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Biology

FRET成像的三维水凝胶

doi: 10.3791/54135 Published: August 1, 2016
* These authors contributed equally

Summary

荧光共振能量转移(FRET)成像是用于实时细胞生物学的研究的强有力的工具。这里提出了在使用常规荧光显微镜生理三维(3D)水凝胶的微环境FRET显像细胞的方法。被描述为比例FRET探针产生在激活范围线性比例的分析。

Abstract

荧光共振能量转移(FRET)的成像是在实时检查细胞生物学的有力工具。利用FRET研究通常采用的两维(2D)培养,其不模仿三维(3D)细胞微环境。使用3D凝胶环境内的细胞的常规广角荧光显微镜进行骤冷发射FRET摄像用方法。这里描述了比例FRET探针产生在探头激活范围线性比例的分析方法。细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平的测定证明在根据福斯克林刺激软骨细胞用探针为EPAC1活化(ICUE1)和检测cAMP的信号依赖于水凝胶材料的类型,在此光致水凝胶(PC-凝胶差异的能力,聚乙二醇二甲基)和一个温敏水凝胶(TR-凝胶)。与2D FRET方法相比,这种方法需要很少的额外工作。已经利用FRET成像2D实验室可以很容易地采用这种方法在3D微环境进行细胞学研究。它可以进一步工程化三维microtissues应用于高通量药物筛选。此外,它与其他形式的FRET成像,诸如各向异性测量和荧光寿命成像(FLIM),并与使用共聚焦调制照明先进显微术平台,脉冲,或兼容。

Introduction

细胞信号既复杂又衍生了众多领域,包括药理学,组织工程和再生医学。有用的研究性工具需要进一步我们的细胞生物学的理解,并发展组织再生的最佳材料。荧光共振能量转移(FRET)成像是一个重要的工具,使受体激活,分子构象,并在活细胞中的超分子相互作用( 例如 ,蛋白质/ DNA复合)的分析。 FRET是一种荧光团1之间的非辐射能量转移的。它有一个效率是成反比的供体荧光团和受体荧光团之间的距离的第六功率。因此,它可以提供有关的空间距离在纳米尺度两个不同分子之间或跨越一个分子的区域的信息(通常为1 - 10纳米)2。供体和受体荧光团可以是不同的Molecule类型(杂-FRET),其中该供体具有更高的能量发射(较短波长),或者相同类型的(同型FRET)。 FRET成像可以在固定的或活细胞中进行,但在一般的固定细胞用于分子间的相互作用的成像在高空间分辨率时高速共聚焦系统不可用。活细胞用于研究的相互作用和过程被抑制或通过定影改变,如实时细胞内信号响应3。

雇用活细胞研究FRET显像使用二维(2D)细胞培养物中,因为简单和低的背景(无从平面外的细胞的发射)的一部分。然而,2D培养物也相比于生理微环境和三维(3D)培养4,5-改变众多细胞过程。例如,细胞和细胞外基质相互作用天然细胞被彻底改变在二维培养导致EASILY观察细胞形态和极性6的变化。膜微( 例如 ,小窝和脂筏)和受体信号强烈的文化环境,因为它们结合细胞骨架7,8和细胞形态和细胞骨架结构在很大程度上受到空间的养殖环境调控9上调,部分。机械传导不仅由3D矩阵的影响,但由更复杂的二级载荷条件在3D环境主义及其相比2D培养物10。最后,三维矩阵的渗透率小于培养基,一般具有降低的扩散和增加的信号传导分子相比2D培养细胞的结合。与3D培养人能够创建并观察一个微环境更类似于生理相对于粘合剂,化学和机械的线索。细胞与细胞的相互作用可促进和粘接性能能够控制瓦特第i个的结构中,组合物,和3D材料11-13的体系结构(图案形成)。该材料的机械性能同样可以通过组成和结构14,15量身定做。培养细胞在水凝胶,因此允许FRET上,否则将去分化的原代细胞或使用常规技术在表型变化, 例如研究中,从关节软骨细胞。因此,需要一种方法,以使在现场的3D培养物的FRET测定。

水凝胶的支架是理想的基于三维的FRET的研究,因为它们可以被制成光学透明,并适合控制微环境,并提供蜂窝线索。从天然聚合物制成的水凝胶已经在细胞培养中使用了几十年,包括明胶和纤维蛋白16。在细胞微环境更大的控制可以与这些聚合物的化学改性,并与使用合成聚合物17,18来实现。 HYDRogel机械刚度和渗透性可以通过改变它们的聚合物组合物进行控制和网眼尺寸(聚合物和交联密度)19,20。此外,水凝胶可以通过生长因子和细胞的配体的结合进行的生物活性。由于这些可能性,水凝胶生物传感,药物输送和组织工程应用的发展研究21一 ​​个非常活跃的领域。水凝胶的三维打印也正在开发微型组织制造和-organs 15。因此,在水凝胶的细胞FRET成像不仅作为近似生理细胞行为的手段是有用的,但也可作为工具来研究和优化工程化组织的生长。

二进制比率的FRET探针是在研究细胞信号传导非常有用的,可以在水凝胶培养物被利用。对于荧光公布的部分名单,FRET探头,看到细胞迁移联合会网站例如 ,离子或分子,该区域的酶裂解的结合),该改变荧光团,因此FRET幅度(或高或低)之间的距离23。一个不太常见的但却很有用的探头类型依赖于两个荧光基团的光谱重叠,从而改变FRET幅度分析物敏感的变化。 “单链”比例式传感器利用荧光团对上的单分子相连。 “双连锁”探测器利用在不同的分子荧光团对,但他们的表现可以在相同的表达盒24下耦合。不同于单一的荧光表达研究( ,荧光融合蛋白),研究与比率FRET探针不需要双重转染,以控制转染效率或细胞生存力。最低门槛(浓度不敏感)23,25以上时,表示比率FRET探针是相对不敏感的转染效率。它们是不敏感的激发源的波动和其它细胞内环境因素( 例如 ,pH值,离子),只要这两个荧光团也同样敏感。此外,他们的反应是不受转录延迟,不像荧光和生物发光启动子-报道构建26,27。

