplan nära glaset för att kompensera för detta. För det andra, kan 3D-hydrogel ställningar driver över synfältet under avbildning vilket försvårar analysen. Hydrogelerna här är bundna till coverslip så att de förblir fasta under hela experimentet. Tredje, val av lämpliga hydrogelkompositioner för 3D FRET är viktigt eftersom hydrogeler kan hindra visualisering av cellerna. Här transparenta hydrogeler av PC-gel och TR-gel används. Men samla cellerna med centrifugering till ett fokalplan nära täck kan användas för att avbilda celler i hydrogeler med högre diffraction.The val av hydrogel beror på mikro villkor som måste simuleras, som kan hittas i en recension på hydrogeler 42 . För det fjärde är en alternativ beräkning som användes här för den FRET förhållandet mellan enkelkedje ICUE1 sond (dvs E QE = QE / cAem) för att minimera antalet bildkanaler som erfordras för analys och därigenom minimera fotoblekning. Den genomsnittliga FRET förhållandet per cell beräknas som genomsnittet av förhållandena per pixel inom en cell för att minimera underskattning av den verkliga FRET ratio. Slutligen, en linjär ratiometrisk analys och medelatt beräkna den aktiverade fraktionen av enkelkedjiga binära prober beskrivs.
Det finns flera viktiga aspekter att genomföra framgångsrika FRET experiment använder widefield mikroskopi. När det gäller hårdvara, måste kameran vara tillräckligt känslig för att lösa små signalförändringar, vilket nyare vetenskapliga CMOS-kameror och elektron multiplicera CCD bättre lämpade än konventionella CCD. För att på bästa analysera den geografiska fördelningen av FRET förhållandet, måste kameran åtminstone ha dubbelt den rumsliga upplösningen av punktspridningsfunktionen av målet (Nyquist kriteriet). Detta gör dubbla visa system mindre lämpade för uppgiften. Mer avgörande är att välja en lämplig exponering och bildupptagningshastigheten för den givna FRET par för att minimera fotoblekning av fluoroforer. En minskad förvärvstakt rekommenderas som experiment längd ökar. Användningen av snabba filterhjul ökar förvärvsfrekvens och antalet FOVs för analys medan undvikaing frågorna bildregistrering med dubbel-view och torn filter kuber. Den inhomogena belysning fältet komplicerar korrigering för bakgrundsfluorescens som uppstår från prov autofluorescens och kamerasystem buller. Vissa hydrogeler, i synnerhet de som innehåller kollagenproteiner är mycket autofluorescent 43,44. FRET nyckeltal skattas utan bakgrundskorrigering. Här använder vi en enkel bakgrund korrigeringsmetod som bygger på den relativt flacka belysningsfält som ofta kan konfigureras med epi-fluorescens belysning över mitten av bilden (Figur 3B, steg 7,2). Denna metod begränsar därför celler av intresse för dem inom detta belysningsområdet. Bakgrundskorrigeringen som beskrivs här inte tar hänsyn till cell autofluorescens i våglängd läsa för den binära sonden. I ett sådant fall bör omärkta celler (ingen sond transfektion) avbildas på samma villkor och bakgrund subtraheras. A mix av märkta och omärkta celler kan användas och de omärkta cellerna ut för bakgrunden ROI. Alternativa metoder som tillhandahåller cellanalys över hela bildfältet inkluderar användning av en skuggning mask, flera bakgrunds ROI, eller identiska prover utan celler och ett protokoll finns tillgänglig på begäran.