成比例的FRET探针轻松,频繁地在传统的宽视场落射荧光显微镜系统中采用。宽视场显微镜优于由于超过系统成本,荧光漂白,并以足够的时间分辨率信号改变捕获的关注线扫描共聚焦系统为活细胞成像。另外,单电池肛门ysis在一个人口众多的细胞是可能的机动阶段和图像采集了多视野。广角镜需要异质FRET探针信号的强度基础分析。虽然强度分析不需要像其他的FRET方法复杂的硬件,更采集后工作是需要以校正荧光行为和显微镜/成像系统配置28的影响。荧光团的拍摄发光强度的激发能量的函数,荧光量子产率,并且将合并的过滤器和相机/检测器的光谱灵敏度和线性度2。这些可以是不同的供体和受体,并且需要进行定量分析的校准。此外,该受体发射的成像由荧光团的光谱重叠的影响(受体的激发供体激发光和渗出通过供体发射的到受体发射光谱)2。4单链“探针内部归因为它们的荧光团等摩尔在纳米尺度,而荧光团”双链“探针可以在不同的化学计量存在整个电池25,28如果荧光团。”单链“探针是相似亮度(消光系数和量子产率的功能),非线性检测器的灵敏度的效果是对于背景荧光和耦合量子收率/检测器的灵敏度,需要23小并且仅校正的。因此,“单链”比例FRET探针是最容易在广角镜24实现。

本文介绍一种简单的技术来执行使用传统的宽视场啶显微镜在三维水凝胶文化的活细胞成像FRET。它可以通过已经开展二维FRET实验,以及有意间实验室的实验室很容易地通过在microtissues细胞信号。在这里,我们证明用环磷酸腺苷(cAMP)的光交联内活软骨细胞水平(PC-凝胶,聚乙二醇二甲基丙烯酸酯)和温敏(TR-凝胶,基质胶)水凝胶的FRET成像基于测量的方法。进行比例FRET探针是基于EPAC1(ICUE1)来检测响应佛司可林,对腺苷酸环化酶的化学激动剂其催化ATP向cAMP的转化cAMP水平利用。的cAMP是主要的第二信使介导的G蛋白偶联受体信号之一,并激活各种因素,包括由腺苷(EPACs)直接激活下游交换蛋白。荧光团移动分开时cAMP结合,导致在FRET的减少的EPAC域。这里所描述的是水凝胶材料的在三维水凝胶的细胞的制备中,细胞转染与ICUE1探针和嵌入。三维FRET实验程序和必要的图像分析以评估每个细胞活性探头解释。我们还讨论了在2D和3D用广角镜FRET分析的内在局限性。这里提出的技术是在现有的二维方法的改进,因为它使在一个更生理上下文分析和需要更少的图像校正和校准。极大效用在于,可用于许多透明材料,同时细胞和转染的偏好可以维持这一事实。

Protocol

1.材料准备

  1. 通过根据由林Gibson 29中所述的方法methacrylating聚乙二醇制备聚乙二醇二甲基(PEGDM,4000兆瓦)。可替代地,PEGDM可以购买。
  2. 合成光引发剂,锂苯基-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate(LAP),通过一个两步过程,其中第一二甲基苯基亚与2,4,6-三甲基氯化物经由米歇尔 - 阿尔布佐夫反应,然后将锂盐反应由在2-丁酮中添加溴化锂,按照间岛等人的30创建的。
    注:另外,其他光引发剂可以购买,但LAP表现出更好的生物相容性和交联效率31。
  3. 官能化的玻璃盖玻片,以使水凝胶的粘合至玻璃,从而防止在成像期间移动。
    1. 在化学罩与适当的个人防护装备,利用根据制造商的PC的凝胶和环氧硅烷(3-环氧丙氧基丙基)为TR-凝胶31协议3-(三甲氧基硅)丙基甲基丙烯酸酯。注:另外,预涂幻灯片可以购买。注意,该盖玻片必须比在步骤3.8与PDMS培养皿的孔大。

2.细胞转染

  1. 在组织培养罩,并使用无菌技术,解冻和板在亚汇合的期望的细胞(50 - 70%),在此牛软骨细胞以15,000细胞/ cm 2在6孔未处理培养皿。注意:任何相关的细胞类型可以被使用,包括锚独立细胞。
    1. 允许细胞一天在培养箱中在37℃恢复。后续的步骤之前,除去培养基,用PBS冲洗,每孔加2ml苯酚和无血清培养基。
  2. 每个第二天均匀,加入苯酚和无血清培养基中的100微升以及3微升转染试剂到一个蒸压玻璃试管。搭配,轻轻摇动管。孵育在室温下5分钟。限制任何曝光。
  3. 加入1微克FRET探针DNA,轻轻摇动。孵育混合物在RT和避光进行30分钟。
    注:在这个实验中ICUE1质粒使用(金章博士33提供)。在ICUE1的荧光团青色荧光蛋白(CFP,供体)和黄色荧光蛋白(YFP,受体)。转染试剂的质粒DNA中的比例将需要为不同类型的细胞的最佳转染调整。
  4. 分发制备的混合物(〜104微升)逐滴向每个含有细胞加2毫升苯酚和无血清培养基的6孔中。不要吸管向上和向下。轻轻地摇晃板混合。
  5. 孵育在37℃下48小时。注:抑制会合转染效率并改变受体的内源表达。

3.制作PDMS压模铸件水凝胶与文化

  1. 要准备一大杯幻灯片投射的聚二甲基硅氧烷(PDMS)上,用肥皂先清洁玻璃,冲洗用丰富量的水,然后用异丙醇接着风干。
    1. 用硅化试剂根据制造商的协议处理的玻璃,以使PDMS可固化后可以容易地剥离。冲洗残留的试剂与甲苯通过集水容器表面。使表面与空气完全晾干后方可或使用热在100℃,以缩短等待时间。
  2. 选择的水凝胶高度( 例如 ,1毫米)和计算的PDMS的1.2倍体积需要覆盖用玻璃载片和水凝胶的高度的尺寸,该厚度的PDMS中的载玻片。注:PDMS不缩水。
    1. 混合PDMS试剂盒组分以10:在一烧杯1的比例(重量)。一旦混合均匀,放置室内真空脱气下的烧杯中。相对ieve真空气泡是否开始溢出容器和重复。
      注:其他水凝胶的厚度可以被使用,但在增加的背景的成本,如果离心分离(步骤6.2),不使用增加透明度。
  3. 包裹铝箔基地周围和玻璃的侧面以包含PDMS。小心倾脱气PDMS所需量到该玻璃由箔包围。测量PDMS高度。请注意,所述PDMS的高度将是在水凝胶的最大高度。如果浇筑时创建任何气泡,再脱气或用压舌板或针弹出他们。
  4. 放置在水平表面上的未固化的PDMS在烘箱中于100℃进行2小时,或在室温下保留24小时。
  5. 一旦固化小心地从表面去除PDMS。切出的凝胶所需的形状( 例如 ,3毫米的圆柱形冲)。
    注:光交联将产生稍窄PC胶缸比由于模具直径由分子中的氧的PDMS反应淬火。
  6. 消毒打了个PDMS。对于短期实验,浸没在70%的乙醇的PDMS 1小时。
  7. 由无菌的PDMS基底的厚度相匹配的显微镜物镜校正的无菌玻璃盖玻片嵌合组装模具。抛开在第6步使用。
  8. 制造使用上述方法(具有比水凝胶以及更宽,更高),以含有水凝胶和介质更大的PDMS菜。容纳中等音量比水凝胶浸泡水凝胶,并尽量减少分析物稀释至少10倍以上。

4.水凝胶前体溶液的制备

  1. 在组织培养罩,并用无菌技术,立即加入细胞前准备水​​凝胶前体解决方案,适用于研究。从聚合物前体制备的PC-凝胶如下。
    1. 混合PEGDM粉末到磷酸盐缓冲的盐水(PBS,pH7.2)中在10%(重量/体积)。
    2. 为0.005的终浓度添加光引发剂( 例如,LAP) - 0.01%(重量/体积),并通过移液混合。从灯罩用铝箔或屏蔽的溶液,作为LAP对光敏感。
      注意:在这里使用的TR-凝胶减少的生长因子的细胞外基质如由制造商提供。

5.水凝胶解决方案细胞悬浮

  1. 在组织培养罩,并使用无菌技术,吸从孔的介质。
  2. 加入PBS的孔中,然后取出彻底的冲洗附着细胞单层。
  3. 使用每细胞解离溶液为25cm 2 2至3ml培养底物解离的细胞。轻轻摇动,然后在37℃孵育10 - 20分钟或直到分离。坚决挖掘菜如有必要,打跑细胞。
    注:备用细胞分离解决方案可与选择仅限于那些没有我通过裂解的兴趣受体MPACT所分析的信号传导途径。
  4. 将细胞脱离后,加2ml苯酚和无血清培养基中,悬浮细胞,并计数细胞与血球。注:经化学定义的无血清培养基( 例如 ,补充有胰岛素,转铁蛋白和硒)也可使用。
  5. 等分根据该信元类型到无菌小瓶中并沉淀( 例如,每小瓶2.0×10 6个细胞)的细胞所需的号码。
  6. 除去上清液,添加水凝胶前体的所需体积并通过移液悬浮细胞。使用前体的体积可视化水凝胶的z轴时作为折叠,将产生2×10 5个细胞/ cm 2在xy平面( 例如 1.0毫升,每小瓶含2×10 6个细胞1mm厚的水凝胶/ ml)中。注意不要产生气泡。
    1. 迅速转移到下一步骤,以限制对细胞活力34的负面影响</ SUP>。

6.水凝胶制剂

  1. 在组织培养罩,并使用无菌技术,将含细胞的水凝胶的前体添加到在步骤3中制备的铸造模具( 例如 ,每3毫米直径×1mm的高模7.1微升)。创建一个额外的水凝胶,根据​​所描述的相同的方法,以用于显微镜成像系统的校准和探头校准(如果固有探针效率是未知的)。
  2. 离心机制备的水凝胶前体凝胶化之前/交联通过限制细胞到单个焦平面并减少平面外的信号,以优化成像含细胞( 图1)。调整离心时间和力的前体(400克4分钟)的细胞类型和粘度。
  3. 凝胶或交联解决方案
    1. 为PC-凝胶的水凝胶,照射用UV-A光源(λ= 365纳米),用于曝光时间等于所述含细胞的前体为3.2J ​​/ cm 2的每毫米厚度photocrosslink。
      注:在计算使用1毫米的最小厚度。暴露应该倒在1-5分范围内。用最小的曝光时间。避免过度照射细胞,因为这会降低活力和漂白CFP供体。然而,不推荐使用的曝光时间60小于是因为高强度辐射导致自由基的自猝灭和差细胞活力。
    2. 对于TR-凝胶的水凝胶,将填充的模具在培养皿并移至孵化器进行热胶凝。孵育在37℃下30分钟。
  4. 胶凝或交联水凝胶后,取出PDMS水凝胶铸造模具,并与准备较大的PDMS菜(从步骤3.5)替换它。按PDMS下来到玻璃用无菌抹刀坚持它。
    1. 放置此PDMS盖玻片到无菌容器中,菜如培养皿。添加含酚的无血清培养基或化学成分确定的我dium(无血清培养基补充有胰岛素,转铁蛋白和硒(步骤5.4))与井与PDMS菜和盖玻片保持浸渍水凝胶创建。孵育在37℃下30分钟。
      注意:如果使用一个专门的菜盖玻片,然后将盖玻片在同样添加网上平台。
    2. 交替,FRET成像之前执行该步骤中一天以允许探针以回收作为照射波长与CFP施主激发光谱重叠。