Specifik till 3D FRET avbildning, är avkännings-svars mycket känslig för hydrogelen permeabilitet för analyten (Figur 6). Därför samma hydrogel regioner jämförs över experimentella behandlingar, företrädesvis vid en punkt av geometri symmetri såsom nära ställningen centrum som används här. Alternativt mikroflödeskammare / bioreaktorer kan användas för att snabbt och jämnt BEGJUTA hydrogelen med analytlösningen 45. En FRET-signal kan inte detekteras (signal-brusförhållandet är för lågt) när hydrogelen s autofluorescens är för hög; en tunnare hydrogel eller annan sond (olika fluoroforer) bör användas.Med avseende på 3D FRET avbildning i fototvär hydrogeler, är användning av minsta bestrålning exponering och våglängder utanför exciterings- spectrums av sond fluoroforer rekommenderas. LAP kan användas tillsammans med en ljuskälla för synligt ljus vid 405 nm för att ytterligare minimera potentiell cellulär skada 31,46. Dock använder LAP med 365 nm strålning rekommenderas eftersom det minimerar sond blekning. 365 nm ligger i svansen slutet av GFP givarexciteringsspektrum, medan 405 nm ligger på toppen excitation. Alternativt kan sonden expression tillåtas att återhämta sig under en dag. Användning av binära prober minimerar frågor om känslighet för skillnader i expressionsnivåer och i molekylär diffusion av givaren och mottagaren fluoroforer. Icke-binära sönder kan användas, men med SE istället för QE avbildning och ytterligare korrigering för spektral genomblödning av excitations- och emissionsspektra (se nedan). Dessutom låg kommersiell tillgänglighet och komplexiteten i utformningen av FRET-proberkan vara ett hinder. Den mest kritiska faktorn för framgångsrika experiment fortfarande ordentlig korrigering och analys av fluorescenssignaler.
En alternativ beräkning av FRET förhållandet används för flera andra skäl förutom minimering av fotoblekning. För binära enkelkedjiga sonder, är den allmänt rapporterade förhållandet acceptor utsläpp enligt donator excitation (sensibiliserade utsläpp, SE) för utsläpp givare enligt donator excitation (kylda emission, QE), dvs FRET ratio = SE / QE 25,47,48. SE / QE är icke-linjär i förhållande till förändringar i FRET effektivitet 21,22,47. Nämligen, har förhållandet ett exponentiellt icke-linjärt förhållande till inneboende FRET effektiviteten av sonden (Ei) (Donius, AE, Táboas, JM opublicerat arbete. (2015)), varvid förhållandet mest linjära för Ei mindre än ca 15%. SE / QE kommer också underskatta den del av aktiverade prober (FAP, dvs, bråkdel av prober som binder analyt). Therefore, analys av SE / QE kräver en besvärlig jämvikts dos-responsstudie och kurvpassning. Lyckligtvis förhållandena SE eller QE för emission mottagaren enligt acceptor excitation (AEM) är linjär med avseende på Ei och FAP, dvs FRET nyckeltal SE / AEM och QE / AEM. SE / Aem används ofta för binära prober och kräver endast slutpunkt kalibrering (utan sond aktivitet och full sond aktivitet), men basala cellulära signalerings gör detta svårt. För att eliminera behovet av slutpunktskalibrering, kan SE korrigeras (CSE) för spektral överlappning av donator- och acceptor excitations- och emissionsspektra (spektral genomblödning) och för kvantutbyte och spektral känslighet (QS) av de kombinerade sond fluoroforer och mikroskop avbildningssystem. Den korrigerade SE FRET förhållande, baserat på CSE definierar den observerade FRET effektiviteten av sonderna inom varje pixel i en bild, det vill säga, E SE = CSE / Aem. Kommersiell och fri programvara är tillgänglig för att korrigera SE för dessa effekter ochhänvisas läsaren till arbete Chen och Periasamy 2006 för en detaljerad förklaring av de metoder 50. Men beräkna E SE kräver fångst av tre bild kanaler per tidspunkt (SE, QE, Aem). Därför, i detta arbete har vi också använda en alternativ FRET förhållandet E QE = 1 – QE / cAem, vilket kräver infångning av endast två bildkanaler (QE och Aem). Beräkning E QE från dessa kanaler endast kräver rättelse Aem för QS (cAem = Aem x QS). QS = Dem / Aem lätt uppskattas med hjälp av två bilder från en kalibreringsprov, där Dem är utsläpp givaren enligt donator excitation med acceptor blekt. FAP i varje ögonblick kan beräknas genom att jämföra E SE eller E QE till Ei av sonden.
I slutändan bör FRET förhållandet val (E SE = CSE / Aem vs E QE = QE / cAem) baseras på en bedömning av typen sonden och kanalerna med bäst signal. både enpproaches inkluderar bakgrundsbrus korrigering av bilder per ram som beskrivits ovan för att ta hänsyn till förändringar i autofluorescens över tiden. De antar ingen överlappning av Aem excitationsljus i Dem exciteringsspektrum, vilket ofta är fallet på grund av att sondera design och mikroskop filterkonfiguration. Enkelkedjiga prober kan använda antingen och Urvalet baseras på bästa sondsignal (ljusstyrka) till kameran buller och bakgrundssignal på SE och QE kanaler. För ICUE1 sonden och experimentella betingelser som används här (cell- och hydrogel typer), har SE en starkare signal än QE. Dual-kedja sonder kräver användning av E SE på grund av icke-ekvimolär fördelning av givar- och acceptor fluoroforer. För prober som minskar i FRET vid bindning analyt såsom ICUE1, FRET effektivitet kan "inverterad" att presentera en positiv förändring signalering vid bindning av analyten som vi gör här, med E SE = 1 – CSE / Aem eller E QE = QE / (Aem x QS).
Analys av the FAP är känslig för korrekt korrigering av FRET nyckeltal och uppskattningen av Ei. Det kan uppskattas med samma kalibreringsprov som används för QS och en konventionell slutpunkt FRET effektivitet analys som Ei = 1- (QE / DEM) (QE bild följt av acceptor fotoblekning och en Dem bild) 28, men man måste vidtas för att minimera oavsiktlig blekning av givaren. Vi beskriver en modifierad version där uppskattningen av Dem bygger på Aem justerat för QS ersätts, det vill säga, Ei = 1 – (QE / (Aem x QS)). Alternativt kan Ei = CSE / Aem användas. Uppskattningen av Ei i levande celler kräver att alla prober köras till full FRET. Detta är svårt att uppnå i praktiken för sönder, såsom ICUE1 som minskar i FRET vid bindning av analyten. En baserad beräkning in vitro av Ei använder cellysat och renad analyt är bäst, men utanför ramen för detta arbete. Här rekommenderar vi att du använder 2 ', 5'-dideoxiadenosin att minska cAMP i cellerna. Dock kan en relativ FAP be beräknas med hjälp av en Ei uppskattning härrör från grundnivån för signalering. Av dessa skäl, studier rapporterar oftast FRET ratio (som gjort här) eller en relativ FAP baserad på slutpunktskalibrering, där signalerings baslinjen före tillsats agonist är den undre gränsen och signalen efter tillsats av en andra agonist som mättar signalering är den övre bunden. Forskolin används ofta som en kontroll agonist för att mätta cAMP signal. Alternativt kan en cAMP-analog användas, såsom 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-cykliskt monofosfat. Positiva kontroller som används vid slutförandet av studier för att identifiera eventuella förändringar i signalvägen mellan experimentella behandlingar rekommenderas.