7.三维成像FRET

  1. 与从培养皿的水凝胶,在步骤6.4制备除去PDMS皿中,在用于在XY显微镜阶段( 图2)可调节的试样夹持器固定。在显微镜舞台样品夹的位置。如果需要,应用油的目标。使用的至少40X和高数值孔径(NA)的物镜( ,1.3的NA)来捕获相对较弱的荧光体Ë排放。
  2. 配置的角度进行图像采集领域(视场):选择单元格使用透射光成像成像和验证与荧光成像转染。选择的至少15个不同的细胞。
    1. 选择单元既不是太亮,也不太暗(其否则可能导致探针过饱和或低灵敏度)中,用0.0和1.0之间的FRET比率(否则指示损坏或二进制探针的衰减)。然后关掉灯,以限制曝光。
    2. 接近水凝胶的中心和带的相对平坦的照明场中感兴趣的细胞中选择视场(参见图3B和下面的步骤9.2)。
  3. 配置的FRET图像通道相机设置。附近的FOV的中心的少数细胞中进行选择,优化了“光学配置”( ,曝光和每个图像通道增益)。
    注意:下面的命名有所不同,取决于不克,以用于操作显微镜和照相机的软件。显微镜软件NIS元素,在这里用于图像采集和分析。
    1. 对于单链探针FRET分析,选择每FOV两个图像通道:淬火发射(QE),这是根据在接受激励(AEM)捐助激发和受体发射的供体发射。
      注意:对于ICUE1 CFP-YFP探头,CFP激发和发射滤波器对量化宽松政策(418 - 442前,458 - 482 EM)和YFP激发和发射一对AEM(490 - 510前,520 - 550 EM)被使用。
    2. 设置QE和AEM收购不饱和的最大信号强度曝光(如果使用的是CCD,具有最小可能的增益),以尽量减少背景噪音。保持光学配置相同的两个荧光团和整个实验,以及实验组,以避免施力的结果( 即,激发功率,虹膜的大小,曝光和照相机增益)之间( URE 3A)。
    3. 获得额外的图像通道,以便收购后更多的分析选项( 例如,纠正致敏发射(CSE)成像(见讨论))。对于ICUE1 CFP-YFP探头,获得激励(防爆)和Ex 供体发射(EM)通道-电磁 (QE,选择CFP-CFP在显微镜软件),前供体 - 受体 EM(SE,CFP-选择YFP),前受体 - EM 受体 (AEM,选择YFP-YFP),和Ex 受体 - EM (YFP-CFP)配置(参见图3A)。
  4. 配置时间推移图像采集的捕获率。
    1. 降低捕获率,如果受限于硬件。短期分析( 如,30 - 60分钟),表示每分钟12左右收购的每个FOV(5秒的采样率)来捕获信号动力学。使用所需的最低采样率,以避免显ficantly漂白探头。
    2. 通过在显微镜软件键入捕获的周期性设置采集速率。长期试验( 例如 ,24小时),以高获取速率开始捕捉初始脉冲响应,然后切换到一个低的采集速率, 例如,每5至10分钟。
  5. 请在显微镜软件“立即运行”以启动图像采集,采集图像5分钟建立在指定的视场探测响应的基准。
  6. 在所需的激动剂或拮抗剂的分析物5分钟图像采集,吸管的( 例如,毛喉素在100nM)后,通过移液混合,并继续成像。

8. FRET校准

  1. 系统校准:如在步骤6中所述使用额外的校准的水凝胶,制造,使用相同的视场的标准,光学配置和相机集获得至少6代表细胞AEM图像吊环用于FRET成像以上(步骤7.1,7.2,和7.3)。
    注意:需要用于“绝对”FRET分析,但不为“亲属”FRET为组合探针和显微镜成像系统的量子产率和光谱灵敏度(QS)的定量。
    1. 通过在全强度(上AEM通道激发)选择一个5分钟长时间暴露在激发光光漂白的受体荧光团。使用较小的光圈漂白的利息只有细胞。验证AEM信号比原始信号低至少10%的前和漂白后的信号强度直方图(“LUT”窗口)进行比较。继续漂白如果信号损失小于90%。
      注意:确保通过使用不与供体激发光谱重叠AEM激发滤光片的供体荧光团在此过程中不漂白。
    2. 获取供体发射下捐助激励与现在漂白受体荧光(DEM)美国ING相同的光学配置,在步骤7.3 QE。
    3. 计算每个像素QS作为民主党背景校正后由AEM划分,如下面第9节。 QS =民主党/ AEM
    4. 计算平均的QS从蜂窝平均值的小区中。
  2. 估计使用校准样品探头(EI)的固有的FRET效率。诱发探头的最大FRET并计算荣= 1 - QE /(AEM x质量得分),如下第9条。或者,使用荣= CSE / AEM,荣或使用FRET效率荣= 1的常规检测端点计算 - (QE / DEM)。
    注意:Ei的需要量化激活探针(FAP, ,探针结合分析物的级分)的绝对值部分,但没有必要为“亲属”FRET分析。
    1. 通过浸透分析物的生产/激活的探针与分析物相互作用后增加FRET激动剂刺激文化探测响应。
    2. 抑制探头interactioÑ​​使用该结合后的分析物中的FRET减少探针信令的拮抗剂的分析物。注意:在ICUE1探针的情况下,与腺苷酸环化酶抑制剂例如2'抑制cAMP水平,5'-二脱氧腺苷(特定)或3-异丁基甲基黄嘌呤(非特异性)。