Beräkning av den genomsnittliga signalsvaret per cell kräver en undersökning av flera faktorer. För det första bör det genomsnittliga FRET förhållandet beräknas som genomsnittet av förhållandena vid varje pixel i en cell, dvs, (Σ (QE/cAem)) / (antal bildpunkter), i stället för det ratio av den genomsnittliga QE och Aem i en cell, dvs, (ΣQE) / (ΣcAem). Även om den senare inte kräver noggrann maskering som bakgrundsbrus är låg, allvarligt underskattar det sanna genomsnittliga FRET ratio. Men förhållandena pixel kräver flyttalsberäkning och noggrann binär maskering av cellområdet för att definiera ROI och undvika införandet av falska förhållanden som genereras från bakgrundsbruset utanför cellen. Hela cellområdet måste kvantifieras för att undvika belastnings resultat på cellform. Maskeringen kan behöva omdefinieras över tiden beroende på förändringar i cellform och migration. Alternativt, ROI större än cellen kan användas om uteslutningskriterier definieras för att avlägsna förhållanden pixel från QE och AEM signaler som faller långt under cellulära nivåer och är nära bakgrundsnivåerna. Den beskrivna analysmetoder detalj de grundläggande stegen som används i detta arbete för FRET analys utan specialiserade program / plugins. Mikroskop tillverkare och andra leverantörer säljer tilläggsmoduls för deras mikroskop programvara, som stöder automatisk ratiometrisk och FRET analyser. På samma sätt har det offentliga ImageJ programvara flera plugins som partikel och FRET-analys, såsom RiFRET. För det andra, underskattar pixelbaserad genomsnittlig FRET förhållandet sanna genomsnittliga förhållandet mellan 3D cellstruktur eftersom en 2D-bild används. 2D signaler representerar och genomsnittet längs z-axeln. Beräkning av 3D rumsliga fördelningen av FRET förhållanden i levande celler är inte möjligt utan hög hastighet 3D-röntgen (eg., Med hjälp av spinning disk konfokalmikroskopi). Detta är ett problem för både 2D och 3D-kulturer, men har en större effekt i 3D som mer av cellstrukturen existerar ut ur planet. Detta är av stor betydelse för prober som lokaliserar till cellulära strukturer, såsom plasmamembranet EPAC1 sond PM-ICUE. Se Spiering et al. 2013 för förslag för att korrigera för celltjocklek effekter på förhållandet beräkningar 24. Analys av fördelningen av Aem kan användas för attupptäcka om sonden ackumuleras i områden i cellen och avbildningsplanet justeras. Detta kommer också att bidra till att tolka den geografiska fördelningen av FRET nyckeltal och att eliminera falska resultat, t ex., Identifiera sond mättnad (dvs att en låg Aem region har låg probkoncentration och kan uppvisa sond mättnad och hög FRET ratio). Tredje, olika FRET baslinjenivåer kan tyda på en skillnad i transfektionseffektivitet, sond uttryck, eller basal signalering mellan experimentella grupper. "Relativt Analysis" (steg 10.1.1) hjälper till att avlägsna drift i FRET förhållandet med tiden om det finns. Det underlättar jämförelse av den relativa storleken av svaren mellan prover, men försvårar jämförelse med tidsförloppet för svar för referensprovet (kontroll tomt är en rak linje). "Absolute Analysis" (steg 10.1.2) underlättar jämförelse av svarsfrekvensen över prover, men försvårar jämförelse av storleken på svaret, eftersom varje rad skalas av en dissimIlar konstant. Studier använder ofta en linjär regression på baslinjen för att korrigera för drift i FRET-förhållande med tiden.
Den beskrivna 3D FRET metod är ett användbart och praktiskt sätt att tillverka och utföra tidsförlopp avbildning av cell lastade 3D hydrogeler, som kan tillämpas på övriga sonder och avbildningsmetoder. Andra FRET-systemet förutom enkelkedjiga binära prober kommer att kräva mer komplex korrigering av intensitetsbaserade signaler, såsom diskuterats ovan. Alternativt kan fluorescenslivstid avbildning av FRET (FLIM-FRET) användas för att beräkna FRET effektivitet via en förändring i emissions livstid av sonden donator. Till skillnad från intensitet baserad FRET är FLIM-FRET okänslig för bakgrundsljud, spektral genomblödning, kvanteffektivitet, och detektor spektrala känslighet 2. Men flim system är dyra, komplicerade och ovanliga, och fungerar bäst med fluoroforer med enda exponent förfall och ingen FLIM avrinning 49. Det beskrivna förfarandet kan även användas med more avancerade mikroskop plattformar (eg., FRET-TIRF, fluorescensanisotropi, och spektrala korrelations FRET). Tillämpa denna metod för att 3D-bilder med hög hastighet konfokala och multifotonmikroskop underlättar analysen av sub-cellulära fördelningen av signalering svar och öka noggrannheten signalanalys. Denna 3D FRET metod gör det möjligt för avancerade cellbiologiska studier i simulerade 3D cellulära mikromiljöer. Som sådan, kan det lätt appliceras på farmakologi och regenerativ medicin behov, inklusive att studera inter signalering och screening läkemedelssvar i manipulerade hydrogel-baserade microtissues.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från School of Dental Medicine vid University of Pittsburgh, National Institutes of Health award K01 AR062598, och bidrag P30 DE030740. Författarna vill också tacka Dr Jin Zhang för ICUE1 plasmiden, Wayne Rasband för att utveckla ImageJ och Michael Cammer för ImageJ makro.