9. FRET比的计算

  1. 绘制和指定的每视场的感兴趣的细胞来定义每个视场随时间背景水平( 图3B)附近的一个区域,但限制在ROI相对均匀的照明的区域在图像的中心( 图4A )。见讨论为背景校正选项的说明。
    1. 用显微镜软件:在“后台ROI图标”选择箭头,然后选择“绘制椭圆背景的投资回报率”(其他形状将工作)。确保“不断更新的背景偏移”被选中。激活争夺通过单击背景ROI图标背景的投资回报率的翅膀。或者,用“投资回报率图标”并设置为“使用为背景的投资回报率”和“投资回报在每个不同的多”的投资回报率的特性。
    2. 随着ImageJ的:使用工具栏选择圆形绘图工具。然后通过菜单中的形状添加到投资回报率经理“分析→工具→投资回报率经理”。如果需要设置不同的颜色在ROI管理背景的投资回报率。
    3. 对于每一个FOV和图像通道( 例如,QE和AEM),减去每个时间点的背景ROI内的平均值为每个频道建立一个校正的图像, 例如,SQE T,P = QE T,P - BQE T,P其中t是采集时间,p为在FOV( 即,XY位置),和BQEBAEM是背景的ROI内的信号的标量值。使用软件中的可用图像运算功能。
      1. W¯¯第i个显微镜软件,使用“投资回报率的背景图标”,然后选择“扣除背景使用的投资回报率。”在弹出的窗口中,选择“在扣除背景的投资回报率”下的“每一个形象”,并选择在“应用到”“所有画面”。
        注:背景的投资回报率必须在每个视场被定义为这个功能正常工作( 例如 ,功能不能正常减去背景的FOV背景的投资回报,如果一些FOV有不确定的背景的ROI)。
      2. 随着ImageJ的,使用由迈克尔Cammer编写的宏(http://microscopynotes.com/imagej/macros/)中的“从投资回报率BG减法”。
    4. 通过选择“保存为”用于以下分析步骤保存校正时间序列图像。
  2. 定义使用为每个视场( 图4B)下分析每个小区的二进制掩模的小区周围的ROI。使用AEM通道阈值,每个视场图像在启动OF中的实验,发现细胞的边界,明确的投资回报。保存的投资回报。
    1. 用显微镜软件:对于每一帧( FOV),先使用菜单中的“二进制→定义阈值”,选择“应用到当前帧”。调整下限阈值来选择细胞。然后使用“二进制→关闭”功能,如果有必要填补漏洞的二进制掩码。接下来使用ROI图标,选择“复制二进制到投资回报率”;二进制层被自动删除。
      1. 追加的投资回报为后续帧的ROI的现有池。删除任何杂散的投资回报。接下来的投资回报“右击”,并确保它们的性质“用作标准的投资回报率”和“投资回报在每个不同的多”。
      2. 随着ImageJ的:对于每一个FOV,首先使用菜单“图像→调整→阈值”。然后使用“分析→分析粒子”与显示轮廓和添加到选定的经理。使用如有必要,“二进制→关闭”,以填补“漏洞”中的二进制掩码。删除虚假的投资回报。免费插件可自动执行此过程。
  3. 计算在每个像素的基础QE FRET比率,SQE / SAEM相对分析(见步骤10)和E QE = SQE /(QS点¯xSAEM),用于在步骤8.1获得的绝对分析(见步骤10)QS。使用图像的浮点除法。请参阅比推导的解释,讨论部分。
    1. 用显微镜软件:使用菜单“图像→图像操作”,然后选择“浮点型”。
    2. 随着ImageJ的:请使用“处理→图像计算器”功能或“Calculator_Plus.java”插件。注意:可替换地,宏“pH_ratioMacro符”.txt“可以适于以计算的FRET比率它采用上述的背景校正宏和提供的。
  4. 导出每个细胞的平均比值(即每ROI)到电子表格和图形软件。
    1. 用显微镜软件:在“投资回报率统计”分析控制或者在“时间分析”分析控制“电子表格导出”按钮,请使用ND导出按钮。
    2. 随着ImageJ的:首先选择菜单“分析→设置测量”,并选择确定“平均值”和“标准差”。然后使用ROI管理器并选择按钮“测量”。保存生成的结果窗口。

10. FRET比率分析

  1. 从每个细胞的平均比率计算随时间的平均蜂窝FRET比率(步骤9.4导出)。考虑基线在该计算(施用分析物前的比率)FRET比率。
    注:电子表格和图形软件在这里用来绘制基线subtr行事平均FRET比率和使用上的基线的线性回归的平均(SEM)的标准错误,如步骤10.1.2和10.1.3以下( 图5和6)。
    1. 相对分析(响应的幅度):规范化每个曲线到公共参考样品( 例如 ,未处理的样品)。
    2. 绝对分析(响应的时间过程):由归其基线每条曲线移曲线到公共起点FRET比率。
      1. 在电子表格和图形软件,交织数据与新列,使得每个原始列以仅包含比数据为基准期的新列配对(每单元平均比列)(比前加分析)。选择“插入列”数据的每个列后插入一个空列。然后基线数据复制到配对空列。
      2. 在电子表格和图形软件,选择“插入→新建→分析TRANSFORM删除基准“,然后设置”选择列“,以”隔“,选择”假设基准线是线性的“,并选择”差异计算“下的”“。
      3. 计算平均细胞比率和描述性统计。在电子表格和图形软件,选择“插入→新建→分析分析XY行→意味着SD或SEM”,然后选择“行与SEM手段”,在弹出的窗口。

Representative Results

如上所述制备所有水凝胶前体,细胞和铸模。小区载货前体溶液流延在PDMS模具,然后凝胶化之前离心/光交联固定化细胞的盖玻片附近并促进FRET成像分析( 图1)。附带盖玻片水凝胶置于准备PDMS成像井显微成像( 图2)内。光学配置和图像采集参数然后设置为如图3A所示。为CFP-YFP荧光团对所有四个FRET相关图像通道的捕获证实(参见“光学CONF”。在图3中),因为需要对非二进制探针。然而,在这项工作只有两个图像都需要对单链二元ICUE1探头,QE =“CFP CFP”和AEM =“YFP YFP”(激发发射)。多视场(XY位置多个)被选择,其中几个细胞的均匀的照明区域( 图3B)内居住。时间的推移收购完成后,将探头信号导出数据。感兴趣区为信道信号的背景校正和细胞分析采用阈值AEM图像从实验( 图4)的开始被指定。从细胞池因为这些表达中选出足够的细胞(不是太暗淡),但不能太高(太亮)探针( 图4B)。在每个采集每个象素的QE和SE的FRET比率使用背景相减图像通道的浮点除法计算。每个细胞的平均FRET比率(即每ROI)计算归一化到之前刺激基线信号( 即,来自所有时间点中减去基线回归),并用误差棒为一体的标准误差作图平均(SEM)。无论是QE和基于CSE FRET比德TECT下福斯克林刺激(100纳米, 图5)软骨细胞的cAMP增加的活性。在QE FRET比是比CSE FRET比背景校正更敏感,因为QE信号由于嵌入水凝胶内的cAMP软骨细胞活性的低基础水平较低。这两种水凝胶类型的(TR-凝胶和PC-凝胶)显示在FRET比率随时间增加( 图6),这表明在加入毛喉素的增加cAMP的信号传输响应。正如QE FRET比表示,在PC-凝胶水凝胶软骨细胞显示cAMP的变化较大(如图所示)和cAMP(E QE更高的基础水平= 0.19 PC-凝胶 ËQE = 0.09 TR-凝胶,在基线减去图中未示出)。

图1
图1: 在光交水凝胶(PC-凝胶)细胞分布 答:细胞载货水凝胶前体离心在盖玻片附近焦平面最大化细胞的数目。 B:这增加了视场的细胞数,并从平面外的细胞减少背景信号。 (比例尺= 200微米) 点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:水凝胶在PDMS菜
水凝胶放在盖玻片基地显微成像和分析物刺激一个高大的PDMS良好(10倍量水凝胶)内。在PC-凝胶水凝胶是透明和结合到盖玻片,使它们保持在适当位置在整个测定法。将PDMS孔可以增大以包含比使用除了在更宽的活检穿孔,水凝胶体积的10倍多平台hicker PDMS表。 (比例尺= 2mm)的请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3: 采集配置FRET成像
答:本次收购在多个位置配置了图像采集每7秒。对于QE FRET比例计算,只需要两个图像通道的下此处使用的ICUE1探头(二进制单链探针),QE =“CFP CFP”和AEM =“YFP YFP”(激发发射)“光CONF。”在显微镜软件的λ标签栏。 A:视场(“XY”位置)被选中,其中几个细胞均匀的照明区域内居住。图像下面的图显示沿着蓝色的光照强度箭头线遍历通过FOV的中心。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:FRET成像分析投资回报率的选择
答:利息率(ROI)游离细胞的一个区域选择纠正每个通道的背景信号。无细胞的水凝胶的图像可以替代地用于背景减除如果细胞密度或迁移是高,或者如果当细胞不均匀的照明场中位于阴影掩模不被使用。 B:使用图像阈值与AEM通道的二进制掩蔽被选定单元格的投资回报。选择比细胞大的投资回报率将每个细胞的平均比例FRET计算产生不利影响,由于夹杂背景ñ产生的胞外比率瓦兹。不建议使用每个小区的每个信道的平均蜂窝FRET比率的计算,因为这低估的比率。 (比例尺= 50微米), 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5:FRET比率的温敏凝胶(TR-凝胶)的比较
无论QE和基于SE FRET检测的比率下毛喉素刺激软骨细胞的cAMP增加活动。毛喉素是一种腺苷酸环化酶激动剂诱导cAMP的产生。当ICUE1探针结合的cAMP FRET减小,并且因此QE FRET比(E QE = SQE /(SAEM x质量得分))增加。相反,SE FRET比率下降,因此绘制为E SE = 1 - CSE / SAEM。在水凝胶嵌入式软骨细胞,在QE˚FRET比率是背景校正比SE FRET比率由于QE信号为低更为敏感,由于低的基础cAMP的活性。误差棒= SEM,N = 25。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
6: 不同的水凝胶FRET率的比较
在这两种类型的水凝胶的软骨细胞回应毛喉素刺激这表现在增加QE FRET比例随时间增加的cAMP活动。水凝胶型的影响通过多个作用,包括在渗透性福斯克林和基底细胞cAMP活性的差异的细胞反应(E QE = 0.19在PC的凝胶 ÊQE = 0.09在TR-凝胶,未示出)。误差棒= SEM,正为TR-凝胶= 25,正为PC-凝胶= 15。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

这项工作表明FRET成像如何可用于分析细胞信号在三维水凝胶。虽然现有的研究已经表明与水凝胶38接种在水凝胶基质35-37,细胞外相互作用的细胞的FRET成像和截留在水凝胶39-41的分子,这是第一次出版物描述嵌入细胞FRET成像基于细胞的分析3D水凝胶。从2D转换FRET成像3D时,工作解决了一些执行问题。首先,需要高数值孔径目​​标FRET成像收集到足够的发射信号,但它们限制景深。这里的允许细胞通过离心来增加细胞数目的焦平面玻璃附近以补偿此稍向定居。第二,三维水凝胶支架可变得复杂分析成像期间横跨视场漂移。水凝胶在这里被结合到COVerslip使得它们保持固定在整个实验。因为水凝胶可能会阻碍细胞的可视化三,3D FRET适当的水凝胶组合物的选择是至关重要的。 PC-凝胶和TR-凝胶这里透明的水凝胶被使用。然而,收集用离心分离使细胞在盖玻片附近的焦平面可以用于图像的细胞在水凝胶具有较高的水凝胶的衍射仪选择取决于微环境条件必须模拟,其可在评论中找到对凝胶42 。第四,一个备用计算此处使用的单链ICUE1探针的FRET比率( ,E QE = QE / CAEM),以尽量减少分析所需的图像的信道数,从而减少光漂白。每个细胞的平均FRET比率被计算为平均每像素的比率的小区内,以尽量减少实际的FRET比率的低估。最后,一​​个线性比例分析和装置计算单链二元探针的激活的级分进行说明。