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] | Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) | NC0162601 | Reagents |
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) | Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich | 95904 | Reagents |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514 | Reagents |
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 440167 | Reagents |
Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470-5g | Reagents |
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride | Fisher Scientific | AC244280100 | Reagents |
2-Butanone | Fisher Scientific | AC149670010 | Reagents |
Lithium Bromide | Fisher Scientific | AC199871000 | Reagents |
Isopropanol | Sigma Aldrich | 190764 | Reagents |
Sigmacote (siliconizing reagent) | Sigma Aldrich | SL2 | Reagents |
Toluene | Fisher Scientific | AC36441-0010 | Reagents |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH3025601 | Reagents |
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) | Life Technologies | 11058-021 | Reagents |
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) | Promega | E2311 | Reagents |
Cellstripper (cell dissociation solution) | Corning | 25-056-CI | Reagents |
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free | Corning | 356231 | Reagents |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Reagents |
Pipette Tips (10,200,1000 μl) | Fisher Scientific | 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 | Disposable lab equipment |
Powder Free Examination Gloves | Fisher Scientific | 19-149-863B | Disposable lab equipment |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Disposable lab equipment |
Biopsy punch (3 mm) | Miltex | 3332 | Disposable lab equipment |
Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-544C | Disposable lab equipment |
Precoated glass coverslips (epoxysilane) | Arrayit | CCSL | Disposable lab equipment |
Glass slide | Fisher Scientific | 12550D | Disposable lab equipment |
Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) | Fisher Scientific | 14-959-70C, 14-959-49A | Disposable lab equipment |
Cell culture dish (6-well) | Falcon | 351146 | Disposable lab equipment |
Epifluorescent Microscope with motorized stage | Nikon | MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) | Large/non-disposable lab equipment |
Adjustable Specimen Holder for XY Stage | Nikon | 77011393 | Non-disposable lab equipment |
60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) | Nikon | MRD01605 | Non-disposable lab equipment |
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) | Nikon (Sutter Instrument reseller) | 77016231, 77016088 | Non-disposable lab equipment |
CYF/YFP filter set | Nikon (Chroma Technology Corp) | 77014928 | Non-disposable lab equipment |
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) | Nikon (Hamamatsu reseller) | 77054076 | Non-disposable lab-equipment |
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) | Nikon | MQS31100 | Non-disposable lab equipment |
Prism (spreadsheet and graphing software) | GraphPad Software, Inc | Version 6 | Non-disposable lab equipment |
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) | OmniCure | S1000 | Large/non-disposable lab equipment |
Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | DP-100 | Non-disposable lab equipment |
Hemacytometer | Hausser Scientific | Reichert Bright-Line 1475 | Non-disposable lab equipment |
Vacuum desiccator chamber/degasser | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
Tissue Culture Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
Chemical Fume Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
Oven | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
Spatula | Any | Non-disposable lab equipment | |
Beaker | Any | Non-disposable lab equipment | |
Incubator | Any | Large/non-disposable lab equipment |