有使用广角镜进行成功的FRET实验的几个关键方面。对于硬件,相机必须足够敏感来解决小信号变化,而使新科学的CMOS摄像机和电子倍增CCD比传统的CCD更适合。到最好的分析的FRET比率的空间分布,相机必须至少具有物镜(奈奎斯特准则)的点扩散函数的空间分辨率的两倍。这使得双视图系统不太适合的任务。更关键的是,选择用于给定FRET对适当的曝光和图像采集速率以便最小化的荧光团的光漂白。降低采集速率被推荐为实验的持续时间增加。使用快速滤光轮的提高采集速率和视场进行分析,同时避免了数ING与双视图和炮塔滤镜立方体图像配准的问题。不均匀的照明领域的复杂化,从样品自发荧光和摄像头的系统噪声产生的背景荧光校正。一些水凝胶,特别是那些含有胶原蛋白是高度自体荧光43,44。该FRET比率被低估没有背景校正。在这里,我们采用依赖于它可以经常与落射荧光照明在图像上( 图3B,步骤7.2)的中心被配置在相对 ​​平坦的照明场的简单的背景校正方法。因此,这种方法限制了感兴趣的那些该照明领域内的细胞。这里所描述的背景校正不考虑在读取二进制探针波长蜂窝自发荧光。在这样的情况下,未标记的细胞(无探针转染)应在相同的条件和背景减去下进行成像。 A M可以使用标记和未标记的细胞的九和选定为背景的ROI的未标记细胞。这为在整个图像领域细胞分析替代方法包括使用遮光膜的,多背景的投资回报,或相同的样品不含细胞和协议可应要求提供。

具体到3D FRET成像,探测响应是向水凝胶渗透性分析物( 图6)高度敏感。因此相同的水凝胶区域横跨实验处理相比,优选在几何对称点如邻近如这里使用的支架中心。可替代地,微流体腔室/生物反应器可用于迅速而均匀地灌注与分析物溶液45的水凝胶。音柱信号可能不会被检测到(信噪比过低)时,水凝胶的自发荧光过高;应使用的较薄的水凝胶或不同探针(不同的荧光团)。在光交联水凝胶相对于3D FRET成像,建议使用最小辐射曝光和探针的荧光团的激发光谱外的波长。 LAP可以与可见光源在405nm被用来进一步减少潜在的细胞损伤31,46。但是,建议使用365纳米的照射LAP因为这减少了探测器漂白。 365nm处在于在CFP施主激发光谱的尾端,而405nm处在于在峰值激发。可替代地,探针的表达可以被允许一天恢复。二进制探针的使用最小化灵敏度的问题,以在表达水平,并在供体和受体荧光团的分子扩散的差异。非二进制探针可以被使用,但具有SE代替QE成像和附加校正激发和发射光谱的光谱渗出至(见下文)。此外,低商业可用性和设计的FRET探针的复杂性可能是一个障碍。对于成功的实验的最关键因素仍然是荧光信号的适当的修正和分析。

FRET的比率的替代计算被用于除了光漂白的最小化几个其他原因。对于二进制单链探针时,常见的比例是根据捐助者的激励(致敏的排放,SE),以供体发射下捐助激励(淬火排放,QE), 受体发射,FRET比= SE / QE 25,47,48。 SE / QE是非线性相对于FRET效率21,22,47变化。即,该比例具有与探针(EI)的固有的FRET效率的指数的非线性关系(Donius,AE,Taboas,JM 未发表的作品。(2015)),与荣小于大约15%的比例最线性的。 SE / QE还将低估激活探针(FAP, 即,探针结合分析物的级分)的分数。 Therefo再次,SE / QE的分析需要繁琐的平衡剂量反应研究,曲线拟合。幸运的是,SE或QE到受体发射下受体激发的比例(AEM)是相对于Ei和FAP, 直链的,所述的FRET比率SE / AEM和QE / AEM。 SE / AEM通常用于二进制探针,只需要结束点校准(在无探针的活性和全探针活性),但基底细胞信号使这个困难。为了消除对端点校准的需要,SE能对供体和受体的激发和发射光谱的光谱重叠(光谱泄放通)和用于将合并的探针的荧光团和显微镜的量子产率和光谱灵敏度(QS)进行校正(CSE)成像系统。基于CSE校正后的SE的FRET比率限定的图像, 即,E SE = CSE / AEM的每个像素内的探针的观察FRET效率。商业和免费软件可供SE纠正这些影响和读者可参考陈和2006 Periasamy的工作的方法50的详细说明。但是,计算êSE要求每个时间点(SE,QE,AEM)三个图像通道捕获。因此,在此工作中,我们也使用一个替代的FRET比E QE = 1 - QE / CAEM,其中只需要两个图像通道的捕获(QE和AEM)。从这些渠道计算ËQE只需要修正为AEM QS(CAEM = AEM x质量得分)。 QS = DEM的/ AEM利用从一个校准样品,其中,数字高程模型是根据供体激发的供体发射与受体漂白两个图像容易地估计。 FAP的在任何时刻可以用E SE或E QE比较探针的荣来计算。

最终,FRET比选择(E SE = CSE / AEM ËQE = QE /航空气象学委员会)应基于考虑探头类型,并与最佳的信号通道。既是pproaches包括如上所述以考虑随时间的自体荧光的改变每帧的图像的背景噪声的校正。他们不承担任何AEM激发光重叠到民主党激发光谱,这往往是由于探头设计和显微镜的过滤器配置的情况下。单链探针可以使用和选择是基于最好的探测信号(亮度)到相机噪声,并就SE和QE通道背景信号。对于ICUE1探头和这里使用的实验条件(细胞和水凝胶型),SE比QE更强的信号。双链探头需要采用E SE由于供体和受体荧光团非等摩尔分布。对于在结合分析物如ICUE1在FRET降低,FRET效率可以“倒”呈现在结合分析物的积极信号的变化,因为我们在这里做的,有E SE = 1探测器- CSE / AEM或E QE = QE / (AEM x质量得分)。

日分析ËFAP是对FRET比率适当修正,并荣的估计敏感。它可以与用于QS上的相同的校准样品和常规的端点来估计FRET效率测定为荣= 1-(QE / DEM)(QE图像后跟受体漂白和DEM的图像)28,但必须小心,以尽量减少捐助意外漂白。我们描述那里调整QS的民主党基于AEM估计被取代,修改后的版本,即 ,EI = 1 - (QE /(AEM x质量得分))。交替,可以使用荣= CSE / AEM。在活细胞荣估算,要求所有探头被驱动到全FRET。这是在实践中难以为探针,如ICUE1即在结合分析物中的FRET减少来实现。使用细胞裂解物和纯化的分析物荣的体外基于计算是最好的,但这种工作的范围之外。在这里,我们建议使用2',5'-二脱氧腺苷,以减少在细胞内cAMP。然而,一个相对的FAP可be。使用从信令的基线水平得出的EI估计计算。由于这些原因,研究最经常报告基于端点校准,其中加入激动剂之前,信令基线是下界和信号并称饱和信令的第二激动剂后的FRET比率(如这里完成)或相对FAP在上界。福斯克林常被用作对照激动剂饱和的cAMP信号。交替,可以使用cAMP类似物如8- Bromoadenosine 3',5'-环一磷酸。在的研究,以确定在试验性治疗中的信号传导途径的潜在变化的完成使用阳性对照建议。

每个细胞的平均信号传导应答的计算需要考虑的几个因素。首先,将平均FRET比率应计算的平均值的比率在每个像素的小区内, ,(Σ(QE/cAem))/(像素数),而不是岭平均QE和AEM在细胞, (ΣQE)/(ΣcAem)的蒂奥。尽管后者不需要小心掩蔽作为背景噪音低,它严重低估了真实平均FRET比率。然而,像素比值需要浮点运算和单元面积来定义的ROI和避免包含从细胞外的背景噪声产生的寄生比的仔细二进制掩蔽。整个小区区域必须量化以避免对细胞形状偏压的结果。掩蔽可能需要重新定义随时间根据在细胞形状和迁移的变化。或者,如果排除标准定义为从QE并且大大低于细胞水平和接近背景水平AEM信号中去除的像素的比率,可以使用的ROI比电池大。所描述的分析方法的细节在此工作的FRET分析中使用无需专门软件/插件的基本步骤。显微镜制造商和其他供应商销售附加模块S代表他们的显微镜软件,它支持自动比例和FRET分析。同样,公共领域的ImageJ软件具有可用于颗粒和FRET分析几个插件,如RiFRET。第二,基于像素的平均的FRET比率低估,因为2D图像使用三维微孔结构的真正的平均比率。二维信号表示沿z轴的平均值。在活细胞中的FRET比率的三维空间分布的计算是不可能的,而不高速三维成像( 例如 ,使用旋转盘共焦显微镜)。这是二维和三维培养物中的问题,但在3D较大效果更蜂窝结构中存在的平面外。这对定位于细胞结构,例如细胞膜EPAC1探针PM-ICUE探针的极大关注。见Spiering等。 2013年的建议,以修正对比率计算,24电池厚度的影响。 AEM的分布的分析可以用来如果检测探头调节细胞和成像平面的区域聚集。这也将有助于解释FRET比率的空间分布,并消除虚假的结果, 例如 ,识别探针饱和度( 即,低的AEM区域将具有低探针浓度和可以表现出探针饱和和高的FRET比率)。第三,不同的FRET基准水平可以指示在转染效率的差,探测实验组之间的表达,或基底信令。 “相关性分析”(步骤10.1.1)的帮助,如果存在删除漂在FRET比率随着时间的推移。它促进的样品之间的反应的相对大小的比较,但阻碍比较响应为参考样品(对照区是一个平线)的时间过程。 “绝对分析”(步骤10.1.2)便于在样品反应速度的比较,但因为在每行由一个dissim缩放妨碍反应的幅度的比较ILAR不变。研究经常使用在基线上的线性回归以校正在FRET比率随时间漂移。

所描述的3D FRET方法是制造和执行小区载货三维水凝胶,其可以被应用于其它探针和成像方式的时间推移成像有用的和实际的方法。除了单链二元探针其它FRET系统将需要基于强度的信号的更复杂的校正,如上所述。另外,FRET(FLIM-FRET)的荧光寿命成像可用于通过探头供体发射寿命的变化来计算FRET效率。不像基于强度的FRET,FLIM-FRET是不敏感的背景噪声,光谱渗出通过,量子效率,和检测器的光谱灵敏度2。然而,FLIM系统是昂贵的,复杂的,和不常见的,并与单指数衰变的荧光团和无FLIM的径流49工作最好。所描述的方法也可以与莫用于再先进的显微镜平台( 例如 ,FRET的TIRF,荧光各向异性,谱相关FRET)。应用这种方法对三维成像高速共聚焦和多光子显微镜将促进信令响应的亚细胞分布的分析和增加信令分析的准确度。这种3D FRET方法将使模拟3D微环境细胞的高级细胞生物学研究。因此,它可以容易地应用到药理学和再生医学的需求,包括研究细胞间信号传导和筛选在改造的水凝胶基microtissues药物反应。

Acknowledgments

作者承认口腔医学院的在匹兹堡,健康奖K01 AR062598的国家机构,并授予P30 DE030740的大学的财政支持。作者还感谢金章博士为ICUE1质粒,韦恩Rasband开发的ImageJ和迈克尔Cammer为ImageJ的宏。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

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References

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FRET成像的三维水凝胶
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Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).More

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

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